Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie In Vivo

L’objectif global de cette procédure est de marquer les neurones sensoriels olfactifs in vivo pour visualiser la morphologie et le développement axonaux. Ceci est accompli en examinant d’abord le dextran couplé à la fluorure quatre dans des neurones sensoriels olfactifs uniques. La deuxième étape consiste à attendre 24 heures pour permettre au colorant de se propager dans les processus axonaux des neurones sensoriels.

Ensuite, un têtard est anesthésié et une pile d’images tridimensionnelles du bulbe olfactif est acquise à l’aide de la microscopie multiphotonique. La dernière étape consiste à examiner à plusieurs reprises le neurone marqué chez le même animal après des intervalles de temps spécifiés. En fin de compte, la reconstruction de la morphologie cellulaire permet de visualiser les changements dans la morphologie axonale.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la façon dont les axones se développent vers les régions cibles du cerveau antérieur et comment les synapses se forment. Avant l’expérience. Assurez-vous que l’installation d’électroporation se compose d’un stéréomicroscope avec une grande distance de travail et qu’elle est équipée d’un éclairage fluorescent et de jeux de filtres pour le colorant.

Utilisé pour l’électroporation, utilisez soit une électroporation à cellule unique dédiée, soit un générateur d’impulsions carrées générique fixé à un oscilloscope. Connectez les sorties d’électroporation à un porte-pipette et à une électrode de bain. Assurez-vous que le support de pipette et l’électrode du bain contiennent des fils d’argent recouverts d’une fine couche de chlorure d’argent.

Ensuite, montez le support de pipette sur un micro-manipulateur pour permettre un positionnement précis. Après cela, fabriquez les micro-pipettes pour l’électroporation avec des capillaires en verre de silicate avec un filament interne. Réglez les paramètres de la micro-pipette polaire pour produire une tige plus longue et une micro-pipette à ouverture de pointe plus petite avec une résistance élevée pour l’électroporation de cellules uniques.

Mesurez ensuite la résistance de la pipette directement à l’aide de la cellule unique électroporée dédiée. Dans cette procédure, dissoudre le fluoro quatre couplé au dextran dans la bague de grenouille à une concentration de trois millimolaires. Divisez cette solution mère en petites aliquotes et conservez celle pour une utilisation future au congélateur.

Ensuite, remplissez la micropipette avec un à cinq microlitres de solution de dextran. Tournez délicatement la micro-pipette pour éliminer les bulles d’air résiduelles de la pointe de la pipette. Montez ensuite la micro-pipette dans le support de pipette.

Assurez-vous que le fil d’argent à l’intérieur de la pipette est en contact avec la solution de colorant. Maintenant, placez un petit morceau de tissu dans une boîte de Pétri et couvrez-le d’une petite quantité d’eau contenant 0,02 % de trica. Ensuite, anesthésez un têtard pré-métamorphique dans l’eau contenant 0,02 % de trica.

Confirmez la bonne anesthésie en le touchant et en vous assurant qu’il ne répond pas. Ensuite, transférez soigneusement le têtard dans la boîte de Pétri recouverte de tissu. Assurez-vous que l’électrode est en contact avec le tissu humide et positionnez la pointe de la micropipette près de l’organe olfactif du têtard à l’aide d’un micromanipulateur.

Après cela, pénétrez la peau recouvrant l’organe olfactif. Avec la pointe de la pipette, avancez prudemment la pointe dans la couche neuronale sensorielle centrale de l’épithélium olfactif principal ou de l’épithélium nasal MRO. Déclenchez maintenant les impulsions de tension carrées positives afin de transférer le colorant dans les neurones sensoriels en appliquant un seul pôle de tension ou des trains de plusieurs impulsions.

Visualisez ensuite le succès de l’extrusion et de l’électroporation du colorant à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence. Le colorant se répand rapidement dans le corps cellulaire et les dendrites après une électroporation réussie. Après avoir répété les procédures pour le deuxième organe olfactif du têtard, transférez le têtard dans un bécher rempli d’eau douce pour la récupération et laissez le colorant électroporé se propager aux neurones sensoriels et au bulbe olfactif.

Au moins 24 heures après l’électroporation, anesthésier le têtard dans l’eau contenant 0,02 % de trica. Ensuite, transférez soigneusement le têtard dans une chambre d’imagerie. Découpez un petit rectangle dans une bande de param.

Couvrez ensuite le têtard avec le param, en laissant le céphalon antérieur de la queue à travers la fenêtre découpée. Fixez le paramètre avec des aiguilles sur le plat sans blesser le têtard et assurez-vous que le têtard est immergé dans suffisamment d’eau contenant 0,02 % de Trica. Montez ensuite la chambre d’imagerie sur la platine d’un microscope multiphotonique droit ou d’un microscope confocal.

Acquérir une pile tridimensionnelle d’images du bulbe olfactif et s’assurer que la procédure d’imagerie ne dépasse pas 10 à 15 minutes. Après cela, remettez le têtard dans l’eau normale dans un réservoir séparé et empêchez-le d’être exposé à la lumière. Sur cette image, quatre brins de pont couplés à différents fluoro quatre ont été électroporés à quatre endroits éloignés de l’organe olfactif, latéral indiqué par le vert, intermédiaire indiqué par le jaune, médial indiqué par le rouge et l’organe nasal du vomer indiqué par l’orange.

Cela permet de visualiser le bulbe olfactif accessoire et les trois principaux champs de projection du bulbe olfactif principal. Cette image montre des reconstructions tridimensionnelles de différents modèles de croissance axonale de neurones sensoriels olfactifs uniques superposés à la structure du bulbe olfactif, et voici un exemple d’un seul axone de neurone sensoriel olfactif se projetant dans le bulbe olfactif et formant une arborisation touffue en glomérulaire sphérique. Comme on le voit ici dans Opus Levu, ces axones bifurquent régulièrement avant de se connecter à un, deux ou plusieurs gmer.

Il s’agit d’un exemple représentatif d’un neurone sensoriel olfactif individuel étudié à plusieurs reprises par imagerie time lapse in vivo montrant des changements continus dans la morphologie axonale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer les neurones sensoriels olfactifs par électroporation et de suivre leur développement à l’aide de l’imagerie TimeLapse in vivo.