Optimisation Fixation des mésenchymateuses humaines cellules souches sur Poly (ε-caprolactone) électrofilées Yarns

Dans cette procédure, les échafaudages PCL électrofilés sont configurés de différentes manières pour déterminer une configuration optimale d’ensemencement cellulaire. Tout d’abord, les échafaudages stériles sont placés dans les différentes configurations étudiées, y compris les inserts de culture cellulaire, les auges et les cuves rotatives du bioréacteur. Une fois en place, un nombre connu de cellules sont ensemencées sur l’échafaudage, puis laissées intactes pendant 20 minutes.

Ensuite, tous les échantillons sont soigneusement déplacés vers un incubateur, configurés à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius, et soumis à des conditions statiques ou dynamiques avant des heures. Après ce temps de culture, le nombre de cellules qui se sont attachées à l’échafaudage est déterminé par un test ADN pour quantifier la quantité de cellules dans le milieu de l’échafaudage et les fractions de puits. En fin de compte, cela est réalisé en quantifiant l’ADN présent sur l’échafaudage, le puits et dans les milieux environnants pour voir la fixation des cellules aux échafaudages.

Nous avons eu l’idée de cette enquête pour la première fois lorsque nous savions que nos échafaudages ne couvraient pas toute la base de la plaque de puits, ce qui signifiait qu’il était possible que toutes les cellules ne soient pas en contact avec l’échafaudage et donc capables de se fixer. Pour commencer, installez les inserts de culture cellulaire sous flux de lame en ouvrant les inserts de culture cellulaire stériles à six puits et en séparant les anneaux plus courts avec les dents des corps annelés plus larges. Ensuite, prenez l’anneau avec les dents pointant vers le haut et drapez l’un des échafaudages de quatre centimètres au centre de l’anneau, en vous assurant qu’il se chevauche des deux côtés.

Prenez le corps annelé et positionnez-le sur l’anneau de dent et l’échafaudage. Poussez ensuite vers le bas, en vous assurant que l’échafaudage reste en position et se trouve au centre de la culture cellulaire. Insérer. Placez l’insert de culture cellulaire avec l’échafaudage dans le puits d’une plaque de liaison basse à six puits et ajoutez 10 millilitres de milieu de culture à l’échafaudage.

Ensuite, placez les auges en polytétrafluoroéthylène dans des boîtes de Pétri individuelles et ajoutez 10 millilitres de milieu de culture dans l’auge. À l’aide d’une pince, drapez l’un des échafaudages de trois centimètres dans l’auge, en vous assurant que sa longueur est parallèle au bord le plus long de l’auge. Pour mettre en place la cuve du bioréacteur sous flux de lames, distribuez 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate stérile ou PBS à travers l’orifice principal de la cuve du bioréacteur.

Après 10 minutes, retirez le PBS et remplacez-le par huit millilitres de milieu de culture à l’aide d’une pince. Insérez l’un des échafaudages de trois centimètres dans le récipient par le port principal. Posez ensuite hors du port principal.

Après avoir effectué le comptage des cellules souches mésenchymateuses humaines comme décrit dans le protocole textuel, aspirez le milieu du tube de centrifugation en laissant la pastille cellulaire et remplacez-le par le volume de milieu calculé. Resus suspend les cellules et le milieu pour un mélange uniforme. À l’aide d’une pipette P 200, Gilson distribue lentement 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque échafaudage en passant la pointe de la pipette le long de la longueur de l’échafaudage et sous la surface du liquide du support.

Laissez sans être dérangé pendant 20 minutes, ou les cuves du bioréacteur distribuent 200 microlitres de suspension cellulaire par l’orifice principal. Complétez les deux millilitres restants de milieu de culture par les orifices de la seringue pour obtenir un volume total de 10 millilitres. Ensuite, transférez les cuves du bioréacteur dans le bioréacteur à cuve rotative et mettez-la en rotation.

À neuf tr/min, transférez les plaques de puits avec les inserts de culture cellulaire et les auges sur la plaque de l’agitateur et réglez-les pour tourner à 30 tr/min dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone ou la culture statique. Transférez les plaques de puits avec les inserts et les auges de culture cellulaire sur l’étagère d’un incubateur de culture cellulaire. Réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Après quatre heures, retirez les échantillons de l’incubateur et placez-les sous flux de lame. Ensuite, retirez les fractions de milieu de tous les échantillons et placez-les dans des tubes à centrifuger étiquetés séparément. Après une centrifugation pendant cinq minutes à 241 fois G, retirez le supinate avant d’ajouter trois millilitres de vortex tampon de lyse, la solution pour briser la pastille cellulaire les échafaudages maintenus dans les inserts de culture cellulaire Tout d’abord, libérez l’échafaudage en coupant l’échafaudage près du bord des inserts à l’aide d’un échafaudage.

Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez les échafaudages et placez-les dans des tubes à centrifuger contenant trois millilitres de tampon de lyse. Ajoutez ensuite trois millilitres de tampon de lyse dans chaque récipient d’échafaudage et raclez la surface. Retirez le tampon de lyse et placez-le dans des tubes à centrifuger étiquetés séparément.

Agitez chaque tube de centrifugation pendant environ une minute pour assurer une agitation suffisante et favoriser la lyse de la membrane cellulaire. Dans une plaque noire à 96 puits, ajoutez 100 microlitres de tampon de lyse pour chaque support d’échafaudage de fraction d’échantillon, puis bien puis dans l’obscurité, ajoutez 100 microlitres de solution d’ADN cellulaire à tous les puits contenant le tampon de lyse et mélangez. Incluez doucement les puits avec un tampon de lyse ne contenant pas d’ADN et une solution d’ADN cellulaire pour fournir un contrôle négatif et positif de la plaque de puits.

À l’aide d’un lecteur de plaques de fluorescence, mesurez l’absorbance des puits à 485 nanomètres d’excitation et 520 nanomètres d’émission. Comparez les données avec la courbe standard générée à partir des étalons d’ADN conformément aux instructions du fabricant pour effectuer la fixation MEB. Après quatre heures d’incubation, retirez tous les échafaudages de leurs réceptacles et placez-les dans des puits séparés d’une nouvelle plaque à six puits et d’un écoulement à lames.

Ensuite, lavez les échafaudages deux fois avec du PBS à chacun. Bien ajouter deux millilitres de glutaraldéhyde à 1,5 % dans du PBS pour assurer une couverture complète à l’échafaudage. Laissez la plaque pendant au moins 30 minutes à quatre degrés Celsius pour la fixation du celluloïd.

Retirez la solution fixatrice et lavez les échafaudages deux fois avec du PBS. Transférez ensuite les échafaudages sur une nouvelle plaque de puits pour les déshydrater avec des concentrations croissantes d’éthanol dans l’eau distillée, en commençant par 50 % d’éthanol, puis 70 %, puis 90 % pour chaque concentration. Immergez complètement les échafaudages dans la solution et laissez reposer trois minutes avant de jeter la solution et de répéter.

Une fois déshydratés les échafaudages dans de l’éthanol à 100 % en immergeant complètement les échafaudages dans la solution et en laissant reposer cinq minutes, jetez la solution et séchez chimiquement les échafaudages à plusieurs reprises. Utilisation du HMDS dans une sorbonne. Immergez les échafaudages dans le HMDS et laissez-les agir pendant cinq minutes avant de retirer le HMDS après avoir répété une fois.

Retirez le HMDS et laissez sécher les échafaudages. Ensuite, montez les échafaudages sur des talons de MEB disponibles dans le commerce pour faciliter la visualisation à l’intérieur de la couche MEB, les échantillons avec une couche de repérage d’or pendant deux minutes pour assurer une couverture mince et uniforme. Enfin, placez les échantillons dans le MEB et visualisez les échafaudages assis dans les cellules à l’aide d’un faisceau d’électrons de cinq kilos.

Les résultats mettent en évidence l’emplacement des cellules quatre heures après l’ensemencement pour chaque configuration expérimentale étudiée. Cette figure montre le pourcentage de cellules qui se sont fixées à la surface de l’échafaudage pendant cette période où toutes les configurations d’ensemencement ont été étudiées. Le pourcentage d’attachement des cellules est relativement faible, mais la plus grande adhérence cellulaire pour les échafaudages maintenus dans des inserts de culture cellulaire et secoués à 30 tr/min.

L’adhérence la plus faible concernait les échafaudages maintenus à l’intérieur des inserts de culture cellulaire et maintenus dans des conditions statiques. Un grand nombre de cellules étaient présentes dans la fraction du milieu, notamment pour la culture cellulaire. Les inserts maintenus dans des plaques de liaison basses à 50 % et des récipients rotatifs à 51 % Les échafaudages maintenus dans les auges ont montré un nombre élevé de cellules présentes dans le support lui-même.

48 % pour l’agitateur en auge et 50 % pour le balayage statique en auge. L’électromicroscopie a permis une évaluation visuelle des échafaudages ensemencés par cellules. Des images représentatives ont mis en évidence une présence limitée de cellules sur la surface fibreuse, quelle que soit la configuration de l’ensemencement.

Cependant, un plus grand nombre de cellules et d’agglomérats cellulaires étaient présents sur les échafaudages maintenus dans des inserts de culture cellulaire et secoués à 30 RP M.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez bien comprendre que l’ensemencement d’un nombre connu de cellules n’équivalait pas nécessairement à ce nombre de cellules réellement attachées à l’échafaudage, en particulier pour les échafaudages qui ne couvrent pas toute la base des plaques sauvages. Pour de tels échafaudages, il est recommandé d’optimiser d’abord différentes configurations d’ensemencement de cellules afin de maximiser l’attachement initial de la cellule à l’échafaudage.