Name: Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse rapide et robuste de la polarisation cellulaire et moléculaire induite par des chimiokines chez les lymphocytes T. Cette technique utilise la cytométrie de flux d'imagerie pour quantifier automatiquement les changements morphologiques et la localisation protéique.

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Les auteurs remercient grandement Pierre Bourdoncle, Thomas et Louise Guilbert Rimbault du Fonds Cochin Imaging. Ce travail a été soutenu par l&#39;Inserm, le CNRS et la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe labellisée).

1. Préparation des lymphocytes T <ol><li> Préparer la souris primaire ou cellules T humaines comme décrit 10,11. </li><li> Cultiver les cellules T humaines dans un milieu complet RPMI avec 10% de sérum AB humain à une densité de 2-3 x 10 6 cellules / ml. NOTE: L&#39;utilisation de sérum de veau foetal (FCS) à la place du sérum humain peuvent induire la polarisation spontanée d&#39;une grande fraction de cellules T humaines en culture. Gardez ces cellules en culture pendant 4-5 jours, et autre processus à tout moment pendant cette période. </li><li> Maintenir les cellules T de souris dans du milieu RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS à une densité cellulaire similaire. Utilisez immédiatement ou le lendemain, après une culture O / N à 37 ° C en présence de 10 ng / ml IL7. </li><li> Cultiver la lignée cellulaire T humaine CEM dans RPMI complet supplémenté avec 10% de FCS. </li></ol> 2. Chemokine Stimulation <ol><li> Laver 5 x 10 5 cellules par condition expérimentale en milieu HBSS chaud complété avec 10 mM HEPEs. Pour certaines expériences, co-transfection de cellules T humaines primaires la veille avec 2 pg pmaxGFP et 8 pg pcDNA3.1 + (vecteur vide, contrôle), PKCÇ kinase morts, ou des plasmides PAR6 N-terminaux. </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans un milieu HBSS chaud-Hepes (utiliser 0,3 ml x nombre de conditions expérimentales). </li><li> Distribuez les cellules dans 1,5 ml microtubes. NOTE: En conséquence, un tube correspondant à une seule condition expérimentale contient 5 x 10 5 cellules dans 0,3 ml de milieu HBSS-HEPES. Pour certaines expériences, ajouter 500 nM Latrunculin A ou de véhicule (DMSO) et on incube les cellules pendant 30 min avant la stimulation de chimiokine. </li><li> Ajouter 10 à 500 ng / ml CCL19 ou chimiokine CXCL12 dans chaque tube. NOTE: Nous utilisons habituellement 10-200 chimiokine ng / ml pour les cellules T humaines. Cellules CEM ne expriment pas le récepteur CCR7 qui se lie CCL19. Par conséquent, les cellules CEM ne seront en mesure de répondre à une stimulation de CXCL12. En outre, utiliser des concentrations plus élevées de chimiokines (300-500 ng / ml) pour polariser les cellules T de souris. </li><li> Retourner les tubes à plusieurs reprises et les incuber dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 8 à 10 min ou de cellules T primaires ou CEM, respectivement. </li><li> Arrêter le processus de polarisation en ajoutant à chaque tube 0,3 ml d&#39;une solution chaude contenant 2% de paraformaldehyde (PFA) et Hepes 10 mM dans du PBS. Retourner les tubes et les incuber à 37 ° C pendant 5 min. </li></ol> 3. colorations <ol><li> Transférer les cellules des microtubes à la cytométrie en flux tubes. </li><li> Remplir les tubes avec une solution complètement RT contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), 0,5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de Hepes dans du PBS. </li><li> Centrifuger les tubes à 460 g pendant 4 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul d&#39;une solution contenant RT 5% de FCS dans du PBS. </li><li> Ajouter 5 ul de FITC-anti-HLA-ABC dans chaque tube, les vortex, et incuber pendant 30 min à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Laver les cellules une fois avec du PBS contenant 5% de FCS, unend fois avec du PBS seulement. </li><li> A RT: ajouter 500 ul de 1% de PFA, incuber pendant 10 min, puis laver les cellules avec une solution contenant 1% de BSA, 0,5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de HEPES dans du PBS. </li><li> Jeter le surnageant, complètement remplir les tubes avec une solution de PBS contenant 0,2% de BSA, 0,1% de saponine, 0,5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de Hepes (tampon de perméabilisation). </li><li> Laver les cellules deux fois dans ce milieu. </li><li> Retourner les tubes pour éliminer le milieu et Vortex les dissocier le culot cellulaire. </li><li> Ajouter 0,25 ug / ml TRITC-phalloïdine et / ou une dilution 1: 100 d&#39;anticorps anti-P-ERM à chaque tube, les vortex et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec le tampon de perméabilisation. Incuber avec un anticorps secondaire fluorescent si nécessaire. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS et les transférer à des microtubes. REMARQUE: Les cellules sont prêts pour l&#39;acquisition. Sinon, tout en gardant un volume total maximal de 200 pi par tube, ajouter concentré PFA à une finale 1%concentration afin de préserver les colorations si les cellules ne sont pas à utiliser le même jour pour un traitement ultérieur. </li></ol> 4. Images acquisition et d&#39;analyse <ol><li> Allumer l&#39;appareil (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) et laissez-le se calibrer selon les instructions du fabricant. REMARQUE: Le logiciel INSPIRE été utilisé avec un objectif 40X (0,75 NA). Le logiciel IDEAS 3.0 a été utilisé pour tous les quantifications signalés. </li><li> Préparer une série de fenêtres d&#39;acquisition qui peuvent être sauvegardés dans un modèle pour de futures expériences. Dessinez histogrammes qui quantifient les valeurs de gradient de RMS. De la population &quot;In Focus&quot;, sélectionnés sur les RMS de l&#39;histogramme gradient, délimiter la population &quot;cellule unique&quot; sur un histogramme de la zone. Une fois que le tube de microcentrifugation a été inséré dans la machine, régler la puissance du laser, porte sur des cellules individuelles et d&#39;acquérir des lymphocytes T 5000. </li><li> Dans les idées molleslogiciel, ouvrez le fichier d&#39;acquisition et de créer un histogramme qui indique la valeur de la valeur RMS de gradient pour les images de champ lumineux (canal 1) obtenu pour chaque cellule individuelle. Dessinez une grille sur le gradient histogramme RMS qui considère cellules présentant RMS valeur gradient ci-dessus 57. NOTE: Le gradient RMS permet de prendre en compte dans l&#39;analyse uniquement les lymphocytes T qui sont dans le plan focal. Nous avons déterminé de manière empirique que les cellules individuelles présentant une valeur de gradient supérieure à RMS 57 sont dans le plan focal, et peuvent être considérés de façon précise. </li><li> Dans le / menu Analyse des Masques, créer un nouveau masque, appelé Erode (M01,2) du masque de la morphologie sur les images en fond clair M01, érodés de 2 pixels. Puis, dans l&#39;Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonctionnalité de la zone, calculé sur le masque Erode (M01,2). A partir des cellules sélectionnées dans la grille précédente, ouvrir un histogramme montrant la zone de cellules à l&#39;aide de ce masque nouvellement créé. La morphologie des masques qui sont disponibles par: NOTEdéfaut sont beaucoup plus grande que la taille réelle de la cellule. Ainsi, il est plus précis de l&#39;éroder jusqu&#39;à deux pixels. </li><li> Dessinez une porte sur les cellules T individuelles, à l&#39;exception des billes de calibration et de débris (petite zone) et les doublets (grande surface). Réglez cette porte à chaque acquisition. REMARQUE: Les variations de la taille des cellules auront une incidence sur la position de la porte. Comme les cellules T de souris sont plus petites que les cellules T humaines qui sont eux-mêmes plus petites que les cellules CEM, la surface de chaque type de cellule est proportionnelle à sa taille. </li><li> Considérant les cellules individuelles, de mise au point qui ont été fermée dans les étapes précédentes, ouvrez une parcelle points constituée de la Raw Max Pixel sur la coloration HLA-ABC (canal 2, axe des x) en fonction de la Raw Max Pixel sur la phalloïdine coloration (Channel 4, axe y). Créer un portail d&#39;exclure les événements fluorescentes non colorées ou saturés. Ouvrez deux histogrammes montrant la Raw Max Pixel pour HLA-ABC (canal 2) et phalloïdine (Channel 4) colorations. </li><li> Dans l&#39;analyse / menu Masques, createa nouveau masque, appelé Erode (M02,2) du masque de la morphologie des cellules HLA-ABC colorées (canal 2), érodés de 2 pixels. Puis, dans l&#39;Analyse / menu Fonctions, créer une nouvelle fonction consistant en le paramètre de circularité, calculé sur la Erode (M02,2). NOTE: Ce paramètre mesure la déviation de la forme de la cellule d&#39;un cercle. Par conséquent, une cellule T parfaitement ronde aura une valeur de circularité élevée tandis que les cellules polarisées allongés présentera un indice de circularité bas. </li><li> Par la suite, créer un autre histogramme qui rendra compte les valeurs de la fonction de circularité des cellules précédemment gated. Utilisez cet histogramme pour tracer directement la distribution d&#39;un individu, la population cellulaire de mise au point selon la valeur de la circularité de chaque cellule individuelle. </li><li> Au vu de la forme de l&#39;histogramme pour les cellules non stimulées, tracer une grille de cellules polarisées, à partir de la valeur de circularité la plus basse jusqu&#39;à la valeur limite de circularité où la plupart des cellules non stimuléessont tracées. Regardez l&#39;affichage des statistiques pour le pourcentage de cellules polarisées parmi la population fermée (Gated%). NOTE: Nous avons mis cette porte pour les valeurs de l&#39;indice circularité ci-dessous 13. </li><li> Afin de regarder la polarisation de la coloration de l&#39;actine dans les cellules, tracer un histogramme pour la Détail Lumineux valeur similarité R3, comparant la coloration HLA-ABC (canal 2) et la coloration de la phalloïdine (Channel 4). NOTE: Plus la valeur de cette fonction, plus superpose les deux colorations sont. </li><li> En utilisant la même stratégie de déclenchement comme précédemment, tracer une grille sur des cellules non stimulées pour la coloration distinct qui montre le pourcentage de cellules présentant une coloration de l&#39;actine polarisée. </li><li> Une fois terminé, le pourcentage de cellules présentant une ségrégation dans la distribution du CMH de classe I et de colorations phalloïdine, le pourcentage de cellules polarisées ainsi que les valeurs moyennes des indices circularité et la similitude de toutes les cellules ± SD sont présentés dans l&#39;correspStatistiques onding panneaux. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Grâce à une technologie récente des flux d&#39;imagerie de cytométrie une stratégie rapide et informative déclenchement d&#39;analyser des événements cellulaires et moléculaires induits par la stimulation de la chimiokine est présenté. A partir d&#39;une seule expérience, on peut obtenir deux types d&#39;informations: les changements dans la morphologie cellulaire induites par stimulation de la chimiokine et la distribution subcellulaire de protéines différentes pendant le processus de polarisation. Fait intéressant, la...

Les chimiokines sont de petites protéines solubles qui attirent les cellules à des endroits spécialisés 1. Par conséquent, ils participent au positionnement correct de cellules dans les tissus, un rôle crucial dans le développement et la physiologie. Le système immunitaire ne fait pas exception à cette règle car il repose sur l&#39;action de nombreux différents types de cellules qui agissent de concert pour monter une réponse immunitaire efficace. En contrôlant la localisation spécifique d&#39;un type de cellule immunitaire dans un état donné, les chimiokines sont des pré-requis avant antigènes étrangers peuvent être détectés et neutralisés. Dans les lymphocytes T en particulier, les chimiokines se lient à des récepteurs spécifiques de surface qui, lors de l&#39;engagement, suscitent de nombreux signaux intracellulaires (élévation du calcium, la phosphorylation de ERK, activation GTPases Rho, augmentation des intégrines affinité et altérations du cytosquelette) qui favorisent motilité des cellules T 2,3. Au niveau cellulaire, on peut observer des altérations morphologiques induites par stimulation de chimiokine.Ces changements dans les formes cellulaires sont particulièrement dramatique dans les cellules T: les cellules T au repos ont une morphologie ronde bourrelet lorsque vous voyagez dans le flux sanguin. Cependant, la détection de la présence de chimiokines dans les sites inflammatoires ou à proximité des organes lymphoïdes va changer la forme des cellules T qui adoptent désormais une «main-miroir» morphologie typique composé d&#39;une forme bipolaire: un bord d&#39;attaque à l&#39;avant et un bord arrière, ou uropode, 4 à l&#39;arrière. En outre, les composants intracellulaires peuvent séparer dans ces deux régions opposées d&#39;une cellule T de polarisation pour maintenir la migration. Par exemple, les filaments d&#39;actine polymérisation augmente lors d&#39;une stimulation de chimiokine 5 actine polymérisée et se accumule à l&#39;avant d&#39;une cellule polarisée T 2. D&#39;autre part, plusieurs protéines telles que les protéines phosphorylées de la famille Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) qui relient la membrane plasmique au cytosquelette d&#39;actine corticale, relocaliser au uropode de polarisationLes cellules T 6. Fait intéressant, nous et d&#39;autres avons montré que ce processus de polarisation est nécessaire pour la migration des cellules T. En effet, un traitement qui interfère avec la polarisation va inhiber la motilité cellulaire. Par exemple, l&#39;inhibition de l&#39;activité des membres de la protéine atypique kinases C (PKC) famille, PKCÇ et PKCι blocs T polarisation de la cellule et le processus de balayage de migration des cellules dendritiques 7. T polarisation cellulaire est également réglementée par GTPases Rho. Nous avons montré que la modulation de l&#39;activité de la protéine RhoA par Fam65b récemment décrit interfère avec les changements de cellules T de la morphologie et de leur capacité à migrer dans un dosage 6 Transwell. Comme polarisation est une étape préalable à la motilité cellulaire, il est donc crucial d&#39;être en mesure de quantifier comme un indicateur principal de réponses de chimiokines. modifications de la forme des cellules ont déjà été mesurés manuellement 8. Cependant, ce type de dosage est très chronophage, de sorte que seuls quelques-uns habituellementdizaines de cellules sont prises en compte. Ici, une nouvelle méthode est présentée à quantifier rapidement le degré de modifications de forme de lymphocytes T exposés à la chimiokine stimulation. Un flux d&#39;imagerie de cytométrie la technologie (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement) est utilisée, qui combine les avantages d&#39;un cytomètre de flux et un microscope neuf pour quantifier efficacement la quantité de cellules polarisées dans différentes conditions de stimulation de chimiokine. En plus de la quantification des altérations morphologiques que l&#39;on peut mesurer robuste avec cette technologie, il est également possible d&#39;évaluer les changements dans la localisation subcellulaire de certaines protéines de chimiokine sur la signalisation.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Sérum humain AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Préchauffer pour inactiver le complément.</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Préchauffer pour inactiver le complément.</td></tr><tr><td>Kit de nucléofacteurs de cellules T humaines</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td> Les <td>aliquotes sont décongelées sur de la glace avant d’ajouter la chimiokine aux cellules.</td></tr><tr>Les aliquotes <td>humaines CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>sont décongelées sur de la glace avant d’être ajoutées à la chimiokine dans les cellules.</td></tr><tr>Les aliquotes <td>humaines CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>sont décongelées sur de la glace avant d’être ajoutées à la chimiokine dans les cellules. Cette chimiokine peut également être utilisée sur les lymphocytes T de souris.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>Il s’agit d’une solution de PFA à 8 % dans l’eau. Mélanger volume à volume avec 2x PBS pour obtenir une solution de PFA à 4 % dans du PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloïdine</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps FITC-anti-HLA-ABC</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anticorps anti-P-ERM</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStreamx Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Les cellules répondent à la stimulation par la chimiokine perdre leur forme ronde dans un processus appelé polarisation, et en modifiant la localisation subcellulaire de nombreuses protéines. Techniques d&#39;imagerie classiques ont été utilisées pour étudier ces phénomènes. Cependant, ils doivent l&#39;acquisition manuelle de nombreuses cellules, suivie par une quantification du temps de la morphologie et de la co-localisation de la coloration de plusieurs dizaines de cellules. Ici, un procédé rapide et puissant est décrit à étudier ces phénomènes sur des échantillons constitués de plusieurs milliers de cellules en utilisant une cytométrie en flux de la technologie de formation d&#39;image qui combine les avantages d&#39;un microscope à celles d&#39;un cytomètre. Utilisation de lymphocytes T stimulés avec CCL19 et coloration pour les molécules MHC de classe I et de l&#39;actine filamenteuse, une stratégie de déclenchement est présenté simultanément à mesurer le degré de modifications de forme et l&#39;étendue de la co-localisation de marqueurs qui sont affectés par la signalisation de CCL19. En outre, cette stratégie de porte nous a permis de OBSERVe la séparation de l&#39;actine filamenteuse (à l&#39;avant) et phosphorylée Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) protéines (à l&#39;arrière) dans les cellules T polarisées après CXCL12 stimulation. Cette technique est également utile pour observer l&#39;effet de blocage sur la polarisation de deux éléments différents: l&#39;inhibition de la polymérisation de l&#39;actine par un inhibiteur pharmacologique et l&#39;expression de mutants de la / voie de signalisation de la PKC atypique PAR6. Ainsi, la preuve montre que cette technique est utile d&#39;analyser les altérations morphologiques et redistributions de protéines.

Le premier exemple choisi ici concerne l'utilisation de lymphocytes T primaires humains stimulés avec CCL19. Cependant, la même stratégie peut être utilisée avec des cellules T de souris primaires, des lignées de cellules T ou tout autre type sensible à la stimulation de chimiokine sur les cellules. La stratégie présentée ici de déclenchement comprend une série de fenêtres qui sélectionnent les événements ciblés, puis les cellules individuelles. Enfin la plage d'intensité de fluorescence est suivie ici à titre d'exemple...

La signalisation des chimiokines provoque des altérations marquées de la morphologie cellulaire et certaines redistributions importantes des protéines intracellulaires. Ici, un protocole rapide et détaillé est fourni pour étudier ces événements.

Analyse rapide et robuste de cellulaire et moléculaire de polarisation induite par des chimiokines de signalisation

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

L’objectif de la procédure suivante est de quantifier rapidement et automatiquement les changements de morphologie cellulaire et la localisation subcellulaire de protéines d’intérêt spécifiques dans un grand nombre de cellules en réponse à un stimulus particulier. Ceci est accompli en stimulant d’abord les cellules T avec les types de chimiothérapie d’intérêt. Dans un deuxième temps, les cellules sont marquées par fluorescence puis analysées par cytométrie en flux d’imagerie.Dans la dernière étape, le nombre de lymphocytes morphologiquement polarisés et le degré de ségrégation des marqueurs fluorescents peuvent être évalués en fonction de l’emplacement et de l’intensité des pixels pour chaque coloration, en fonction du masque choisi. En fin de compte, cette technologie de cytométrie en flux d’imagerie peut être utilisée pour quantifier rapidement et solidement les changements morphologiques des lymphocytes après la stimulation par chimiokine, ainsi que l’emplacement de protéines d’intérêt spécifiques dans les cellules polarisées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie est qu’un grand nombre de cellules peuvent être traitées de manière répétée et analysées automatiquement, ce qui garantit une analyse statistiquement solide des changements morphologiques et de la distribution des protéines.Dans les lymphocytes T stimulés par la chimiokine, la stimulation de type des lymphocytes T commence par le lavage cinq fois centré des cinq cellules par condition expérimentale dans un HBSS chaud complété par 10 millimolaires HEPs centrifuge pendant cinq minutes à 340 fois G.At température ambiante, retire le supinate et remet les granulés en suspension dans 0,3 millilitre de HBSS chaud pièce par tube. Transférez ensuite les suspensions cellulaires dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre. Ajoutez 10 à 500 nanogrammes par millilitre de chimiokine dans chaque tube, puis retournez les tubes plusieurs fois pour mélanger.Incuber les cellules dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après huit à 10 minutes, arrêtez la polarisation avec 0,3 millilitre de paraldéhyde chaud à 2 % complété par 10 millimolaires. Il fait des pois.Ensuite, mélangez les tubes avec plus de retournement et incubez-les pendant encore cinq minutes à 37 degrés Celsius pour colorer les cellules pour l’analyse par immunofluorescence. Ensuite, transférez les lymphocytes T stimulés dans les tubes de cytométrie en flux correspondants. Remplissez complètement les tubes avec un tampon de coloration.Ensuite, faites tourner les cellules et remettez les granulés en suspension dans 100 microlitres de sérum de veau fœtal à 5 % dans du PBS. Ajoutez maintenant cinq microlitres de ZI N-T-H-L-A-A-B-C dans chaque tube. Vortexez-les et incubez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité à la fin de l’incubation.Lavez les cellules deux fois, puis incubez-les dans 500 microlitres de 1 % de para formaldéhyde. Après 10 minutes, lavez les cellules dans un tampon de coloration supplémentaire, puis remplissez complètement les tubes avec un tampon de perméation. Après avoir lavé les cellules deux fois dans la perméation, le tampon a quitté les tubes pour éliminer le supinate, puis les vortex pour dissocier les granules cellulaires.Maintenant, colorez les échantillons avec zéro point 25 microgrammes par millilitre, trixi pour la longe, vortex-les et incubez pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Puis à la fin de la période d’incubation, lavez les cellules dans un tampon de perméation. Encore une fois, ressus.Mettez les pastilles en suspension dans 200 microlitres de PBS, puis transférez les cellules dans des microtubes à centrifuger individuels pour déterminer le pourcentage de cellules T polarisées après stimulation par chimiokine. Allumez d’abord le cytomètre de flux d’imagerie et laissez-le se calibrer selon les instructions du fabricant. Dessinez des histogrammes qui quantifient les valeurs du gradient RMS à partir de la population ciblée sélectionnée sur le dégradé RMS.L’histogramme délimite la population cellulaire unique sur un histogramme de la zone une fois que le microtube à centrifuger a été inséré dans la machine, ajuste la puissance laser sur les cellules individuelles et acquiert 5 000 lymphocytes T. Dans le logiciel d’analyse d’idées. Ouvrez les fichiers acquis, puis créez un histogramme montrant la valeur RMS du dégradé pour les images en fond clair obtenues pour chaque cellule individuelle, en dessinant une porte sur les cellules, présentant une valeur de dégradé RMS supérieure à 57.Dans le menu d’analyse, créez un nouveau masque appelé érode M1 deux à partir du masque de morphologie sur les images en fond clair M zéro un érodé de deux pixels. Ensuite, dans le menu des entités d’analyse, créez une nouvelle caractéristique de l’aire calculée sur le masque érode M1 deux à partir des cellules créées dans la porte précédente. Ouvrez un histogramme montrant la surface des cellules À l’aide de ce masque nouvellement créé, tracez une porte sur les cellules T individuelles, à l’exclusion des billes de calibrage et des débris dans la petite zone, ainsi que des doublets dans la grande zone.Ouvrez ensuite a. bot constitué du max brut sur la coloration H-L-A-A-A-B-C en fonction du pixel max brut sur la coloration Phin dans le menu des masques d’analyse en arrière vers le nouveau masque appelé éroder M deux deux du masque morphologique des cellules de coloration H-L-A-A-A-B-C érodées de deux pixels. Ensuite, dans le menu des fonctions d’analyse, créez une nouvelle caractéristique composée du paramètre de circularité calculé sur l’érosion M deux deux.Créez ensuite un autre histogramme pour signaler les valeurs de la fonction de circularité à partir des cellules précédemment fermées. Ensuite, en regardant la forme de l’histogramme pour les cellules non stimulées, l’agate RO pour les cellules polarisées, en commençant par la valeur de circularité la plus basse jusqu’à la valeur limite de circularité où la plupart des cellules non stimulées sont tracées pour évaluer la polarisation de la coloration d’actine dans les cellules. Plus un histogramme pour la similitude des détails brillants, la valeur R trois pour comparer le H-L-A-A-B-C et le foid dans la coloration.Ensuite, en utilisant la même stratégie de porte que celle qui vient d’être démontrée, plus un GA sur les cellules non stimulées pour la coloration ségréguée non co-localisée. Le panneau de statistiques montre le pourcentage de lymphocytes T avec coloration à actine polarisée ici. Des exemples de lymphocytes T stimulés par CCL 19 qui tombent dans la porte des cellules non polarisées ou polarisées sont présentés.Les différences morphologiques entre les deux sous-populations sont clairement observées. La stratégie de déclenchement qui vient d’être démontrée peut également être utilisée pour tracer le pourcentage de cellules qui tombent dans la porte polarisée en l’absence de présence de CCL 19. Comme prévu, il est clair que la stimulation par chimiokine augmente le pourcentage de lymphocytes T polarisés.L’indice de circularité moyen de l’ensemble de la population cellulaire obtenu dans les deux conditions peut également être tracé. En effet, la stimulation CCL 19 provoque une baisse de cet indice. Cependant, comme seulement la moitié des cellules sont polarisées, la variation de l’indice de circularité moyen observée lors de la stimulation CCL 19 est faible.Dans cette expérience, les lymphocytes T ont été coupés en cot avec la GFP avec des plasmides codant pour les mutants négatifs dominants du complexe de polarité par six. PKC zêta. L’histogramme des cellules non transfectées a permis un contrôle spécifique pour les cellules T positives à la GFP pertinentes, indiquant que la trop petite fraction de la population cellulaire entière a été transfectée.Le degré de polarisation morphologique de ces cellules transfectées a ensuite été quantifié en mesurant uniquement l’indice de circularité des cellules positives à la GFP et une démarche supplémentaire pour les cellules T. Présentant de faibles valeurs de circularité a été créé pour estimer le pourcentage de cellules polarisées dans chaque condition prise. L’ensemble de ces données démontre que la perturbation de la fonction de la voie de signalisation par six PK CZ inhibe la polarisation des lymphocytes T induite par les chimiokines CCL 19 et c Xcl 12.Conformément aux constatations précédentes. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de toujours travailler à 37 degrés Celsius tout au long de l’étape de stimulation de la parenté d’insolution et de la fixation suivante pour assurer une polarisation morphologique forte et fiable des lymphocytes.

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