Name: Lutilisation de nucléotides stopped-flow fluorescence et marqués danalyser les Chiffre daffaires Cycle ATP de kinésines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Découvrez l'analyse cinétique des nucléotides marqués par fluorescence pour étudier le cycle ATP des kinésines. Cette méthode de flux arrêté mesure les taux de liaison et de dissociation des nucléotides.

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Ce travail est soutenu par la biotechnologie et du Conseil de recherche en sciences biologiques (BBSRC), la Royal Society et l&#39;Université de Nottingham.

1 Détermination de l&#39;Intensité de fluorescence lors de la liaison de changement Mant nucleotide marqué. <ol><li> Ajouter 1 uM mant nucleotide marqué à une kinésine uM (concentrations finales) dans un tampon de réaction approprié. Typiquement, un tampon qui profite la croissance des microtubules et la stabilité est utilisé (voir la discussion). Un tampon couramment utilisé contient 80mm pipérazine-bis-2-éthanesulfonique (TUBES) pH6.9, 1 mM MgCl2 et 1 mM d&#39;éthylène glycol bis-2-amino-éther tétraacétique (EGTA). Remarque: La concentration de la kinésine indiqué dans tous les protocoles renvoie à la concentration des sites de liaison de nucléotides (c.-à-domaines à moteur). Différents kinésines existent sous forme de monomères, de dimères ou de tétramères et ainsi peuvent contenir plus d&#39;un site de liaison de nucléotide-par molécule. </li><li> Après une période d&#39;incubation (1-3 min) et à l&#39;aide d&#39;un fluorimètre standard, mesurer le spectre d&#39;émission du complexe de nucléotides-mant kinésine marqué. Utilisez une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm etmesure la lumière émise 400-500 nm par incréments de 1 nm. </li><li> Ajouter une solution de 1 mM de nucléotides mant marquée dans le même tampon de réaction utilisé à l&#39;étape 1.1. </li><li> Mesurer le spectre d&#39;émission de l&#39;échantillon seulement mant de nucleotides, comme décrit précédemment (voir étape 1.2). </li><li> Normaliser le spectre du signal à la longueur d&#39;onde de pic d&#39;intensité de fluorescence du spectre de nucléotides mant en solution (à savoir, sans kinésine) en divisant par le biais de cette valeur. </li><li> Tracer le spectre normalisé (par exemple, la figure 2B) pour observer les différences d&#39;intensité de fluorescence entre le mantATP lié et / ou mantADP lié kinésine et mant nucléotides en solution. </li></ol> 2 Mesure des constantes d&#39;association et de dissociation Taux de mantATP <ol><li> Pour une solution de jusqu&#39;à 20 uM kinésine (voir la discussion) dans toute Mg 2 + tampon approprié exempt (par exemple, 80 mm TUYAUX pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% de Tween 20), ajouter 1acide mM (concentration finale) éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 1 mM (concentration finale), le dithiothréitol (DTT). Remarque: L&#39;addition de Tween 20 à la mémoire tampon est déconseillé car il réduit / empêche la perte de la protéine kinésine sur la colonne utilisée pour l&#39;échange de tampon (étapes 2.3 et 3.3) </li><li> Incuber la solution à 25 ° C pendant 15 min. </li><li> Nucléotides séparé libre et EDTA de la kinésine en utilisant une colonne écoulement par gravité de filtration G-25 de gel de Sephadex selon les instructions du fabricant (voir la liste des matériaux). <ol><li> Equilibrer la colonne avec au moins 3 volumes de colonne d&#39;un tampon exempt de Mg2 + approprié (voir étape 2.1). Charger la solution contenant kinésine sur la colonne. Préparer un tube collecteur par l&#39;addition d&#39;un volume approprié de solution 100 mM de chlorure de magnésium dans le tube vide, de telle sorte que la concentration finale en chlorure de magnésium est de 1 mm après la collecte de la solution de kinésine. Plus immédiate de chlorure de magnésium aide stabiliSE kinésine libre nucléotides. </li><li> Eluer la kinésine au moyen d&#39;un tampon exempt de Mg2 + approprié. Les kinésines sont instables quand il est libre de nucléotides, il est important de travailler rapidement. Rangez la kinésine libre nucléotides sur la glace et utiliser dans les 1-2 heures. </li></ol></li><li> Pendant ou avant la préparation de la kinésine libre nucléotides, de préparer une série de concentrations de mantATP dans le même tampon de réaction que la solution finale de la kinésine-nucléotides libres. Déterminer la gamme de concentrations de mantATP nécessaires en fonction de la concentration disponible de la kinésine avec une série typique allant de 0,1 à 50 um (voir l&#39;étape 2.5 et discussion). </li><li> Préparer une série de concentrations de la kinésine libre nucléotides. Pour chaque concentration de mantATP (étape 2.4), une concentration de la kinésine-nucléotide libre doit être préparé de telle sorte que le nucléotide marqué est-mant dans 5 à 10 fois en excès molaire de plus de sites de liaison de nucleotides kinésine. </li><li> Réglez la longueur d&#39;onde d&#39;excitation sur le-flo arrêtéw fluorimètre à 365 nm et collecter la lumière émise à&gt; 400 nm en utilisant un filtre passe-temps. </li><li> En commençant par la plus faible concentration de mantATP, mélanger le mantATP avec une concentration appropriée de la kinésine libre nucléotides dans un rapport de 1: 1 v / v en utilisant un fluorimètre stopped-flow (figure 3A et 3B encadré). Remarque: Les réactifs sont dilués par 50% lors du mélange. Prenez note de la concentration en nucléotides fois avant et après mélange (à savoir, 3,0 / 1,5 M) pour éviter toute confusion. </li><li> Mettre en place la variation d&#39;intensité de fluorescence mesurée à chaque concentration de mantATP à une fonction exponentielle et une ligne de pente constante négative pour tenir compte de photoblanchiment du groupe de formants (c&#39;est à dire, A = Fluorescence 0 exp (k .t obs) + (m. t + c), où A 0 est l&#39;amplitude, k obs est la constante de vitesse et t le temps, voir la figure 3B et discussion). De ces accès déterminer untaux constant (k obs) à chaque concentration de mantATP. Chaque obs k est une convolution d&#39;une constante d&#39;association et de dissociation taux (Figure 1, k 1 et k-1). </li><li> Déconvolutionner les constantes d&#39;association et de taux de dissociation en traçant k obs contre la concentration mantATP (par exemple, la figure 3C). Monter ces données à une fonction linéaire (c&#39;est-à-obs k = k 1 [mantATP] + k-1) pour obtenir le point d&#39;intersection de la pente et de l&#39;axe y. La pente représente la constante de vitesse d&#39;association mantATP (figure 1, k 1), les unités M -1 s -1. L&#39;ordonnée représente la constante de vitesse de dissociation (Figure 1, k -1) avec des unités de s -1 (voir la discussion). Remarque: Cette approche peut également être appliquée pour déterminer l&#39;association et la dissociation ADPLes constantes de vitesse de la figure 1 (k, k 4 et -4) en utilisant mantADP comme le nucléotide. </li></ol> 3 Mesure de la vitesse constante de dissociation pour mantADP <ol><li> A une solution de 2 uM de kinésine dans un tampon de réaction approprié (par exemple, 80 mM de PIPES pH6.9, 1 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% de Tween 20), ajouter 50 uM mantADP (concentration finale). </li><li> Incuber à 25 ° C pendant 30 min. </li><li> Enlever l&#39;excès de mantADP et d&#39;autres nucléotides libres par tampon échanger la kinésine dans le tampon de réaction choisie en utilisant une colonne de Sephadex G-25 (voir la liste des matériaux) selon les instructions du fabricant. Le domaine moteur de la kinésine devrait maintenant être chargé avec mantADP. </li><li> Régler la longueur d&#39;onde d&#39;excitation sur le fluorimètre stopped-flow à 365 nm et de collecter la lumière émise à&gt; 400 nm en utilisant un filtre passe-long. </li><li> Mélanger le complexe mantADP.kinesin (~ 1 uM) avec un facteur 50 ou plus molar excès d&#39;ATP non marqué dans un rapport de 1: 1 v / v à l&#39;aide d&#39;un fluorimètre stopped-flow (Figure 4A et 4B encadré). </li><li> Monter la diminution de l&#39;intensité de fluorescence observée au fil du temps à une fonction exponentielle unique et une ligne de pente négative constante pour tenir compte de photoblanchiment du groupe de Mant (c.-à-fluorescence = A 0 exp (k .t obs) + (m.t + c), où A 0 est l&#39;amplitude, k obs est la constante de vitesse et t est le temps, voir la figure 4B et discussion). Le k obs déterminée à partir de cette forme est la constante de vitesse de dissociation de l&#39;ADP (Figure 1, k 4) avec des unités de s -1 (voir la discussion). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ici, nous présentons des protocoles d&#39;observation et d&#39;analyse de la cinétique de transitions entre états nucléotidiques pour une kinésine. Ces protocoles utilisent la méthode de mélange stopped-flow rapide en conjonction avec des nucléotides marqués par fluorescence. Des procédés de ce type ont été utilisés dans l&#39;étude de liaison nucléotidique et la dissociation pour une variété de kinésines 9-11,13-16. Les méthodes décrites ne permettent pas l&#39;observation de la libération de phosphate (Figure 1, étape 3). Cependant, stopped-flow fluorescence peut être utilisée pour observer la transition en utilisant une protéine phosphate de détection de couple de la production de phosphate à un changement d&#39;intensité de fluorescence 17. Les méthodes présentées nucleotides marqués d&#39;utilisation avec le petit methylanthraniloyl fluorophore (d&#39;mant), qui présentent généralement une augmentation de l&#39;intensité de fluorescence lorsqu&#39;il est lié à la protéine. En outre, le fluorophore mant, lorsqu&#39;ils sont conjugués soit à la position 2 &#39;ou 3&#39; de la ribose, a souvent peu ou pas d&#39;effet sur ​​la liaison, dissociation ou hydrolyse du nucléotide 9-12. Nucléotides Mant-étiquetés sont facilement disponibles auprès de sources commerciales (voir la liste des matériaux) et sont fournis sous forme de mélanges de 2 &#39;et 3&#39; conjugué comme ils ont rapidement rééquilibrer lorsqu&#39;il est purifié à un seul isomère 8. nucléotides de Mant marqué font d&#39;excellents molécules reporters qui la cinétique de nucléotides de liaison et de dissociation peuvent être observées. L&#39;utilisation de nucleotides marqués par fluorescence signifie que la lecture sur les essais décrits est un véritable changement dans le temps de l&#39;intensité de fluorescence. Cela rend idéal pour ces dosages fluorescence stopped-flow, ce qui permet un mélange rapide des réactifs et observation du temps réel de variations de fluorescence associées à la réaction suivante. La combinaison de l&#39;arrêt d&#39;écoulement comme la technique de mélange et de la fluorescence en tant que procédé de détection produit un système qui est relativement ef échantillonficient. Par exemple, afin d&#39;acquérir des données représentées sur la figure 3C nécessite 0,8 à 1,0 mg de kinésine-13 purifiée, MCAK, et d&#39;acquérir les données de la Figure 4B nécessite ~ 0,3 mg de kinésine-13 purifiée, MCAK. Un inconvénient de l&#39;utilisation d&#39;mant comme un fluorophore est qu&#39;il est sujet à des photoblanchiment. Ceci peut être observé de manière isolée à partir de kinésine cinétique de réaction en mélangeant une solution du nucléotide marqué mant avec le tampon de réaction, en l&#39;absence de kinésine, dans la stopped-flow. Une diminution lente de l&#39;intensité de fluorescence est observé que le groupe de formants est blanchie. Sur la plage des échelles de temps utilisées dans les protocoles photoblanchiment du groupe mant décrites est bien décrite par une fonction linéaire. Par conséquent, un moyen simple de corriger les données de photoblanchiment est de s&#39;adapter à une fonction exponentielle avec une ligne de base décrite par une fonction linéaire (c.-à-c + m) au lieu de la ligne de base plus plat commun, décrit par un seul paramètre. liaison mantATP Lors de la mesure des constantes de vitesse d&#39;association et de dissociation de mantATP (Section 2) l&#39;ADP, qui reste associé avec le site de liaison nucléotidique kinésine en l&#39;absence de microtubules, doit être retiré. Cela permet association mantATP et dissociation (Figure 1, étape 1) à observer dans l&#39;isolement de la dissociation ADP. Pour atteindre cet objectif la kinésine est incubé avec au moins un excès de 50 fois de l&#39;EDTA sur les sites de liaison de nucleotides (étape 2.1). L&#39;EDTA séquestre des ions Mg 2 + provoque Mg2 + se dissocier de la poche de nucléotides contraignant, ce qui entraîne la libération du nucléotide 11. Par conséquent, lors de la réalisation étapes 2.1 à 2.3, il est essentiel d&#39;utiliser un tampon sans Mg 2 +. La protéine kinésine libre nucléotide est un échange de tampon pour séparer les deux de nucléotide libre et de l&#39;EDTA. Pour réaliser cette séparation, un ge d&#39;écoulement par gravité jetablecolonne l de filtration est suffisante et il est simple et rapide à utiliser (voir la liste des matériaux). L&#39;interaction avec les nucléotides de la kinésine mantATP libre est réalisé à une gamme de concentrations mantATP (étape 2.4) pour permettre une déconvolution des constantes d&#39;association et de dissociation (taux étape 2.8). La théorie derrière expériences de ce type est bien décrit dans la référence 18 Dans l&#39;exercice de ces expériences, on commence avec la plus faible concentration de mantATP. Cela supprime la nécessité d&#39;étapes de lavage entre les différentes concentrations. Il sera probablement nécessaire d&#39;ajuster la sensibilité du fluorimètre stopped-flow que la concentration mantATP est augmentée. La concentration mantATP doit toujours être au moins 5 fois plus élevées que sur la concentration des sites de liaison kinésine nucléotidiques de maintenir pseudo conditions de premier ordre. Toutefois, comme la concentration de mantATP est augmentée, le changement de signal peut devenir submergé comme la fraction de nucléotides qui se lie à la kinésine diminue. Therefore, la concentration de la kinésine est également augmentée pour chaque nouvelle concentration de mantATP de telle sorte que la concentration de mantATP n&#39;est jamais plus grande que l&#39;excès molaire de 10 fois plus de sites de liaison de nucleotides (étape 2.6). mantADP dissociation Bien que les constantes d&#39;association et de taux de dissociation pour mantADP peuvent être déterminées par la méthode décrite pour mantATP (Section 2). La dissociation de l&#39;ADP à partir d&#39;une kinésine peut être directement observé par le préchargement du site de liaison nucléotidique de mantADP (étapes 3.1 à 3.3) Le complexe mantADP.kinesin est ensuite mélangée avec un excès d&#39;ATP non marqué (étape 3.5). L&#39;excédent non marqué ATP empêche reconsolidation de mantADP à la kinésine et permet ainsi la réaction de dissociation (Figure 1, k 4) à observer dans l&#39;isolement de l&#39;association de mantADP. Dans cet essai, la concentration de l&#39;ATP non marqué doit être d&#39;au moins un excès molaire de 50 fois de nucleotide sites de liaison. La théorie derrière ce test est bien décrit dans la référence 18 Cette méthode directe donne une valeur plus précise de la constante de vitesse de l&#39;extrapolation à l&#39;axe des y décrit à l&#39;étape 2.8 dissociation. Inclusion des microtubules Les méthodes décrites peuvent également être utilisées pour déterminer la cinétique de liaison et la dissociation nucléotidique en présence de microtubules. Les microtubules sont introduits à la seringue contenant nucleotide avant le mélange dans la stopped-flow: la seringue inférieur sur la figure 3B et 4B (Encarts). Dans cette configuration, la kinésine rencontrera le nucléotide en même temps qu&#39;il remplit les microtubules. Microtubules stabilisés sont utilisés, où la durée de vie du polymère de la tubuline est prolongée par l&#39;utilisation soit d&#39;un stabilisant chimique, tel que le taxol ou un analogue de GTP non-hydrolysable, tels que la guanosine-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] triphosphate (GMPCPP, voir la liste des matériaux). Il est possible d&#39;utiliser deux cycles de polymérisation de la tubuline avec GMPCPP faire microtubules qui peuvent être stockés pendant de nombreux mois à 9,19 d&#39;azote liquide. L&#39;utilisation de microtubules préparés à l&#39;avance permet de réduire considérablement les difficultés pratiques rencontrées dans l&#39;exécution de ces tests. Pour inclure des microtubules dans les essais, il est important d&#39;utiliser un tampon de réaction approprié pour la stabilité des microtubules. Le tampon de choix est TUYAUX base, avec le tampon le plus couramment utilisé contenant 80 mM PIPES pH 6,9, MgCl2 1 mM et 1 mM d&#39;EGTA (connu sous le nom BRB80) 20,21. Les procédés décrits ne sont pas limités à une utilisation avec des kinésines, mais peuvent être adaptées et appliquées à n&#39;importe quelle protéine de liaison nucléotidique. Par exemple, des procédés similaires ont été appliqués pour le cycle de renouvellement de l&#39;ATP des membres de la famille de la myosine de moteurs moléculaires 12,22 et l&#39;utilisation de nucleotides marqués mant de guanosine s&#39;étend en outreméthodes de ce type de GTP hydrolyser les protéines 23,24.

Les kinésines sont une superfamille de protéines caractérisées par un domaine moteur hautement conservée 1. Le domaine moteur de la kinésine interagit avec les microtubules d'une manière dépendant de nucléotides. Les membres de la famille de kinésine affichent une gamme de fonctions de kinésines translocation, qui transportent des marchandises d'une manière dirigée le long des microtubules, à kinésines finaux de liaison non-translocation microtubules, qui régissent la dynamique des microtubules 2,3. Kinésines utilisent le chiffre d'affaires de adensosine-5'-triphosphate (ATP) pour réguler leur interaction avec le cytosquelette de microtubules 4-6. La conformation du domaine moteur de la kinésine et donc son affinité pour les microtubules dépend de son état ​​de nucléotides: ATP, ADP, ou ADP.Pi aucun nucleotide peuvent être liés (figure 1). Pour comprendre le mécanisme moléculaire d'une kinésine, une compréhension de la relation entre le chiffre d'affaires de l'ATP et de l'interaction des microtubules est nécessaire. Lerefore, un objectif majeur dans le domaine de la kinésine est de caractériser les propriétés fonctionnelles de différents états de nucleotides et la cinétique de la transition entre les deux, en présence et en l'absence de microtubules. <img alt="Figure 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg"> Figure 1: Le plus simple du cycle de renouvellement de l'ATP pour une kinésine se compose de quatre états possibles: (Φ) gratuit nucléotides, liée à l'ATP, ADP.P i liØes et l'ADP lié Chacun des quatre transitions se caractérise par un avant et. constante vers l'arrière de taux (k x et k-x respectivement). Pour comprendre comment le cycle de produit chimique de renouvellement de l'ATP est couplée au cycle de l'interaction mécanique des microtubules, il faut déterminer quelle étape dans le cycle de renouvellement de l'ATP est la limitation de débit en l'absence de Microtubules et ensuite déterminer comment le cycle est modifié par la présence de microtubules. Le plus simple cycle de renouvellement de l'ATP se compose de quatre étapes chimiques différents: (1) liaison de l'ATP sur le site vide (Φ désigne le site vide, c'est à dire, la kinésine libre nucléotides); (2) le clivage de l'ATP; (3) la dissociation du phosphate et (4) la dissociation ADP (figure 1). L'étape limitant la vitesse règle la constante de vitesse pour la durée du cycle de renouvellement de l'ATP. Par conséquent, afin de déterminer qui est l'étape limitant la vitesse de chacune des transitions individuelles doit être mesuré et comparé à la constante de vitesse pour l'ensemble du cycle. Méthodes pour mesurer le chiffre d'affaires de l'ATP constante du taux global de cycle ne sont pas décrits ici, mais peuvent être trouvés dans la référence 7 Ici, nous décrivons les méthodes par lesquelles les constantes de vitesse pour différentes étapes chimiques peuvent être déterminées. Il existe un certain nombre de méthodes pour étudier les transitions individuelles dans le cycle de rotation d'une protéine nucléotidique d'hydrolyse. Les méthodes présentées ici prennent Advantage des propriétés de nucleotides marqués avec le fluorophore methylanthraniloyl, généralement désigné sous le nom mant, qui présentent un changement de l'intensité de la fluorescence lors de la liaison à la protéine 8. Le groupe de Mant est utilisé parce que sa petite taille signifie que, lorsqu'il est couplé à la ribose (figure 2A), il a généralement peu ou pas d'effet sur ​​la cinétique de liaison nucléotidique ou hydrolyse 9-12. Ici, nous présentons des protocoles décrivant l'utilisation de nucléotides de Mant marqué, en collaboration avec la fluorescence stopped-flow, pour permettre l'observation de nucléotides de liaison et de dissociation dans le cycle de renouvellement de l'ATP d'une kinésine.

<table><tbody><tr><td>2'/3'-(N-méthylanthraniloyl) adénosine-5' triphosphate&nbsp ;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2'/3'-(N-méthylanthraniloyl) adénosine-5'-diphosphate&nbsp ;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>Le sel disodique de l’ATP est fabriqué à une concentration de 100&nbsp ; mM dans 100&nbsp ; mM MgCl2. La concentration doit être vérifiée par absorption à 260&nbsp ; nm (e = 15 400&nbsp ; M-1cm-1). Solution stockée dans des aliquotes à -20&nbsp ; oC.&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0,5&nbsp ; Solution mère M dans l’eau, pH 8,0. DANGER : poudre nocive en cas d’inhalation.</td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&nbsp ; M solution mère dans de l’eau fraîche pour une utilisation le même jour. DANGER : poudre nocive en cas d’inhalation ou de contact avec la peau.</td></tr><tr><td>Colonne NAP-5</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex résine résine</td></tr> gravitaire colonne de filtration <tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>analogue non hydrolysable de GTP</td></tr><tr><td>Fluorimètre à écoulement arrêté&nbsp ;</td><td>Photophysique appliquée</td><td>SX20</td><td>Un fluorimètre avec une certaine plomberie attachée, qui permet de mélanger rapidement les réactifs dans la cuvette d’observation. Permettant ainsi la cinétique des réactions sur des échelles de temps de ~0,1&nbsp ;-&nbsp ; 100&nbsp ; SEC à surveiller.</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de nucléotides stopped-flow fluorescence et marqués d&#39;analyser les chiffre d&#39;affaires cycle atp de kinésines

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

La superfamille des protéines de kinésine de moteur associées aux microtubules part un domaine caractéristique du moteur qui s&#39;hydrolyse à la fois d&#39;ATP et lie les microtubules. Kinésines présentent des différences à travers la superfamille tant en chiffre d&#39;affaires de l&#39;ATP et de l&#39;interaction des microtubules. Ces différences adapter kinésines spécifiques à diverses fonctions telles que le transport de fret, microtubules coulissant, la dépolymérisation des microtubules et la stabilisation des microtubules. Pour comprendre le mécanisme d&#39;action d&#39;une kinésine il est important de comprendre la façon dont le cycle de produit chimique de renouvellement de l&#39;ATP est couplée au cycle de l&#39;interaction mécanique des microtubules. Pour disséquer le cycle de renouvellement de l&#39;ATP, une approche consiste à utiliser des nucléotides marqués par fluorescence de visualiser les différentes étapes du cycle. La détermination de la cinétique de chaque transition de nucleotides dans le cycle de renouvellement de l&#39;ATP permet l&#39;étape de limitation de vitesse ou les étapes du cycle complet de l&#39;identifier. Pour une kinésine, il est important de connaître l&#39;étape limitant la vitesse, àl&#39;absence de microtubules, comme cette étape est généralement accélérée plusieurs milliers de fois lorsque la kinésine interagit avec les microtubules. Le cycle en l&#39;absence de microtubules est ensuite comparé à celui en présence de microtubules pour bien comprendre le cycle de renouvellement de l&#39;ATP de la kinésine. La cinétique de transitions nucléotidiques individuelles sont généralement trop rapide pour observer en mélangeant les réactifs à la main, en particulier en présence de microtubules. Dispositif de mélange rapide, par exemple un fluorimètre stopped-flow, qui permet d&#39;observer la cinétique sur des échelles de temps d&#39;aussi peu que quelques millisecondes, peut être utilisée pour contrôler de telles transitions. Ici, nous décrivons les protocoles dans lesquels un mélange rapide des réactifs par stopped-flow est utilisé en conjonction avec des nucléotides marqués par fluorescence pour disséquer le cycle de renouvellement de l&#39;ATP d&#39;une kinésine.

Une augmentation de l'intensité de fluorescence du groupe de formants est généralement observé lors de la liaison de nucléotide marqué mant à une kinésine. Cependant, l'amplitude de ce changement de signal dépend de la kinésine particulier en question. Par conséquent, il est utile d'effectuer des mesures d'équilibre pour confirmer à la fois la présence et l'amplitude d'un changement d'intensité de fluorescence avant de passer à des essais cinétiques. Spectres de fluorescence Représentant pour mantATP et mantADP, à la fois en solution et en complexe avec la kinésine-13, MCAK, sont présentés dans la figure 2B. Ces données mettent en évidence l'augmentation de l'intensité de fluorescence affichée par les deux mantATP et mantADP lors de la liaison à MCAK. Le changement d'intensité de fluorescence lors de la liaison de nucléotides mant à une kinésine est utilisé pour rendre compte de l'association et de la dissociation des deux ATP et ADP (articles 2 et 3). Dans le cas de MCAK, une différence d'intensité de la fluorescence est observée entre mantATP.kinesin et mantADP.kinesin La figure 3A représente la réaction qui se produit lors du mélange avec mantATP kinésine libre nucléotides. Les données représentatives illustrant l'augmentation de l'intensité de la fluorescence qui se produit lors de la liaison de mantATP à la kinésine-13, MCAK est représenté sur la figure 3B. Les données du type représenté sur la figure 3B sont collectées dans une plage de concentrations mantATP. Une parcelle des constantes de vitesse (k obs) déterminés en fonction de la concentration mantATP est illustré à la figure 3C. Montage de ces données à une fonction linéaire (c'est-à-obs k = k 1 [mantATP] + k-1) permet la déconvolution des constantes de vitesse qui contribuent à k obs (étape 2.8). Par conséquent, permettant de déterminer à la fois l'association et la constante de vitesse de dissociation pour mantATP (Figure 1, k 1 et k -1 respectivement). La figure 4A représente la réaction qui se produit lors du mélange mantADP.kinesin avec un excès d'ATP non marqué. Les données sur la figure 4B montre la diminution de l'intensité de fluorescence observée pour mantADP lors de la dissociation de la kinésine-13, MCAK. En adaptant ces données à une fonction exponentielle (étape 3.6), la constante de vitesse de dissociation de mantADP est déterminée directement. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg"> Figure 2 nucléotides marqués à la methylanthraniloyl fluorophore (de Mant) sont utilisés pour isoler les différentes étapes du cycle de renouvellement de l'ATP. (A) La structure de mantATP montrant la position du fluorophore mant soit conjugué à la position 2 'ou 3' du ribose sur la position (B). Spectres de fluorescence normalisée pour mantATP mantADP et en solution (maxp) et un mantATPd mantADP dans un complexe avec la kinésine MCAK (MATP + MCAK et MADP + MCAK). Les spectres mantATP sont normalisées à la fluorescence au max pour mantATP en solution et les spectres mantADP sont normalisées à la fluorescence au max pour mantADP en solution. Les spectres des nucléotides mant mélangés avec MCAK sont collectées au poste mélange 1 min. La concentration des réactifs et des paramètres fluorimètre sont tels que décrits dans le protocole les étapes 1.1 et 1.2. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg"> Figure 3 La mesure de la constante de vitesse d'association de mantATP. (A) Schéma représentant la réaction qui a lieu après mélange par stopped-flow: mantATP (MATP) se lie au nucléotide sans kinésine. L'intensité de fluorescence des groupes de Mant augmente lors de la liaison de la protéine. (B) variation du signal de fluorescence (noir) observé lors du mélange mantATP (25 M) avec MCAK (5 M nulibre cleotide,). Ces données sont en forme (tirets rouges) à une fonction exponentielle unique et une ligne de pente négative constante, qui représente photoblanchiment du fluorophore mant (voir la discussion) Encart:. Contenu des seringues avant le mélange sur le fluorimètre stopped-flow. (C) Les constantes de vitesse (k obs) déterminées pour la réaction de mantATP avec MCAK libre nucléotides fonction de la concentration de mantATP. Cette parcelle aura une région linéaire avec le gradient étant la constante de vitesse d'association (Figure 1, k 1) avec des unités de M -1 s -1 et l'ordonnée à l'origine est la constante de vitesse de dissociation (figure 1, k-1) avec unités de s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> . Figure 4 Mesure de la constante de vitesse de dissociation pour mantADP (A) Schéma représentant la réaction qui a lieu après mélange par stopped-flow: kinésine préchargé avec mantADP est dilué dans un excès d'ATP non marqué. Dissocier mantADP est remplacé par non marqué ATP, empêchant ainsi la réaction inverse d'association mantADP (voir la discussion). L'intensité de fluorescence du groupe de formants diminue lors de la dissociation de la protéine. Diminution (B) de fluorescence observé sur la dissociation de la kinésine à partir de mantADP MCAK. Le signal de fluorescence (noir) est apte (tirets rouges) à une seule exponentielle et une ligne de pente négative constante pour tenir compte de photoblanchiment du groupe de Mant (voir la discussion). La constante de vitesse déterminée est la constante de vitesse de dissociation de mantADP (Figure 1, k4) En médaillon:.. Contenu des seringues avant de les mélanger sur un fluorimètre à flux arrêté <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les kinésines sont caractérisées par une interaction dépendant de nucléotides avec les microtubules: un cycle de renouvellement de l&#39;ATP couplée à un cycle d&#39;interaction des microtubules. Ici, nous décrivons les protocoles d&#39;analyser la cinétique de la transition de nucleotides individuels dans le cycle de renouvellement de l&#39;ATP à l&#39;aide d&#39;une kinésine nucleotides marqués par fluorescence et la fluorescence stopped-flow.

L&#39;utilisation de nucléotides stopped-flow fluorescence et marqués d&#39;analyser les Chiffre d&#39;affaires Cycle ATP de kinésines

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

L’objectif général de cette procédure est de mesurer la cinétique de liaison et de dissociation des nucléotides au cours du cycle de renouvellement A TP d’une kinésine. Ceci est accompli en préparant d’abord la protéine kinésine, soit exempte de nucléotide, soit chargée de nucléotide marqué par fluorescence. Ensuite, la kinésine préparée est mélangée avec un nucléotide à l’aide d’un fluorimètre à flux arrêté et le changement de fluorescence associé à la liaison ou à la dissociation du nucléotide marqué par fluorescence est observé.Ensuite, la variation de fluorescence est ajustée à une fonction exponentielle pour obtenir une constante de vitesse. Enfin, les constantes de vitesse mesurées sont décentralisées et les constantes de vitesse sont attribuées à des transitions particulières du cycle de rotation d’A TP. En fin de compte, la combinaison d’un nucléotide marqué par fluorescence et d’une fluorescence à flux arrêté est utilisée pour mesurer la cinétique de liaison et de dissociation des nucléotides.Jennifer Patel, postdoctrice, et Hannah Belch, une étudiante diplômée de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Après avoir déterminé l’intensité de fluorescence de la kinésine lors de la liaison du nucléotide marqué par l’homme, comme indiqué dans le protocole de texte, à une solution de jusqu’à 20 micromolaires de kinésine dans un tampon sans magnésium à un millimolaire d’EDTA et un millimolaire de DTT, incubez la solution pendant 15 minutes à 25 degrés Celsius, mettez en place une colonne de filtration sur gel G 25 SX à écoulement gravitaire et équilibrez avec au moins trois volumes de colonne d’un tampon. Chargez ensuite la solution d’essin dans la colonne pour séparer les nucléotides libres et l’EDTA de la kinésine.Réparez un tube collecteur en ajoutant un volume de 100 millimolaires de solution de chlorure de magnésium dans le tube vide, de sorte que la concentration finale de chlorure de magnésium soit d’un millimolaire. Après le prélèvement de la solution de kinésine, l’utilisation d’un tampon sans magnésium approprié élue rapidement la kinésine. La présence de chlorure de magnésium dans le tube de collecte aide à stabiliser la kinésine immédiatement après Ian de la colonne, stocke la kinésine sur de la glace et l’utilise dans les une à deux heures.En attendant, préparez un homme une série de concentration TP. Choisissez la plage de concentrations en fonction de la concentration disponible de kinésine. Pour chaque concentration de mant un TP, préparez une concentration appropriée de kinésine de sorte que le nucléotide marqué par l’homme soit en excès molaire de cinq à dix fois supérieur aux sites de liaison des nucléotides de kinésine.Réglez la longueur d’onde d’excitation sur le fluorimètre à flux arrêté, les 365 nanomètres et la longueur d’onde d’émission supérieure à 400 nanomètres avec un filtre passe-long. Ensuite, en commençant par la concentration la plus faible de Manta TP, utilisez le fluorimètre à flux arrêté pour mélanger le Manta TP et la kinésine sans nucléotides dans un rapport volume-volume un pour un. À l’aide de la formule suivante, ajustez la mesure de la variation de l’intensité de fluorescence pour enseigner la concentration de mant A TP à une fonction exponentielle, plus une ligne de pente négative constante pour tenir compte du photoblanchiment du groupe mant.À partir de ces ajustements, déterminez une constante de vitesse à chaque concentration de mant. Un TP dégrade ensuite les taux d’association et de dissociation en utilisant la soie dentaire en fonction de la concentration de mant. A TP Ajustez ensuite ces données à une fonction linéaire pour obtenir le gradient et l’ordonnée à l’origine de l’axe y.Le gradient représente la constante de vitesse pour l’homme, une association TP avec des unités par molaire par seconde. L’ordonnée à l’origine représente la constante du taux de dissociation avec les unités par seconde. Pour mesurer la vitesse constante de dissociation, faites fermenter un DP dans une solution de deux kinésines micromolaires dans un tampon approprié à 50.Micromolaire signifiait un incubateur DP à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir utilisé une colonne Sedex G 25 pour éliminer le fre mant, A DP de la kinésine, chargé avec le mant A DP, et réglé le fluter d’arrêt comme décrit précédemment dans cette vidéo, utilisez le flux arrêté pour mélanger le complexe mant A DP Kinine avec un excès molaire de 50 fois ou plus de A TP non étiqueté dans un ajustement de rapport volume/volume un à un. La diminution de l’intensité de fluorescence observée au fil du temps à une seule fonction exponentielle, plus une ligne de pente négative constante pour permettre le photoblanchiment du groupe.Le kops déterminé à partir de cet ajustement est la constante de vitesse pour la dissociation de mant A DP avec des unités de par seconde. L’amplitude du changement de signal lors de la liaison ou de la dissociation d’un nucléotide de bois de manteau dépend de la kinésine particulière. Par conséquent, il est utile d’effectuer d’abord des mesures d’équilibre pour confirmer à la fois la présence et l’amplitude d’un changement d’intensité fluorescente.Les spectres fluorescents fermentent un TP et signifient un DP à la fois en solution et en complexe de la kinésine M CAC sont montrés ici. Cette figure représente la réaction qui se produit lors du mélange d’un TP avec de la kinésine sans nucléotides. L’augmentation de l’intensité de fluorescence qui se produit lors de la liaison de l’homme A TP à M CAC est illustrée ici, en ajustant la constante de vitesse par rapport à l’homme.Une concentration de TP en une fonction linéaire, comme on le voit ici, permet la déconvolution de la constante de vitesse qui contribue à kops et fournit la position de taux d’association et de dissociation du ferment A TP. Cette figure montre la diminution de l’intensité de fluorescence observée dans le ferment A DP lors de la dissociation de M CEC, comme illustré ici. La constante de vitesse pour la dissociation de la DP de mant A de la kinésine est déterminée en ajustant ces données à une fonction exponentielle. Une fois maîtrisés, ces protocoles peuvent chacun être réalisés en moins de trois heures.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la kinésine, elle peut également être appliquée à d’autres protéines de liaison aux nucléotides, telles que la myosine et les protéines G. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser des nucléotides marqués par fluorescence et un débitmètre d’arrêt pour mesurer la cinétique de liaison et de dissociation des nucléotides pour une kinésine.

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