Name: Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Découvrez la transplantation de cellules souches neurales dans un modèle de contusion de la moelle épinière chez la souris. Cette méthode permet d'étudier la régénération nerveuse et le devenir des cellules greffées.

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Les auteurs remercient la FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), la Fondation « Neurogel-en-Marche » (France), la Fondazione « La Colonna ».

NOTE: Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d&#39;examen de l&#39;Université de Milan et ont rencontré les directeurs italiens pour les animaux de laboratoire en conformité avec la directive européenne du Communautés Novembre 1986 (86/609 / CEE). 1. Préparation des cellules destinés à la transplantation REMARQUE: utiliser des cellules souches neurales entre le 5e et le 9e passage en culture de ces expériences; tester les cultures pour la prolifération et la capacité de différenciation avant d&#39;être marqué pour la transplantation. Déterminer le degré de différenciation par immunocytochimie 12. <ol><li> Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10 6 cellules / 150 ul (1 transplantation x 10 6 cellules par souris). Préparer au moins 1,2 x 10 6 cellules par souris, car un excès de cellules est nécessaire à des fins seringue de chargement. </li><li> Laver les cellules trois fois en utilisant un milieu de cellules souches neurales 13 dans une fiole conique de 10 ml. Dans chaqueétape de lavage, les cellules précipitées par centrifugation (500 g pendant 5 min, RT). </li><li> Compter les cellules avant l&#39;essorage final. </li><li> Centrifuger les cellules (500 g pendant 5 min), puis aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas enlever les cellules, mais ne laissant pas plus de 25 pi de surnageant. </li><li> Préparer une suspension de cellules 2x par addition de 1 ml de diluant C au culot de cellules et remettre en suspension avec pipetage doux. </li><li> Immédiatement avant la coloration, préparer une solution de colorant 2x (4 x 10-6 M) dans le diluant C par addition de 4 ul de la solution de colorant PKH26 d&#39;éthanol à 1 ml de diluant C dans un tube et mélangez bien se disperser. </li><li> Ajoutez rapidement les 1 ml de 2x suspension de cellules à 1 ml de 2x Dye Solution et immédiatement mélanger l&#39;échantillon par pipetage (densité cellulaire finale sera 1,2 x 10 7 cellules / ml et 2 x 10-6 M PKH26). </li><li> Incuber la suspension de cellules / colorant 1-5 min. </li><li> Arrêter la coloration par addition d&#39;un volume égal (2ml) de solution de BSA à 1% dans du HBSS et incuber pendant 1 min. </li><li> Centrifuger les cellules (500 g pendant 10 min) et retirer délicatement le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml de HBSS et centrifugation (500 g pendant 5 min). </li><li> Laver le culot de cellules deux fois de plus avec 10 ml de milieu complet pour assurer l&#39;élimination de colorant non fixé. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu complet à l&#39;évaluation de la récupération des cellules, la viabilité des cellules et l&#39;intensité de fluorescence. Si les cellules sont nécessaires pour la transplantation, laver et remettre en suspension dans une solution physiologique stérile à une concentration de 3,3 x 10 5 cellules / 50 ul. </li></ol> 2. Préparation pour l&#39;intervention <ol><li> Équipements de chirurgie nettoyer et stériliser. </li><li> Préparer la zone de la chirurgie en essuyant avec un agent aseptique. Mettre en place le dispositif IH Impactor. </li><li> Préparer le matériel d&#39;anesthésie: le trésor de gaz actif avec VetScav Pesage du filtre de périphérique, flux continu Chambre induction, Gene d&#39;oxygènerateur, faible débit O 2 mètres pour les souris. Nettoyer la chambre d&#39;induction et le masque utilisé pendant la chirurgie. </li><li> Anesthésier animaux avec 2,5% (v / v) l&#39;isoflurane en oxygène (1 L / min), et attendre 5 min après l&#39;induction de l&#39;écoulement de la drogue prenne effet. Vérifiez si les moustaches sont des contractions musculaires ou se il est lent retrait des membres postérieurs en réponse à pincer le coussinet plantaire. Au cours de la chirurgie, de réduire la concentration d&#39;isoflurane à 2,0% (v / v) d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène (1 litre / min). </li></ol> 3. Préparation de souris pour la chirurgie et la transplantation <ol><li> Gardez le mâle adulte CD1 souris (25-30 g) pendant au moins trois jours avant les expériences dans des conditions standard (22 ± 2 ° C, 65% d&#39;humidité et de lumière artificielle entre 08h00-20h00). NOTE: L&#39;ensemble de la procédure de la préparation chirurgicale pour suture prendra environ 40 minutes. <ol><li> Pour identifier l&#39;animal, marquer la queue au moyen d&#39;eau encre de couleur résistante. </li></ol></li><li> Utilisez un électric tondeuse pour couper les cheveux dorsale de la souris à partir du col, environ au niveau de T2, de la région lombaire. </li><li> Stériliser la zone préparée avec une solution d&#39;iodure et de l&#39;éthanol (70% dans l&#39;eau stérile). </li><li> Traiter l&#39;animal avec un sous cutanée (sc) injection de 200 ul de la gentamycine (1 mg / ml dans une solution saline stérile). </li><li> Appliquer du lubrifiant ophtalmique aux deux yeux d&#39;animaux pour éviter la dessiccation et injecter de la buprénorphine (sous-cutanée, 0,03 mg / kg) pour soulager la douleur. </li></ol> 4. laminectomie <ol><li> Passer la souris sur une plus chaud de glissement pour éviter le problème de l&#39;hypothermie pendant la chirurgie. Placez l&#39;animal avec la dorsale vers le haut. </li><li> Faire une incision verticale avec un scalpel sur la région d&#39;intérêt, à partir de T7 à T12. </li><li> Maintenez la peau et un tampon de graisse superficielle en utilisant une pince standards (généralement situé dans l&#39;espace entre la 5 ème et 6 ème processus dorsales thoraciques). </li><li> Comptez le processus sous le navire comme T6puis passer à T7. </li><li> Placer un peu d&#39;incidence sous la face ventrale de la souris pour augmenter la courbure de la colonne vertébrale. Immobiliser la moelle épinière en le bloquant avec la pince Graefe. </li><li> Couper les muscles paravertébraux bilatéralement à partir de T7 et T10 niveau vertébral en utilisant le scalpel jusqu&#39;à ce que la surface dorsale des contacts de la lamina de pointe de scalpel. </li><li> Utilisez le scalpel pour cocher la jonction de T7 jusqu&#39;à T10. Arrêtez-vous dans l&#39;espace entre T8 et T9 saillies épineuses. Couper les tissus entre T8-T9 et T9-T10 avec les ciseaux micro. <ol><li> Utilisez le Rongeur de retirer le processus de T9. Exposer la jonction par attentivement raclant la couche musculaire avec les ciseaux micro. Continuez jusqu&#39;à ce que l&#39;os est exposé. </li></ol></li><li> Utilisez la pince pour retirer les muscles de la lamina et ouvrir un petit espace entre les vertèbres. Insérez délicatement les ciseaux micro sous l&#39;os, couper la lame sur les deux côtés et enlever cette partie avec une pince. </li><li> Retirez la lame avec le forceps pour exposer le cordon. Veillez à ne pas laisser des fragments d&#39;os gratuits ou déchiquetés derrière; retirez-les avec le Rongeur. </li><li> Utilisez les petites pinces d&#39;extrémité pour retirer le périoste ainsi que les fragments d&#39;os ou des muscles qui peuvent être près de l&#39;incision. </li><li> Retirer la moitié supérieure du processus de dorsale T9 et procéder au protocole de l&#39;appareil IH Impactor. </li></ol> 5. Protocole de périphériques IH Impactor (contusion) <ol><li> Placer la souris dans le milieu de la plate-forme de stabilisation de l&#39;appareil impacteur IH. </li><li> Bloquer l&#39;animal avec les deux dents des pinces liées à la plate-forme de stabilisation par deux bras de positionnement commun (bras gauche de la vertèbre thoracique, le bras droit pour vertèbre cervicale). </li><li> Utilisez le bras rostrale à saisir le bord latéral du corps vertébral rostrale (T8). </li><li> Manipuler le bras caudale de la même manière à saisir le corps vertébral de T10. </li><li> Placez la plate-forme de stabilisation dans l&#39;appareil et réduire la pointe (diamètre 0,75mm) aussi près que possible le câble sans le toucher. </li><li> Soulevez la pointe trois tours complets avant de lancer l&#39;impact. </li><li> Effectuer la contusion avec l&#39;impacteur réglé pour fournir une force de 60 à 100 mm Kdyn / sec. </li></ol> 6. Les sutures et les soins post- <ol><li> Suturer l&#39;incision avec un fil de suture absorbable 4/0. Couvrir la moelle épinière exposée à l&#39;endroit de la lame enlevée; suturer le tissu aux extrémités de la coupe au moyen d&#39;une petite aiguille. Mettre les deux points ci-dessus et immédiatement sous le site de l&#39;exposition de la moelle épinière. </li><li> Fermez la peau à l&#39;aide de deux ou trois clips Reflex sans pincement au large des muscles sous-jacents. </li><li> Hydrater le post-opératoire de la souris avec 2 ml de solution saline injection sous-cutanée dans le bas du dos. </li><li> Placez la souris dans une cage retour préchauffé pour éviter l&#39;hypothermie pendant la reprise chirurgicale. La place des cages sur des coussins chauffants. </li><li> Surveiller les souris au cours de la post-traumatique de la phase aiguë en cochant lataille de la vessie, le fil de suture et le poids de l&#39;animal deux fois par jour. Pressez délicatement la vessie (deux fois par jour pendant 7 jours) pour éviter les infections (l&#39;urine pourrait être nuageux, sanglante ou contenant des précipités) de l&#39;appareil urinaire. </li><li> Traiter les souris une fois par jour avec une injection de solution saline (2 ml pendant deux jours d&#39;injection sc post-chirurgie) et antibiotique (gentamicine 0,2 ml; injection sc) pendant cinq jours après la lésion. </li><li> Traiter les souris pour l&#39;analgésie post-opératoire avec la buprénorphine (0,1 mg / kg; deux fois par jour) pendant 3 jours après la lésion. </li></ol> 7. veine caudale injection de cellules REMARQUE: Dans l&#39;étape suivante de la procédure de l&#39;injection des cellules dans la veine caudale est démontrée. Les cellules peuvent également être administrés avec une greffe intraspinale en utilisant un cadre stéréotaxique 15 à 16, ou dans la cisterna magna 17. Il est important de noter que d&#39;autres types de cellules ont pu être transplantées avec ce procédé, telles que les cellules stromales mésenchymales(par exemple, des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, des cellules souches d&#39;origine adipeuse, des cellules de liquide amniotique). En outre, d&#39;autres options de traitement telles que les nanoparticules peuvent être injectés dans la veine caudale après la blessure de la moelle épinière. <ol><li> Utilisez 70% d&#39;éthanol et PBS pour nettoyer l&#39;aiguille avant utilisation. Manipulez l&#39;aiguille et la seringue uniquement avec des gants stériles. </li><li> Resuspendre les cellules dans le tube et la charge 75 pi de cellules de test dans une seringue 0,3 ml (29 aiguille G et 0,33 cc seringue). </li><li> Assurez-vous qu&#39;aucun des bulles sont présentes au sein de la suspension cellulaire. Conserver la seringue en position horizontale pour éviter la sédimentation des cellules. </li><li> Placez la souris sous la lampe chauffante pour dilater les veines de la queue. </li><li> Prenez la souris et tirez-le doucement dans le dispositif de retenue de la souris pour visualiser la veine de la queue latérale par une ligne bleue étroite. </li><li> Nettoyez la queue avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Une fois la veine est visualisée, saisir la veine de la queue entre le majeur et le pouce de la main gauche. </li><li> Apportez de l&#39;aiguille à la surface à un angle de 15 ° de l&#39;horizon et se assurer que le biseau est écoulé. </li><li> Injecter 50 ul de cellules à un débit de 0,33 pl / s. Après l&#39;injection, retarder le retrait de l&#39;aiguille de 10 sec. Rétracter l&#39;aiguille lentement et prêter attention à la possible efflux de suspension cellulaire. </li><li> Nettoyez la seringue comme dans l&#39;étape 7.1 entre les charges. </li></ol> 8. tests comportementaux et Hind Limb Fonction <ol><li> Placez la souris dans le champ ouvert. </li><li> Évaluer la fonction locomotrice et la récupération de membre postérieur après une contusion à l&#39;essai en plein champ selon l&#39;échelle de la souris Basso (BMS) 18. NOTE: La fonction neurologique doit être évaluée périodiquement, à partir de 3 jours après la blessure pour 4 semaines 18. </li></ol> 9. Perfusion <ol><li> A la fin de la période expérimentale, anesthésier les animaux par une injection intraperitoneale de pentobarbital sodique (65 mg / kg). Utilisez pincées d&#39;orteil à évaluate niveau de l&#39;anesthésie et de procéder seulement après la souris ne répond pas aux stimuli nocifs. </li><li> Retenir l&#39;animal dans une position couchée sur un plan chirurgical. </li><li> Couper à travers le tégument et la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique. On sépare la membrane du foie. </li><li> Utilisez les ciseaux pour couper la membrane pour exposer la cavité pleurale. </li><li> Couper les côtés de la cage thoracique jusqu&#39;à ce que les clavicules. </li><li> Utilisez les pinces hémostatiques pour serrer le cartilage xiphoïde et placez la pince hémostatique sur la tête. </li><li> Maintenez le tiers inférieur du cœur sur un plan transversal avec la pince. Insérez l&#39;aiguille dans le ventricule gauche. </li><li> Utilisez une pince hémostatique pour serrer le cœur. Cela garantit l&#39;aiguille et empêche les fuites. </li><li> Utilisez les ciseaux pour couper l&#39;oreillette droite. </li><li> Laisser le PBS à pompe (18 ml / min) par l&#39;animal. Maintenir cette pression pendant toute la période de perfusion de tampon (3-4 min, ce qui correspond à environ 70 ml de PBS). Continuez jusqu&#39;à ce que le cœur est propre.</li><li> Mettre le robinet d&#39;arrêt pour permettre le fixateur (paraformaldehyde à 4% dans l&#39;eau distillée, 4% PFA) à travers la pompe. Laisser le PFA 4% à pomper par l&#39;animal pendant environ 8-10 min (300 ml). Augmenter progressivement la pression pour atteindre un maximum de 30 ml / min. Un foie durci est la meilleure indication d&#39;une perfusion de succès. </li></ol> 10. Collecte et traitement des tissus, l&#39;histologie et Iimmunohistochemistry <ol><li> Disséquer la moelle épinière de T5 à L1. Puis post-fixer le tissu dans 6 ml dans 4% PFA (O / N à 4 ° C). </li><li> Mettre le même tissu dans une solution à 30% de saccharose pendant 72 heures à 4 ° C afin de le protéger et cryo pour empêcher la formation de cristaux pendant la congélation. </li><li> QUICK FREEZE le cordon avec de la glace sèche et le stocker à -80 ° C. </li><li> L&#39;article au moyen d&#39;un cryostat à une épaisseur de 15 um et collecter les sections sur des lames de verre et continuer à immunocytochimie. </li><li> Rincer sections avec 200 pi de PBS pour chaque slide (3 fois, 5 minutes à chaque fois, RT). </li><li> Perméabiliser chaque lame avec 200 ul de 10% de NGS et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer sections avec 200 pi de PBS pour chaque lame (3 fois, 5 minutes à chaque fois, RT). </li><li> Bloquer les sites non spécifiques avec 200 ul de solution de blocage de coulisseau (5%; NGS 0,1% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 30 min (RT). </li><li> Incuber chaque lame avec 200 ul d&#39;anticorps primaires O / N à 4 ° C (anticorps diluer dans 5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 dans du PBS). </li><li> Laver les sections avec 200 pi de PBS pour chaque coulisseau (3 fois, 5 minutes à chaque fois; RT). </li><li> Incuber avec des anticorps secondaires appropriés pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver les sections avec 200 pi de PBS pour chaque coulisseau (3 fois, 5 minutes à chaque fois; RT). </li><li> noyaux de tache avec 200 ul de 4 &#39;, 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml de concentration finale, 10 minutes à température ambiante). </li><li> Monter en utilisant le réactif FluorSave et analyser par microscopie confocale. NOTE: Dansdéterminations de contrôle, des anticorps primaires doivent être supprimées et remplacées avec des concentrations équivalentes de IgG non liée de la même sous-classe. Protein deux anticorps primaire associée aux microtubules a été utilisé. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrence.

Dans cet article, nous avons décrit une méthode pour obtenir un modèle reproductible de blessures de la moelle épinière en utilisant un impacteur Horizon Infini à une force de 70 Kdyne (sévère). En utilisant une force plus importante paradigme (80 Kdyne), nous pouvons causer une blessure plus grave que, malheureusement, est associée à une mortalité des souris élevées. Afin d&#39;éviter ce problème, nous choisissons généralement un paradigme de force modérée (70 Kdyne) qui est associée à une lésion reproductible avec une...

Une blessure de la moelle épinière (SCI) est la blessure la plus courante causée par un traumatisme à haute énergie comme les véhicules automobiles accidents, les chutes, les sports et la violence 1. En graves SCI, la force des blessures détruit ou endommage les tissus nerveux, causant une perte soudaine de la fonction neurologique. Traumatique SCI se produit fréquemment chez les jeunes adultes entre 10 et 40 ans. Il affecte grandement état ​​mental et physique du patient et provoque un énorme impact économique pour la société 2. L&#39;approche de traitement à la phase aiguë est souvent limitée à une forte dose de corticostéroïdes, la stabilisation et la décompression chirurgicale pour atténuer éventuellement d&#39;autres dommages 3-4, mais les rôles de ces méthodes sur la récupération locomotrice après SCI sont encore controversée. En plus de la perte de tissu aigu, la lésion traumatique et l&#39;activation des mécanismes secondaires causes de la dégénérescence et de la mort démyélinisation de plusieurs types de cellules 6.5. Le degré de récupération de la fonction peut dedix être corrélée à la mesure de la substance blanche ménagé au site de la lésion 7. Les modèles animaux de SCI peuvent être utilisés à la fois pour étudier les réponses biologiques des tissus à des blessures et de tester des thérapies potentielles. En outre, un modèle animal utile d&#39;une pathologie humaine a non seulement de reproduire certains aspects de cette condition, mais aussi doit offrir des avantages plus de l&#39;observation clinique directe et expérience. Les modèles les plus largement utilisés de blessures de la moelle épinière impliquent une contusion ou une compression des blessures livré à la moelle épinière exposé chirurgicalement 8. Le développement d&#39;une blessure contusion poids baisse contrôlée représente un jalon important dans l&#39;histoire de la recherche SCI. Le centre de recherche sur la moelle épinière Ohio State University a poursuivi le défi technologique d&#39;un dispositif qui peut être utilisé pour induire une compression particulière de la moelle épinière avec des paramètres d&#39;impact contrôlées par un ordinateur neuf. Cela a été initialement conçu pour une utilisation wie rats; plus tard, il a été modifié pour se appliquer à 10 souris. Les avantages de ce type d&#39;approche sont que les biomécanique de blessures peuvent être étudiés plus en profondeur et les paramètres de blessures peuvent être définis d&#39;une manière plus complète afin d&#39;obtenir un modèle expérimental reproductible, permettant ainsi une évaluation plus précise des effets de traitements testés sur le processus de récupération fonctionnelle. De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation d&#39;une variété de cellules souches dans des modèles 11 SCI. Nous avons récemment isolé adultes de neurones cellules souches de la zone sous-ventriculaire (SVZ) plusieurs heures après la mort du donneur de la souris 12-13. Cette procédure prévoit une population de cellules souches neurales, appelé après mortem précurseurs neuraux (PM-PNJ), qui semblent être avantageux dans une approche de la médecine régénérative pour guérir SCI. Dans cet article nous allons le démontrer: i) le protocole de marquage des cellules avec le traceur PKH26 vitale, ii) l&#39;Surgical procédure à effectuer sur lésions médullaires traumatiques, et iii) la voie intraveineuse (iv) l&#39;administration de cellules marquées. En outre, dans ce travail, nous démontrons que les cellules transplantées migrent vers les sites de lésion de la moelle épinière et se différencient principalement en protéines associée aux microtubules (MAP) 2 cellules positives. De plus, la différenciation se accompagne de la promotion d&#39;une récupération stable de la fonction des membres postérieurs.

<table><tbody><tr><td>PKH26GL-1KT&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>091M0973</td><td></td></tr><tr><td>Horizon infini (IH) Dispositif d’impactage&nbsp ;</td><td>Precision Systems and Instrumentation, LLC</td><td>Modèle 0400 Série 0171</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycine 10 mg/ml</td><td>Euroclone</td><td>ECM0011B</td><td>1 mg/ml en solution saline stérile</td></tr><tr><td>Isoflurane-Vet 250 ml</td><td>Merial</td><td>B142J12A</td><td></td></tr><tr><td>Blefarolin POM OFT 10 g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-lames</td><td>2Biological Instruments</td><td>HB101-sm-402</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel, taille 10</td><td>Lance Paragon</td><td>26920</td><td></td></tr><tr><td>Petite pince Graefe</td><td>2Biological Instruments</td><td>11023-14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Medicon Instruments</td><td>07 60 07</td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux</td><td>2Biological Instruments</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sutures résorbables (4/0)</td><td>Safil Quick</td><td>C0046203</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>2Biological Instruments</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur de pince de plaie Reflex 7</td><td>2Biological Instruments</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinces de plaie Reflex de 7 mm</td><td>2Biological Instruments</td><td>12032-07</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Euroclone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>1086431000</td><td></td></tr><tr><td>Protéine assocoated anti-microtubules&nbsp ; (MAP) 2</td><td>Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave Réactif&nbsp ;</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches neurales milieu</td><td></td><td></td><td>DMEM-F12 (Euroclone) contenant 2 mm de l-glutamine (Euroclone), 0,6 % de glucose (Sigma-Aldrich), 9,6 g/ml de putrescine (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml de progestérone (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml de sélénite de sodium (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml d’insuline (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml de transferrine (Sigma-Aldrich) et 2 &mu ; g/ml d’héparine (sel de sodium, grade II ; Sigma-Aldrich), bFGF (recombinant humain, 10 ng/ml ; Life Technologies) et EGF (recombinant humain, 20 ng/ml ; Life Technologies)&nbsp ;</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Euroclone</td><td>ASM5002</td><td></td></tr><tr><td>l-glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780-25G</td><td></td></tr><tr><td>progestérone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6149-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-sélénite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133-1MG</td><td></td></tr><tr><td>transferrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T 5391</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodium-sel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0200000</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>h-EGF</td><td>Life Technology</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 0,33 cc 29 G</td><td>Terumo</td><td>MYJECTOR&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>buprénorphine</td><td>Schering Plough SpA</td><td>TEMGESIC</td><td></td></tr><tr><td>gel pour les yeux</td><td>Bausch & Lomb</td><td>LIPOSIC</td><td></td></tr></tbody></table>

neural transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale modèle contusion de la moelle épinière des blessures

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Lésion de la moelle épinière est un état clinique dévastateur, caractérisé par un complexe de dysfonctionnements neurologiques. Les modèles animaux de lésions de la moelle épinière peuvent être utilisés à la fois pour enquêter sur les réponses biologiques à des blessures et de tester des thérapies potentielles. Contusion ou compression délivrée blessure à la moelle épinière exposée chirurgicalement sont les modèles les plus répandus de la pathologie. Dans ce rapport, la contusion expérimentale est effectuée en utilisant l&#39;horizon infini (IH) dispositif de Impactor, qui permet la création d&#39;un modèle animal de lésion reproductible par la définition des paramètres de blessures spécifiques. la transplantation de cellules souches est généralement considérée comme une stratégie potentiellement utile pour guérir cette maladie débilitante. De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation de diverses cellules souches. Ici, nous démontrons une méthode adaptée pour les blessures de la moelle épinière suivie par injection dans la veine de la queue de cellules dans des souris CD1. En bref, nous fournissons les procédures pour: i) le marquage cellulaire wie un traceur vitale, ii) soins pré-opératoires de souris, iii) l&#39;exécution d&#39;une blessure de la moelle épinière contondante, et iv) l&#39;administration intraveineuse de post mortem précurseurs neuraux. Ce modèle de contusion peut être utilisé pour évaluer l&#39;efficacité et l&#39;innocuité de la transplantation de cellules souches dans une approche de la médecine régénératrice.

Le nombre total de cellules transplantées est 1 x 10 6 cellules et a été divisé en trois injections consécutives dans la veine de la queue. Nous avons administré 3,3 x 10 5 cellules dans 50 ul de solution tampon de phosphate (PBS). La première injection a été réalisée dans les 30 minutes après la blessure, la deuxième 6 heures plus tard et les dernières 18 heures après la lésion. Le choix d'un délai de 18 h après l'administration de SCI PM-NPC a été déterminée par la perméabilité optimale de la bar...

Lésion de la moelle épinière est une condition traumatique qui entraîne une morbidité grave et une mortalité élevée. Dans ce travail, nous décrivons en détail un modèle de contusion de blessure de la moelle épinière chez la souris suivie d&#39;une transplantation de cellules souches neurales.

Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

L’objectif général de cette procédure est de décrire en détail un modèle de contusion de lésion de la moelle épinière chez la souris, suivie d’une transplantation de cellules souches neurales. Ceci est accompli en marquant d’abord les cellules précurseurs neurales post-mortem ou les NPC PM avec le traceur vital PKH 26. Ensuite, une incision dorsale est pratiquée sur la souris et la moelle épinière est exposée.Ensuite, un dispositif d’impact à horizon infini ou IH est utilisé pour créer une lésion sur la moelle épinière. Enfin, les PM et PC marqués PKH 26 sont injectés dans la veine de la queue de la souris. En fin de compte, le sort de la PKH 20 greffée à 18h00 et des PC sur le site de la lésion est suivi.Le modèle de blessure reproduit celui de l’homme blessé à la moelle épinière. La lésion mécanique primaire est suivie d’une dégénérescence secondaire progressive où un traitement cellulaire et pharmacologique est étudié. Les applications décrites peuvent fournir une base méthodologique pour obtenir d’autres connaissances sur la foi.Induction de cellules souches transplantées dans une moelle épinière pendant la dégénérescence et les événements inflammatoires. La démonstration de la lésion sera faite par le Dr Tony Laja Longo, étudiant au doctorat dans le laboratoire. Alors que l’injection de queue sera effectuée par le Dr Ache, qui est un boursier postdoctoral dans le laboratoire, en commençant par des cellules souches neurales qui répondent aux critères décrits dans le protocole de texte.Resus suspend les cellules à une concentration de un fois 10 à six cellules par 150 microlitres. Préparez au moins 1,2 fois 10 à six cellules par souris pour avoir suffisamment de cellules pour charger la pipette. Avec un milieu de cellules souches neurales, lavez les cellules trois fois dans un flacon conique de 10 millilitres, en tournant à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les cellules.Après chaque lavage, avant le comptage final de l’essorage, les cellules puis, après l’essorage, aspirent le surnageant, laissant environ 25 microlitres de liquide pour éviter l’aspiration des cellules. Ensuite, préparez une suspension deux X en ajoutant un millilitre de diluant C dans le palais cellulaire et utilisez un pipetage doux pour le remettre immédiatement en suspension. Avant la coloration, préparez une solution de deux x colorants dans le diluant C en ajoutant quatre microlitres de la solution d’éthanol D PKH 26 à un millilitre de diluant C dans un tube et mélangez bien.Pour disperser rapidement, ajoutez un millilitre de suspension à deux cellules x à un millilitre de solution de deux XD et mélangez immédiatement l’échantillon par pipetage. Après avoir incubé la suspension de la matrice cellulaire pendant une à cinq minutes, arrêtez la coloration en ajoutant un volume égal de solution BSA à 1 % dans HBSS et incubez pendant une minute. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant 10 minutes et retirez soigneusement le surnageant.Utilisez 10 millilitres de milieu complet pour remettre en suspension la pastille cellulaire afin d’évaluer la récupération cellulaire, la viabilité cellulaire et l’intensité de la fluorescence. Centrifugez les cellules, jetez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de HBSS à la pastille de cellule. Lavez deux fois avec HBSS et remettez les cellules en suspension dans une solution physiologique stérile.Après avoir préparé la zone chirurgicale et une souris selon le protocole de texte, placez l’animal côté dorsal vers le haut sur un chauffe-lames pour éviter l’hypothermie pendant la chirurgie avec un scalpel, faites une incision verticale sur la région d’intérêt de T sept à T 12 à l’aide d’une pince. Tenez la peau et le coussinet adipeux superficiel situés entre l’espace entre les cinquième et sixième apophyses thoraciques sous un stéréomicroscope. Comptez le processus sous le vaisseau sanguin comme T six, puis passez à T sept.Ensuite, placez un peu de roulement sous la face ventrale de la souris pour augmenter la courbure de la colonne vertébrale et utilisez des pinces grof pour bloquer la colonne vertébrale afin de l’immobiliser. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez le para des muscles vertébraux bilatéralement de T sept à T 10 au niveau vertébral jusqu’à ce que la surface dorsale de la lame entre en contact avec la pointe du scalpel. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, cochez la jonction de T sept à T 10 au niveau vertébral jusqu’à ce que la surface dorsale de la lame entre en contact avec la pointe du scalpel et s’arrête dans l’espace entre les minuscules protubérances T huit et T neuf.Ensuite, utilisez des micro-ciseaux pour couper le tissu entre T huit et T neuf et T neuf et T 10. Utilisez maintenant le rongeur pour supprimer le processus T neuf. Exposez la jonction à l’aide de micro-ciseaux pour gratter soigneusement la couche musculaire.Continuez jusqu’à ce que l’os soit exposé. Utilisez une pince pour retirer les muscles de la lame et ouvrir un petit espace entre les vertèbres. Insérez ensuite délicatement les micro-ciseaux sous l’os.Coupez le limbe des deux côtés et utilisez la pince pour le retirer, exposant ainsi le cordon. Utilisez le ron jour pour enlever tous les fragments d’os libres ou déchiquetés qui restent. Retirez ensuite la moitié supérieure de l’apophyse dorsale T neuf.Après avoir suivi le protocole de l’appareil d’impactage IH, conformément aux directives du texte, utilisez quatre points de suture résorbables pour fermer l’incision en couvrant d’abord la moelle épinière exposée au site de la lame retirée. En prenant soin de ne pas pincer les muscles sous-jacents. Utilisez deux ou trois pinces réfléchissantes pour fermer la peau.Injectez deux millilitres de solution saline dans le bas du dos par voie sous-cutanée et placez la souris dans une cage de préchauffage sur un coussin chauffant pour récupérer. Pour effectuer une injection de cellules dans la veine de la queue. Remettez les cellules en suspension dans le tube à essai et chargez 75 microlitres dans une seringue de 0,3 millilitre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans la suspension cellulaire.Pour éviter la sédimentation cellulaire, maintenez la seringue en position horizontale. Placez la souris sous la lampe chauffante pour dilater les veines de la queue. Ensuite, tirez doucement la souris dans la retenue pour visualiser la veine latérale de la queue, qui apparaît sous la forme d’une étroite ligne bleue.Utilisez un tampon imbibé d’alcool pour nettoyer la queue, et une fois la veine visualisée, saisissez la veine de la queue entre le majeur et le pouce de la main gauche. La contusion T neuf démontrée dans cette vidéo a provoqué la perte transitoire de la fonction des membres postérieurs trois fois 10 à la cinquième cellules ou PBS ont été injectés dans la veine de la queue en trois injections effectuées 30 minutes, six heures et 18 heures après la blessure. Comme le montre ici, en deux à trois semaines, les souris blessées traitées par PBS se sont améliorées et la fonction des membres postérieurs a atteint trois points d’échelle basale de souris ou les souris BMS traitées avec des PM.NPCs, cependant, ont montré une récupération plus élevée et ont atteint 4,5 points de BMS comme on le voit ici, la plupart des PM NPC greffés marqués avec PKH 26, accumulés sur les bords de la lésion formant des grappes.Peu de temps après l’administration, les cellules transplantées ont migré le long des bords de la lésion et de manière plus diffuse où elles se sont différenciées en neurones. À 30 jours après la lésion et la transplantation, le corps cellulaire des NPC pm a augmenté en taille et dans la plupart des cellules, les processus de type dendritique étaient évidents et entièrement immuno-colorés par les anticorps spécifiques à cartographier Lors de l’obtention de cette procédure pro, il est important de se rappeler que des forces plus élevées peuvent augmenter la mortalité chez l’animal en raison de blessures plus graves. Ainsi, nous suggérons d’utiliser notre paradigme de paradigme de lésion qui est suivi d’un processus de récupération plus reproductible.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir un modèle expérimental reproductible de lésion traumatique de la moelle épinière chez la souris en utilisant l’impacteur à horizon infini.

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La transplantation précurseurs neuraux est une stratégie prometteuse pour protéger et / ou le remplacement perdu / dysfonctionnel cervicale neurones moteurs phrénique des blessures de la moelle épinière (SCI) et les neurones moteurs désordre, la sclérose amyotrophique latérales (SLA). Nous fournissons un protocole pour la livraison de cellule à la corne moelle épinière cervicale ventrale dans des modèles rongeurs de la SLA et la SCI.

Cell Transplantation intraspinale pour le ciblage du col corne ventrale de la sclérose latérale amyotrophique et les lésions de la moelle épinière

Source : Lakshman, N., et al. Un test de la neurosphère pour évaluer l’activation des cellules souches neurales endogènes dans un modèle murin de lésion minime de la moelle épinière. J. Vis. Exp. (2018). Cette vidéo démontre l’activation et la migration des cellules souches neurales (NSC) dans un modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris. Pour exposer la moelle épinière, une vertèbre de la région thoracique de la colonne vertébrale est retirée d’une souris anesthésiée. Une lésion...

 Un modèle minimal de lésion de la moelle épinière pour étudier l’activation et la migration des cellules souches neurales

Un modèle de contusion de la lésion médullaire sévère est décrite. Les étapes détaillées pré-opératoire, opératoires et post-opératoires sont décrits pour obtenir un modèle cohérent.

Un modèle de contusion de graves lésions de la moelle épinière chez les rats

des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s'étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances.

Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère

Le traitement des lésions de la moelle épinière cervicale à l’aide de peptides auto-assemblés (SAP) et de cellules précurseurs neurales (NPC), ainsi que de facteurs de croissance, est une approche prometteuse pour favoriser la régénération et la récupération. Un modèle de clip d’anévrisme de contusion/compression chez le rat de LME cervicale et un traitement combiné impliquant l’injection de SAP et la transplantation de NPC sont établis.

Utilisation synergique des cellules neurales précurseurs et peptides d&#39;auto-assemblage dans la partie expérimentale moelle épinière cervicale blessures

Les lésions graves de la moelle épinière entraînent souvent des anomalies tissulaires. Deux possibilités sont décrites pour combler avec succès ces lacunes afin de promouvoir l’adaptation tissulaire, les réponses régénératives et l’amélioration fonctionnelle chez le rat via l’implantation d’un système de microconnecteur mécanique après une lésion aiguë et cinq semaines après une transsection complète de la moelle épinière.

Stratégies expérimentales pour combler les lacunes de tissus grandes dans la moelle épinière lésée après aiguë et chronique Lésion

Cet article décrit une technique pour insérer un tube creux entre les souches de la moelle épinière après transection complète et remplissez-le de cellules de Schwann (SCs) et matrice injectable membrane basale afin de combler et de promouvoir la régénération axonale dans le fossé.

Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

Ici, nous démontrons la performance d’un modèle de blessures médullaires minime dans une souris adulte qui épargne la niche de canal central logement cellules souches neuronales endogènes (CNS). Nous montrons comment le dosage Neurosphère peut être utilisé pour quantifier l’activation et la migration des CNS primitifs et définitifs après une blessure.

Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Ce protocole démontre des méthodologies pour un modèle de souris des dommages traumatiques de cerveau de crâne ouvert et de la transplantation des cellules pluripotentes pluripotentes de cellules souches induites cultivées dans le site de blessure. Les essais comportementaux et histologiques des résultats de ces procédures sont également décrits en bref.

Modèle d'impact cortical contrôlé des dommages de cerveau de souris avec la transplantation thérapeutique des cellules neurales pluripotentes induites par l'homme de cellules souches

Dans cet article, nous proposons une méthode reproductible pour générer et maintenir à long terme des coupes organotypiques de la moelle épinière transplantées avec des cellules souches neurales comme modèle ex vivo pour tester des thérapies de remplacement cellulaire.

Culture à long terme de coupes organotypiques de moelle épinière de souris comme plate-forme de validation de la transplantation cellulaire dans les lésions de la moelle épinière

Dans cette étude, des hydrogels composites mimétiques nerveux ont été développés et caractérisés qui peuvent être utilisés pour étudier et capitaliser sur le comportement pro-régénératif des cellules souches dérivées du tissu adipeux pour la réparation des lésions de la moelle épinière.

Développement de thérapies combinatoires pour les lésions de la moelle épinière à l’aide de l’administration de cellules souches

Découvrez la transplantation de cellules souches neurales dans un modèle de contusion de la moelle épinière chez la souris. Cette méthode permet d'étudier la régénération nerveuse et le devenir des cellules greffées.

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