L'utilisation de nucléotides stopped-flow fluorescence et marqués d'analyser les Chiffre d'affaires Cycle ATP de kinésines

L’objectif général de cette procédure est de mesurer la cinétique de liaison et de dissociation des nucléotides au cours du cycle de renouvellement A TP d’une kinésine. Ceci est accompli en préparant d’abord la protéine kinésine, soit exempte de nucléotide, soit chargée de nucléotide marqué par fluorescence. Ensuite, la kinésine préparée est mélangée avec un nucléotide à l’aide d’un fluorimètre à flux arrêté et le changement de fluorescence associé à la liaison ou à la dissociation du nucléotide marqué par fluorescence est observé.

Ensuite, la variation de fluorescence est ajustée à une fonction exponentielle pour obtenir une constante de vitesse. Enfin, les constantes de vitesse mesurées sont décentralisées et les constantes de vitesse sont attribuées à des transitions particulières du cycle de rotation d’A TP. En fin de compte, la combinaison d’un nucléotide marqué par fluorescence et d’une fluorescence à flux arrêté est utilisée pour mesurer la cinétique de liaison et de dissociation des nucléotides.

Jennifer Patel, postdoctrice, et Hannah Belch, une étudiante diplômée de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir déterminé l’intensité de fluorescence de la kinésine lors de la liaison du nucléotide marqué par l’homme, comme indiqué dans le protocole de texte, à une solution de jusqu’à 20 micromolaires de kinésine dans un tampon sans magnésium à un millimolaire d’EDTA et un millimolaire de DTT, incubez la solution pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius, mettez en place une colonne de filtration sur gel G 25 SX à écoulement gravitaire et équilibrez avec au moins trois volumes de colonne d’un tampon. Chargez ensuite la solution d’essin dans la colonne pour séparer les nucléotides libres et l’EDTA de la kinésine.

Réparez un tube collecteur en ajoutant un volume de 100 millimolaires de solution de chlorure de magnésium dans le tube vide, de sorte que la concentration finale de chlorure de magnésium soit d’un millimolaire. Après le prélèvement de la solution de kinésine, l’utilisation d’un tampon sans magnésium approprié élue rapidement la kinésine. La présence de chlorure de magnésium dans le tube de collecte aide à stabiliser la kinésine immédiatement après Ian de la colonne, stocke la kinésine sur de la glace et l’utilise dans les une à deux heures.

En attendant, préparez un homme une série de concentration TP. Choisissez la plage de concentrations en fonction de la concentration disponible de kinésine. Pour chaque concentration de mant un TP, préparez une concentration appropriée de kinésine de sorte que le nucléotide marqué par l’homme soit en excès molaire de cinq à dix fois supérieur aux sites de liaison des nucléotides de kinésine.

Réglez la longueur d’onde d’excitation sur le fluorimètre à flux arrêté, les 365 nanomètres et la longueur d’onde d’émission supérieure à 400 nanomètres avec un filtre passe-long. Ensuite, en commençant par la concentration la plus faible de Manta TP, utilisez le fluorimètre à flux arrêté pour mélanger le Manta TP et la kinésine sans nucléotides dans un rapport volume-volume un pour un. À l’aide de la formule suivante, ajustez la mesure de la variation de l’intensité de fluorescence pour enseigner la concentration de mant A TP à une fonction exponentielle, plus une ligne de pente négative constante pour tenir compte du photoblanchiment du groupe mant.

À partir de ces ajustements, déterminez une constante de vitesse à chaque concentration de mant. Un TP dégrade ensuite les taux d’association et de dissociation en utilisant la soie dentaire en fonction de la concentration de mant. A TP Ajustez ensuite ces données à une fonction linéaire pour obtenir le gradient et l’ordonnée à l’origine de l’axe y.

Le gradient représente la constante de vitesse pour l’homme, une association TP avec des unités par molaire par seconde. L’ordonnée à l’origine représente la constante du taux de dissociation avec les unités par seconde. Pour mesurer la vitesse constante de dissociation, faites fermenter un DP dans une solution de deux kinésines micromolaires dans un tampon approprié à 50.

Micromolaire signifiait un incubateur DP à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir utilisé une colonne Sedex G 25 pour éliminer le fre mant, A DP de la kinésine, chargé avec le mant A DP, et réglé le fluter d’arrêt comme décrit précédemment dans cette vidéo, utilisez le flux arrêté pour mélanger le complexe mant A DP Kinine avec un excès molaire de 50 fois ou plus de A TP non étiqueté dans un ajustement de rapport volume/volume un à un. La diminution de l’intensité de fluorescence observée au fil du temps à une seule fonction exponentielle, plus une ligne de pente négative constante pour permettre le photoblanchiment du groupe.

Le kops déterminé à partir de cet ajustement est la constante de vitesse pour la dissociation de mant A DP avec des unités de par seconde. L’amplitude du changement de signal lors de la liaison ou de la dissociation d’un nucléotide de bois de manteau dépend de la kinésine particulière. Par conséquent, il est utile d’effectuer d’abord des mesures d’équilibre pour confirmer à la fois la présence et l’amplitude d’un changement d’intensité fluorescente.

Les spectres fluorescents fermentent un TP et signifient un DP à la fois en solution et en complexe de la kinésine M CAC sont montrés ici. Cette figure représente la réaction qui se produit lors du mélange d’un TP avec de la kinésine sans nucléotides. L’augmentation de l’intensité de fluorescence qui se produit lors de la liaison de l’homme A TP à M CAC est illustrée ici, en ajustant la constante de vitesse par rapport à l’homme.

Une concentration de TP en une fonction linéaire, comme on le voit ici, permet la déconvolution de la constante de vitesse qui contribue à kops et fournit la position de taux d’association et de dissociation du ferment A TP. Cette figure montre la diminution de l’intensité de fluorescence observée dans le ferment A DP lors de la dissociation de M CEC, comme illustré ici. La constante de vitesse pour la dissociation de la DP de mant A de la kinésine est déterminée en ajustant ces données à une fonction exponentielle. Une fois maîtrisés, ces protocoles peuvent chacun être réalisés en moins de trois heures.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la kinésine, elle peut également être appliquée à d’autres protéines de liaison aux nucléotides, telles que la myosine et les protéines G. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des nucléotides marqués par fluorescence et un débitmètre d’arrêt pour mesurer la cinétique de liaison et de dissociation des nucléotides pour une kinésine.