Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

L’objectif de la procédure suivante est de quantifier rapidement et automatiquement les changements de morphologie cellulaire et la localisation subcellulaire de protéines d’intérêt spécifiques dans un grand nombre de cellules en réponse à un stimulus particulier. Ceci est accompli en stimulant d’abord les cellules T avec les types de chimiothérapie d’intérêt. Dans un deuxième temps, les cellules sont marquées par fluorescence puis analysées par cytométrie en flux d’imagerie.

Dans la dernière étape, le nombre de lymphocytes morphologiquement polarisés et le degré de ségrégation des marqueurs fluorescents peuvent être évalués en fonction de l’emplacement et de l’intensité des pixels pour chaque coloration, en fonction du masque choisi. En fin de compte, cette technologie de cytométrie en flux d’imagerie peut être utilisée pour quantifier rapidement et solidement les changements morphologiques des lymphocytes après la stimulation par chimiokine, ainsi que l’emplacement de protéines d’intérêt spécifiques dans les cellules polarisées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie est qu’un grand nombre de cellules peuvent être traitées de manière répétée et analysées automatiquement, ce qui garantit une analyse statistiquement solide des changements morphologiques et de la distribution des protéines.

Dans les lymphocytes T stimulés par la chimiokine, la stimulation de type des lymphocytes T commence par le lavage cinq fois centré des cinq cellules par condition expérimentale dans un HBSS chaud complété par 10 millimolaires HEPs centrifuge pendant cinq minutes à 340 fois G.At température ambiante, retire le supinate et remet les granulés en suspension dans 0,3 millilitre de HBSS chaud pièce par tube. Transférez ensuite les suspensions cellulaires dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre. Ajoutez 10 à 500 nanogrammes par millilitre de chimiokine dans chaque tube, puis retournez les tubes plusieurs fois pour mélanger.

Incuber les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après huit à 10 minutes, arrêtez la polarisation avec 0,3 millilitre de paraldéhyde chaud à 2 % complété par 10 millimolaires. Il fait des pois.

Ensuite, mélangez les tubes avec plus de retournement et incubez-les pendant encore cinq minutes à 37 degrés Celsius pour colorer les cellules pour l’analyse par immunofluorescence. Ensuite, transférez les lymphocytes T stimulés dans les tubes de cytométrie en flux correspondants. Remplissez complètement les tubes avec un tampon de coloration.

Ensuite, faites tourner les cellules et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de sérum de veau fœtal à 5 % dans du PBS. Ajoutez maintenant cinq microlitres de ZI N-T-H-L-A-A-B-C dans chaque tube. Vortexez-les et incubez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité à la fin de l’incubation.

Lavez les cellules deux fois, puis incubez-les dans 500 microlitres de 1 % de para formaldéhyde. Après 10 minutes, lavez les cellules dans un tampon de coloration supplémentaire, puis remplissez complètement les tubes avec un tampon de perméation. Après avoir lavé les cellules deux fois dans la perméation, le tampon a quitté les tubes pour éliminer le supinate, puis les vortex pour dissocier les granules cellulaires.

Maintenant, colorez les échantillons avec zéro point 25 microgrammes par millilitre, trixi pour la longe, vortex-les et incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Puis à la fin de la période d’incubation, lavez les cellules dans un tampon de perméation. Encore une fois, ressus.

Mettez les pastilles en suspension dans 200 microlitres de PBS, puis transférez les cellules dans des microtubes à centrifuger individuels pour déterminer le pourcentage de cellules T polarisées après stimulation par chimiokine. Allumez d’abord le cytomètre de flux d’imagerie et laissez-le se calibrer selon les instructions du fabricant. Dessinez des histogrammes qui quantifient les valeurs du gradient RMS à partir de la population ciblée sélectionnée sur le dégradé RMS.

L’histogramme délimite la population cellulaire unique sur un histogramme de la zone une fois que le microtube à centrifuger a été inséré dans la machine, ajuste la puissance laser sur les cellules individuelles et acquiert 5 000 lymphocytes T. Dans le logiciel d’analyse d’idées. Ouvrez les fichiers acquis, puis créez un histogramme montrant la valeur RMS du dégradé pour les images en fond clair obtenues pour chaque cellule individuelle, en dessinant une porte sur les cellules, présentant une valeur de dégradé RMS supérieure à 57.

Dans le menu d’analyse, créez un nouveau masque appelé érode M1 deux à partir du masque de morphologie sur les images en fond clair M zéro un érodé de deux pixels. Ensuite, dans le menu des entités d’analyse, créez une nouvelle caractéristique de l’aire calculée sur le masque érode M1 deux à partir des cellules créées dans la porte précédente. Ouvrez un histogramme montrant la surface des cellules À l’aide de ce masque nouvellement créé, tracez une porte sur les cellules T individuelles, à l’exclusion des billes de calibrage et des débris dans la petite zone, ainsi que des doublets dans la grande zone.

Ouvrez ensuite a. bot constitué du max brut sur la coloration H-L-A-A-A-B-C en fonction du pixel max brut sur la coloration Phin dans le menu des masques d’analyse en arrière vers le nouveau masque appelé éroder M deux deux du masque morphologique des cellules de coloration H-L-A-A-A-B-C érodées de deux pixels. Ensuite, dans le menu des fonctions d’analyse, créez une nouvelle caractéristique composée du paramètre de circularité calculé sur l’érosion M deux deux.

Créez ensuite un autre histogramme pour signaler les valeurs de la fonction de circularité à partir des cellules précédemment fermées. Ensuite, en regardant la forme de l’histogramme pour les cellules non stimulées, l’agate RO pour les cellules polarisées, en commençant par la valeur de circularité la plus basse jusqu’à la valeur limite de circularité où la plupart des cellules non stimulées sont tracées pour évaluer la polarisation de la coloration d’actine dans les cellules. Plus un histogramme pour la similitude des détails brillants, la valeur R trois pour comparer le H-L-A-A-B-C et le foid dans la coloration.

Ensuite, en utilisant la même stratégie de porte que celle qui vient d’être démontrée, plus un GA sur les cellules non stimulées pour la coloration ségréguée non co-localisée. Le panneau de statistiques montre le pourcentage de lymphocytes T avec coloration à actine polarisée ici. Des exemples de lymphocytes T stimulés par CCL 19 qui tombent dans la porte des cellules non polarisées ou polarisées sont présentés.

Les différences morphologiques entre les deux sous-populations sont clairement observées. La stratégie de déclenchement qui vient d’être démontrée peut également être utilisée pour tracer le pourcentage de cellules qui tombent dans la porte polarisée en l’absence de présence de CCL 19. Comme prévu, il est clair que la stimulation par chimiokine augmente le pourcentage de lymphocytes T polarisés.

L’indice de circularité moyen de l’ensemble de la population cellulaire obtenu dans les deux conditions peut également être tracé. En effet, la stimulation CCL 19 provoque une baisse de cet indice. Cependant, comme seulement la moitié des cellules sont polarisées, la variation de l’indice de circularité moyen observée lors de la stimulation CCL 19 est faible.

Dans cette expérience, les lymphocytes T ont été coupés en cot avec la GFP avec des plasmides codant pour les mutants négatifs dominants du complexe de polarité par six. PKC zêta. L’histogramme des cellules non transfectées a permis un contrôle spécifique pour les cellules T positives à la GFP pertinentes, indiquant que la trop petite fraction de la population cellulaire entière a été transfectée.

Le degré de polarisation morphologique de ces cellules transfectées a ensuite été quantifié en mesurant uniquement l’indice de circularité des cellules positives à la GFP et une démarche supplémentaire pour les cellules T. Présentant de faibles valeurs de circularité a été créé pour estimer le pourcentage de cellules polarisées dans chaque condition prise. L’ensemble de ces données démontre que la perturbation de la fonction de la voie de signalisation par six PK CZ inhibe la polarisation des lymphocytes T induite par les chimiokines CCL 19 et c Xcl 12.

Conformément aux constatations précédentes. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de toujours travailler à 37 degrés Celsius tout au long de l’étape de stimulation de la parenté d’insolution et de la fixation suivante pour assurer une polarisation morphologique forte et fiable des lymphocytes.