Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

L’objectif général de cette procédure est de décrire en détail un modèle de contusion de lésion de la moelle épinière chez la souris, suivie d’une transplantation de cellules souches neurales. Ceci est accompli en marquant d’abord les cellules précurseurs neurales post-mortem ou les NPC PM avec le traceur vital PKH 26. Ensuite, une incision dorsale est pratiquée sur la souris et la moelle épinière est exposée.

Ensuite, un dispositif d’impact à horizon infini ou IH est utilisé pour créer une lésion sur la moelle épinière. Enfin, les PM et PC marqués PKH 26 sont injectés dans la veine de la queue de la souris. En fin de compte, le sort de la PKH 20 greffée à 18h00 et des PC sur le site de la lésion est suivi.

Le modèle de blessure reproduit celui de l’homme blessé à la moelle épinière. La lésion mécanique primaire est suivie d’une dégénérescence secondaire progressive où un traitement cellulaire et pharmacologique est étudié. Les applications décrites peuvent fournir une base méthodologique pour obtenir d’autres connaissances sur la foi.

Induction de cellules souches transplantées dans une moelle épinière pendant la dégénérescence et les événements inflammatoires. La démonstration de la lésion sera faite par le Dr Tony Laja Longo, étudiant au doctorat dans le laboratoire. Alors que l’injection de queue sera effectuée par le Dr Ache, qui est un boursier postdoctoral dans le laboratoire, en commençant par des cellules souches neurales qui répondent aux critères décrits dans le protocole de texte.

Resus suspend les cellules à une concentration de un fois 10 à six cellules par 150 microlitres. Préparez au moins 1,2 fois 10 à six cellules par souris pour avoir suffisamment de cellules pour charger la pipette. Avec un milieu de cellules souches neurales, lavez les cellules trois fois dans un flacon conique de 10 millilitres, en tournant à 500 fois G pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les cellules.

Après chaque lavage, avant le comptage final de l’essorage, les cellules puis, après l’essorage, aspirent le surnageant, laissant environ 25 microlitres de liquide pour éviter l’aspiration des cellules. Ensuite, préparez une suspension deux X en ajoutant un millilitre de diluant C dans le palais cellulaire et utilisez un pipetage doux pour le remettre immédiatement en suspension. Avant la coloration, préparez une solution de deux x colorants dans le diluant C en ajoutant quatre microlitres de la solution d’éthanol D PKH 26 à un millilitre de diluant C dans un tube et mélangez bien.

Pour disperser rapidement, ajoutez un millilitre de suspension à deux cellules x à un millilitre de solution de deux XD et mélangez immédiatement l’échantillon par pipetage. Après avoir incubé la suspension de la matrice cellulaire pendant une à cinq minutes, arrêtez la coloration en ajoutant un volume égal de solution BSA à 1 % dans HBSS et incubez pendant une minute. Ensuite, centrifugez les cellules à 500 fois G pendant 10 minutes et retirez soigneusement le surnageant.

Utilisez 10 millilitres de milieu complet pour remettre en suspension la pastille cellulaire afin d’évaluer la récupération cellulaire, la viabilité cellulaire et l’intensité de la fluorescence. Centrifugez les cellules, jetez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de HBSS à la pastille de cellule. Lavez deux fois avec HBSS et remettez les cellules en suspension dans une solution physiologique stérile.

Après avoir préparé la zone chirurgicale et une souris selon le protocole de texte, placez l’animal côté dorsal vers le haut sur un chauffe-lames pour éviter l’hypothermie pendant la chirurgie avec un scalpel, faites une incision verticale sur la région d’intérêt de T sept à T 12 à l’aide d’une pince. Tenez la peau et le coussinet adipeux superficiel situés entre l’espace entre les cinquième et sixième apophyses thoraciques sous un stéréomicroscope. Comptez le processus sous le vaisseau sanguin comme T six, puis passez à T sept.

Ensuite, placez un peu de roulement sous la face ventrale de la souris pour augmenter la courbure de la colonne vertébrale et utilisez des pinces grof pour bloquer la colonne vertébrale afin de l’immobiliser. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez le para des muscles vertébraux bilatéralement de T sept à T 10 au niveau vertébral jusqu’à ce que la surface dorsale de la lame entre en contact avec la pointe du scalpel. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, cochez la jonction de T sept à T 10 au niveau vertébral jusqu’à ce que la surface dorsale de la lame entre en contact avec la pointe du scalpel et s’arrête dans l’espace entre les minuscules protubérances T huit et T neuf.

Ensuite, utilisez des micro-ciseaux pour couper le tissu entre T huit et T neuf et T neuf et T 10. Utilisez maintenant le rongeur pour supprimer le processus T neuf. Exposez la jonction à l’aide de micro-ciseaux pour gratter soigneusement la couche musculaire.

Continuez jusqu’à ce que l’os soit exposé. Utilisez une pince pour retirer les muscles de la lame et ouvrir un petit espace entre les vertèbres. Insérez ensuite délicatement les micro-ciseaux sous l’os.

Coupez le limbe des deux côtés et utilisez la pince pour le retirer, exposant ainsi le cordon. Utilisez le ron jour pour enlever tous les fragments d’os libres ou déchiquetés qui restent. Retirez ensuite la moitié supérieure de l’apophyse dorsale T neuf.

Après avoir suivi le protocole de l’appareil d’impactage IH, conformément aux directives du texte, utilisez quatre points de suture résorbables pour fermer l’incision en couvrant d’abord la moelle épinière exposée au site de la lame retirée. En prenant soin de ne pas pincer les muscles sous-jacents. Utilisez deux ou trois pinces réfléchissantes pour fermer la peau.

Injectez deux millilitres de solution saline dans le bas du dos par voie sous-cutanée et placez la souris dans une cage de préchauffage sur un coussin chauffant pour récupérer. Pour effectuer une injection de cellules dans la veine de la queue. Remettez les cellules en suspension dans le tube à essai et chargez 75 microlitres dans une seringue de 0,3 millilitre, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles dans la suspension cellulaire.

Pour éviter la sédimentation cellulaire, maintenez la seringue en position horizontale. Placez la souris sous la lampe chauffante pour dilater les veines de la queue. Ensuite, tirez doucement la souris dans la retenue pour visualiser la veine latérale de la queue, qui apparaît sous la forme d’une étroite ligne bleue.

Utilisez un tampon imbibé d’alcool pour nettoyer la queue, et une fois la veine visualisée, saisissez la veine de la queue entre le majeur et le pouce de la main gauche. La contusion T neuf démontrée dans cette vidéo a provoqué la perte transitoire de la fonction des membres postérieurs trois fois 10 à la cinquième cellules ou PBS ont été injectés dans la veine de la queue en trois injections effectuées 30 minutes, six heures et 18 heures après la blessure. Comme le montre ici, en deux à trois semaines, les souris blessées traitées par PBS se sont améliorées et la fonction des membres postérieurs a atteint trois points d’échelle basale de souris ou les souris BMS traitées avec des PM.NPCs, cependant, ont montré une récupération plus élevée et ont atteint 4,5 points de BMS comme on le voit ici, la plupart des PM NPC greffés marqués avec PKH 26, accumulés sur les bords de la lésion formant des grappes.

Peu de temps après l’administration, les cellules transplantées ont migré le long des bords de la lésion et de manière plus diffuse où elles se sont différenciées en neurones. À 30 jours après la lésion et la transplantation, le corps cellulaire des NPC pm a augmenté en taille et dans la plupart des cellules, les processus de type dendritique étaient évidents et entièrement immuno-colorés par les anticorps spécifiques à cartographier Lors de l’obtention de cette procédure pro, il est important de se rappeler que des forces plus élevées peuvent augmenter la mortalité chez l’animal en raison de blessures plus graves. Ainsi, nous suggérons d’utiliser notre paradigme de paradigme de lésion qui est suivi d’un processus de récupération plus reproductible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir un modèle expérimental reproductible de lésion traumatique de la moelle épinière chez la souris en utilisant l’impacteur à horizon infini.