Méthodes de transfection des neurones
La transfection, soit le transfert de matériel génétique dans des cellules de mammifères, est un outil précieux qui permet aux scientifiques de manipuler génétiquement les neurones et le tissu neuronal. Les propriétés uniques de ces cellules fragiles rendent la transfection difficile, d’où le besoin de techniques spécialisées. Cette vidéo passera en revue les principes de la transfection de neurones, et présentera des techniques couramment utilisées sur ces cellules, y compris la nucléofection, la transfection biolistique, et la transduction virale. Enfin, nous aborderons l'utilisation de techniques de transfection dans la cellule et la recherche en neuroscience moléculaire.
Commençons par examiner la façon dont fonctionne la transfection. Bien que le matériel génétique puisse être fourni à proximité d'une cellule en culture en l'ajoutant au milieu environnant, les nucléotides ne peuvent pas pénétrer efficacement les membranes cellulaires.
Tous les protocoles de transfection sont conçus pour permettre au matériel génétique de contourner cet obstacle. Les nucléotides qui bloquent la production de protéines, comme l’ARN interférent, peuvent immédiatement remplir leur fonction lorsqu'ils pénètrent dans le cytoplasme. Cependant, les constructions à base d'ADN doivent être apportées dans le noyau pour la traduction, avant que la synthèse des protéines ne puisse commencer. Dans les cellules en division, la rupture de l'enveloppe nucléaire pendant la mitose peut entrainer l'incorporation d'ADN transfecté dans le noyau en formation des cellules-filles. Mais vu que la plupart des neurones en culture sont des cellules post-mitotiques – ou qui ne se divisent plus - des protocoles de transfection spécialisés sont nécessaires pour réussir à induire l'expression d’un gène.
Passons en revue ces protocoles en commençant par la nucléofection. Cette technique combine l’utilisation d’un champ électrique induit et de réactifs chimiques, qui agissent ensemble pour créer des structures semblables à des pores transitoires au niveau des membranes cellulaires et nucléaires. Puisque les nucléotides sont polarisés, le champ électrique entraîne également le passage d'ADN à travers les pores.
Pour mener à bien cette procédure, les neurones en suspension sont recueillis dans un pellet par centrifugation, avant d'être remis en suspension dans le réactif commercial de nucléofection. Le mélange cellulaire est ensuite combiné avec de l'ADN purifié, et transféré dans une cuvette d'électroporation, qui contient deux plaques d'aluminium qui entrent en contact électrique avec l'équipement du Nucléofacteur. Ce dispositif délivre une série d'impulsions électriques rapides, dont le nombre et la durée sont adaptés en fonction du type de cellule. Après nucléofection, les cellules peuvent être diluées dans un milieu de culture et mises en plaques pour une croissance continue.
La technique par canon à ADN, quant à elle, passe les barrières de la transfection en tirant des billes portant du matériel génétique à travers les membranes cellulaires et nucléaires.
Pour faire des billes pour canon à ADN, l'ADN codant votre gène d'intérêt est précipité sur des microbilles, généralement composées d'or. Après une incubation de 10 minutes, les billes sont lavées et transférées dans des tubes. Les tubes sont ensuite mis en rotation afin de sécher la solution, entrainant le revêtement uniforme des billes. Ensuite, les tubes sont coupés en cartouches et chargés dans le canon. La livraison du matériel génétique, alimentée au gaz, peut être effectuée sur des cellules mises en culture en plaque standard par une simple pression de la détente.
Enfin, la transduction virale tire parti du cycle de vie viral pour apporter du matériel génétique étranger dans le noyau. L'ARN codant pour le gène d'intérêt est emballé dans des rétrovirus modifiés appelés vecteurs lentivirus, qui peuvent pénétrer dans les cellules cibles en se liant à des protéines membranaires spécifiques, déclenchant un événement de fusion membranaire. L'ARN viral est ensuite inversement transcrit en un brin d'ADN complémentaire qui est transporté dans le noyau.
Avant de commencer cette procédure, notez que les virus peuvent infecter les cellules de votre corps aussi bien que celles de vos cultures, il est donc extrêmement important de suivre les directives de sécurité.
La première étape consiste à générer les particules lentivirales portant votre gène d'intérêt. Ceci est réalisé en exprimant les blocs de construction du virus dans une lignée cellulaire humaine optimisée pour la production virale, comme des cellules 293T. Pour éviter la propagation indésirable des virus modifiés, les gènes nécessaires à leur assemblage sont conservés séparément du vecteur de transfert, dont la séquence est incluse dans la particule infectieuse. Il faut compter environ deux jours pour que les virus entièrement assemblés soient libérés dans le milieu de culture, où ils peuvent être recueillis et concentrés par ultracentrifugation. Ensuite, la concentration appropriée, ou titre, de virus est déterminée par l'évaluation de la réussite de transduction dans une lignée cellulaire test. Le vecteur lentiviral est ensuite ajouté à la culture neuronale cible et incubé pendant 24 à 48 heures pour s’assurer que l'infection a eu lieu.
Maintenant que vous êtes familier avec les techniques classiques de transfection, celle que vous utiliserez dépendra des objectifs spécifiques de vos expériences. Regardons quelques exemples.
Pour commencer, l'observation de la maturation des neurones en culture permet une analyse détaillée des changements morphologiques importants pour la connectivité neuronale, comme la formation des épines dendritiques. Pour visualiser la morphologie des cellules au fil du temps, ces chercheurs ont utilisé la nucléofection afin d’apporter une protéine fluorescente dans des neurones en culture. Ici, une protéine de tubuline marquée par fluorescence a été transfectée dans un groupe de cellules, permettant des analyses détaillées des processus cellulaires par microscopie de fluorescence. Puisque les niveaux d'expression ont été maintenus pendant toute la durée de vie du neurone, l’analyse morphologique peut être effectuée en culture pendant au moins un mois.
La transfection peut aussi être utilisée pour tester les effets de mutations génétiques spécifiques sur les fonctions neuronales. On peut employer un canon à ADN pour fournir de l'ADN codant pour la version de type sauvage ou mutante d’une protéine, et les impacts à court terme sur la biologie cellulaire peuvent être évalués, par exemple par enregistrement « patch-clamp» des décharges neuronales.
Enfin, une stratégie classique pour tester la fonction d'un gène est d'observer ce qui se passe dans les cellules lorsque son expression est bloquée. Pour ces expériences, les vecteurs lentiviraux peuvent être utilisés pour délivrer des constructions d'ARN interférent, qui empêchent la synthèse des protéines. Dans cette expérience, le blocage de gènes associés à la maladie de Parkinson conduit à une diminution significative de la viabilité cellulaire.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la transfection de neurones. Dans cette vidéo nous avons présenté les principes de la transfection de neurones ainsi que les procédures et applications de trois techniques classiques de transfection. Merci de nous avoir regardés!
La transfection, le transfert de matériel génétique dans des cellules, est un outil précieux pour la manipulation rapide et efficace de l’expression d…
La transfection, soit le transfert de matériel génétique dans des cellules de mammifères, est un outil précieux qui permet aux scientifiques de manipuler génétiquement les neurones et le tissu neuronal. Les propriétés uniques de ces cellules fragiles rendent la transfection difficile, d’où le besoin de techniques spécialisées. Cette vidéo passera en revue les principes de la transfection de neurones, et présentera des techniques couramment utilisées sur ces cellules, y compris la nucléofection, la transfection biolistique, et la transduction virale. Enfin, nous aborderons l'utilisation de techniques de transfection dans la cellule et la recherche en neuroscience moléculaire.
Commençons par examiner la façon dont fonctionne la transfection. Bien que le matériel génétique puisse être fourni à proximité d'une cellule en culture en l'ajoutant au milieu environnant, les nucléotides ne peuvent pas pénétrer efficacement les membranes cellulaires.
Tous les protocoles de transfection sont conçus pour permettre au matériel génétique de contourner cet obstacle. Les nucléotides qui bloquent la production de protéines, comme l’ARN interférent, peuvent immédiatement remplir leur fonction lorsqu'ils pénètrent dans le cytoplasme. Cependant, les constructions à base d'ADN doivent être apportées dans le noyau pour la traduction, avant que la synthèse des protéines ne puisse commencer. Dans les cellules en division, la rupture de l'enveloppe nucléaire pendant la mitose peut entrainer l'incorporation d'ADN transfecté dans le noyau en formation des cellules-filles. Mais vu que la plupart des neurones en culture sont des cellules post-mitotiques – ou qui ne se divisent plus - des protocoles de transfection spécialisés sont nécessaires pour réussir à induire l'expression d’un gène.
Passons en revue ces protocoles en commençant par la nucléofection. Cette technique combine l’utilisation d’un champ électrique induit et de réactifs chimiques, qui agissent ensemble pour créer des structures semblables à des pores transitoires au niveau des membranes cellulaires et nucléaires. Puisque les nucléotides sont polarisés, le champ électrique entraîne également le passage d'ADN à travers les pores.
Pour mener à bien cette procédure, les neurones en suspension sont recueillis dans un pellet par centrifugation, avant d'être remis en suspension dans le réactif commercial de nucléofection. Le mélange cellulaire est ensuite combiné avec de l'ADN purifié, et transféré dans une cuvette d'électroporation, qui contient deux plaques d'aluminium qui entrent en contact électrique avec l'équipement du Nucléofacteur. Ce dispositif délivre une série d'impulsions électriques rapides, dont le nombre et la durée sont adaptés en fonction du type de cellule. Après nucléofection, les cellules peuvent être diluées dans un milieu de culture et mises en plaques pour une croissance continue.
La technique par canon à ADN, quant à elle, passe les barrières de la transfection en tirant des billes portant du matériel génétique à travers les membranes cellulaires et nucléaires.
Pour faire des billes pour canon à ADN, l'ADN codant votre gène d'intérêt est précipité sur des microbilles, généralement composées d'or. Après une incubation de 10 minutes, les billes sont lavées et transférées dans des tubes. Les tubes sont ensuite mis en rotation afin de sécher la solution, entrainant le revêtement uniforme des billes. Ensuite, les tubes sont coupés en cartouches et chargés dans le canon. La livraison du matériel génétique, alimentée au gaz, peut être effectuée sur des cellules mises en culture en plaque standard par une simple pression de la détente.
Enfin, la transduction virale tire parti du cycle de vie viral pour apporter du matériel génétique étranger dans le noyau. L'ARN codant pour le gène d'intérêt est emballé dans des rétrovirus modifiés appelés vecteurs lentivirus, qui peuvent pénétrer dans les cellules cibles en se liant à des protéines membranaires spécifiques, déclenchant un événement de fusion membranaire. L'ARN viral est ensuite inversement transcrit en un brin d'ADN complémentaire qui est transporté dans le noyau.
Avant de commencer cette procédure, notez que les virus peuvent infecter les cellules de votre corps aussi bien que celles de vos cultures, il est donc extrêmement important de suivre les directives de sécurité.
La première étape consiste à générer les particules lentivirales portant votre gène d'intérêt. Ceci est réalisé en exprimant les blocs de construction du virus dans une lignée cellulaire humaine optimisée pour la production virale, comme des cellules 293T. Pour éviter la propagation indésirable des virus modifiés, les gènes nécessaires à leur assemblage sont conservés séparément du vecteur de transfert, dont la séquence est incluse dans la particule infectieuse. Il faut compter environ deux jours pour que les virus entièrement assemblés soient libérés dans le milieu de culture, où ils peuvent être recueillis et concentrés par ultracentrifugation. Ensuite, la concentration appropriée, ou titre, de virus est déterminée par l'évaluation de la réussite de transduction dans une lignée cellulaire test. Le vecteur lentiviral est ensuite ajouté à la culture neuronale cible et incubé pendant 24 à 48 heures pour s’assurer que l'infection a eu lieu.
Maintenant que vous êtes familier avec les techniques classiques de transfection, celle que vous utiliserez dépendra des objectifs spécifiques de vos expériences. Regardons quelques exemples.
Pour commencer, l'observation de la maturation des neurones en culture permet une analyse détaillée des changements morphologiques importants pour la connectivité neuronale, comme la formation des épines dendritiques. Pour visualiser la morphologie des cellules au fil du temps, ces chercheurs ont utilisé la nucléofection afin d’apporter une protéine fluorescente dans des neurones en culture. Ici, une protéine de tubuline marquée par fluorescence a été transfectée dans un groupe de cellules, permettant des analyses détaillées des processus cellulaires par microscopie de fluorescence. Puisque les niveaux d'expression ont été maintenus pendant toute la durée de vie du neurone, l’analyse morphologique peut être effectuée en culture pendant au moins un mois.
La transfection peut aussi être utilisée pour tester les effets de mutations génétiques spécifiques sur les fonctions neuronales. On peut employer un canon à ADN pour fournir de l'ADN codant pour la version de type sauvage ou mutante d’une protéine, et les impacts à court terme sur la biologie cellulaire peuvent être évalués, par exemple par enregistrement « patch-clamp» des décharges neuronales.
Enfin, une stratégie classique pour tester la fonction d'un gène est d'observer ce qui se passe dans les cellules lorsque son expression est bloquée. Pour ces expériences, les vecteurs lentiviraux peuvent être utilisés pour délivrer des constructions d'ARN interférent, qui empêchent la synthèse des protéines. Dans cette expérience, le blocage de gènes associés à la maladie de Parkinson conduit à une diminution significative de la viabilité cellulaire.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la transfection de neurones. Dans cette vidéo nous avons présenté les principes de la transfection de neurones ainsi que les procédures et applications de trois techniques classiques de transfection. Merci de nous avoir regardés!
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La transfection, soit le transfert de matériel génétique dans des cellules de mammifères, est un outil précieux qui permet aux scientifiques de manipuler génétiquement les neurones et le tissu neuronal. Les propriétés uniques de ces cellules fragiles rendent la transfection difficile, d’où le besoin de techniques spécialisées. Cette vidéo passera en revue les principes de la transfection de neurones, et présentera des techniques couramment utilisées sur ces cellules, y compris la nucléofection, la transfection biolistique, et la transduction virale. Enfin, nous aborderons l'utilisation de techniques de transfection dans la cellule et la recherche en neuroscience moléculaire.
Commençons par examiner la façon dont fonctionne la transfection. Bien que le matériel génétique puisse être fourni à proximité d'une cellule en culture en l'ajoutant au milieu environnant, les nucléotides ne peuvent pas pénétrer efficacement les membranes cellulaires.
Tous les protocoles de transfection sont conçus pour permettre au matériel génétique de contourner cet obstacle. Les nucléotides qui bloquent la production de protéines, comme l’ARN interférent, peuvent immédiatement remplir leur fonction lorsqu'ils pénètrent dans le cytoplasme. Cependant, les constructions à base d'ADN doivent être apportées dans le noyau pour la traduction, avant que la synthèse des protéines ne puisse commencer. Dans les cellules en division, la rupture de l'enveloppe nucléaire pendant la mitose peut entrainer l'incorporation d'ADN transfecté dans le noyau en formation des cellules-filles. Mais vu que la plupart des neurones en culture sont des cellules post-mitotiques – ou qui ne se divisent plus - des protocoles de transfection spécialisés sont nécessaires pour réussir à induire l'expression d’un gène.
Passons en revue ces protocoles en commençant par la nucléofection. Cette technique combine l’utilisation d’un champ électrique induit et de réactifs chimiques, qui agissent ensemble pour créer des structures semblables à des pores transitoires au niveau des membranes cellulaires et nucléaires. Puisque les nucléotides sont polarisés, le champ électrique entraîne également le passage d'ADN à travers les pores.
Pour mener à bien cette procédure, les neurones en suspension sont recueillis dans un pellet par centrifugation, avant d'être remis en suspension dans le réactif commercial de nucléofection. Le mélange cellulaire est ensuite combiné avec de l'ADN purifié, et transféré dans une cuvette d'électroporation, qui contient deux plaques d'aluminium qui entrent en contact électrique avec l'équipement du Nucléofacteur. Ce dispositif délivre une série d'impulsions électriques rapides, dont le nombre et la durée sont adaptés en fonction du type de cellule. Après nucléofection, les cellules peuvent être diluées dans un milieu de culture et mises en plaques pour une croissance continue.
La technique par canon à ADN, quant à elle, passe les barrières de la transfection en tirant des billes portant du matériel génétique à travers les membranes cellulaires et nucléaires.
Pour faire des billes pour canon à ADN, l'ADN codant votre gène d'intérêt est précipité sur des microbilles, généralement composées d'or. Après une incubation de 10 minutes, les billes sont lavées et transférées dans des tubes. Les tubes sont ensuite mis en rotation afin de sécher la solution, entrainant le revêtement uniforme des billes. Ensuite, les tubes sont coupés en cartouches et chargés dans le canon. La livraison du matériel génétique, alimentée au gaz, peut être effectuée sur des cellules mises en culture en plaque standard par une simple pression de la détente.
Enfin, la transduction virale tire parti du cycle de vie viral pour apporter du matériel génétique étranger dans le noyau. L'ARN codant pour le gène d'intérêt est emballé dans des rétrovirus modifiés appelés vecteurs lentivirus, qui peuvent pénétrer dans les cellules cibles en se liant à des protéines membranaires spécifiques, déclenchant un événement de fusion membranaire. L'ARN viral est ensuite inversement transcrit en un brin d'ADN complémentaire qui est transporté dans le noyau.
Avant de commencer cette procédure, notez que les virus peuvent infecter les cellules de votre corps aussi bien que celles de vos cultures, il est donc extrêmement important de suivre les directives de sécurité.
La première étape consiste à générer les particules lentivirales portant votre gène d'intérêt. Ceci est réalisé en exprimant les blocs de construction du virus dans une lignée cellulaire humaine optimisée pour la production virale, comme des cellules 293T. Pour éviter la propagation indésirable des virus modifiés, les gènes nécessaires à leur assemblage sont conservés séparément du vecteur de transfert, dont la séquence est incluse dans la particule infectieuse. Il faut compter environ deux jours pour que les virus entièrement assemblés soient libérés dans le milieu de culture, où ils peuvent être recueillis et concentrés par ultracentrifugation. Ensuite, la concentration appropriée, ou titre, de virus est déterminée par l'évaluation de la réussite de transduction dans une lignée cellulaire test. Le vecteur lentiviral est ensuite ajouté à la culture neuronale cible et incubé pendant 24 à 48 heures pour s’assurer que l'infection a eu lieu.
Maintenant que vous êtes familier avec les techniques classiques de transfection, celle que vous utiliserez dépendra des objectifs spécifiques de vos expériences. Regardons quelques exemples.
Pour commencer, l'observation de la maturation des neurones en culture permet une analyse détaillée des changements morphologiques importants pour la connectivité neuronale, comme la formation des épines dendritiques. Pour visualiser la morphologie des cellules au fil du temps, ces chercheurs ont utilisé la nucléofection afin d’apporter une protéine fluorescente dans des neurones en culture. Ici, une protéine de tubuline marquée par fluorescence a été transfectée dans un groupe de cellules, permettant des analyses détaillées des processus cellulaires par microscopie de fluorescence. Puisque les niveaux d'expression ont été maintenus pendant toute la durée de vie du neurone, l’analyse morphologique peut être effectuée en culture pendant au moins un mois.
La transfection peut aussi être utilisée pour tester les effets de mutations génétiques spécifiques sur les fonctions neuronales. On peut employer un canon à ADN pour fournir de l'ADN codant pour la version de type sauvage ou mutante d’une protéine, et les impacts à court terme sur la biologie cellulaire peuvent être évalués, par exemple par enregistrement « patch-clamp» des décharges neuronales.
Enfin, une stratégie classique pour tester la fonction d'un gène est d'observer ce qui se passe dans les cellules lorsque son expression est bloquée. Pour ces expériences, les vecteurs lentiviraux peuvent être utilisés pour délivrer des constructions d'ARN interférent, qui empêchent la synthèse des protéines. Dans cette expérience, le blocage de gènes associés à la maladie de Parkinson conduit à une diminution significative de la viabilité cellulaire.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la transfection de neurones. Dans cette vidéo nous avons présenté les principes de la transfection de neurones ainsi que les procédures et applications de trois techniques classiques de transfection. Merci de nous avoir regardés!
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Q1: Why do neurons require specialized transfection techniques compared to other mammalian cells?
Most cultured neurons are post-mitotic, or non-dividing cells, unlike rapidly dividing cells where the nuclear envelope breaks down during mitosis to incorporate transfected DNA. This unique property of mature neurons necessitates specialized protocols that can directly deliver genetic material across both cell and nuclear membranes without relying on cell division to facilitate DNA entry into the nucleus.
Q2: How does nucleofection enable genetic material to cross neuronal cell membranes?
Nucleofection combines an induced electrical field with chemical reagents to create transient pore-like structures in both cell and nuclear membranes. Since nucleotides are charged, the electric field drives DNA movement through these pores. Neurons are collected in a pellet, resuspended in commercial nucleofection reagent, mixed with purified DNA, and transferred to an electroporation cuvette where rapid electrical pulses are delivered.
Q3: What is the process for preparing gene gun bullets for biolistic transfection?
DNA encoding the gene of interest is precipitated onto micron-scale gold beads and incubated for 10 minutes. The beads are then washed and transferred into tubing that is rotated as the solution dries, creating a uniform coating. The tubing is cut into cartridges and loaded into the gene gun for gas-powered delivery through cell and nuclear membranes.
Q4: How do lentiviral vectors deliver genetic material into neuronal nuclei?
Lentiviral vectors are modified retroviruses that gain entry into target cells by binding to specific membrane proteins, triggering membrane fusion. The viral RNA is reverse transcribed into complementary DNA and transported into the nucleus. Lentiviral particles are generated by expressing viral building blocks in optimized cell lines like 293T cells, then collected and concentrated by ultracentrifugation before adding to target neuronal cultures.
Q5: How can transfection be used to visualize neuronal morphology changes in culture?
Researchers use nucleofection to deliver fluorescent proteins, such as fluorescently-tagged tubulin, into cultured neurons. This allows detailed analysis of morphological changes important for neuronal connectivity, like dendritic spine formation. Because expression levels are maintained throughout the neuron's lifetime, morphological analysis via fluorescence microscopy can be performed for extended periods, such as at least one month in culture.
Q6: What are the advantages of using lentiviral vectors for gene silencing studies in neurons?
Lentiviral vectors can deliver silencing RNA constructs that prevent protein synthesis, allowing researchers to observe cellular effects when gene expression is blocked. This approach is particularly useful for functional studies, such as knockdown of genes associated with Parkinson's disease, which can reveal impacts on cell viability and other cellular processes relevant to an introduction to cellular and molecular neuroscience research.
Q7: How can gene gun transfection be used to assess the impact of genetic mutations on neuronal function?
A gene gun delivers DNA encoding wild-type or mutant versions of a protein into neurons, enabling short-term assessment of cellular effects. Researchers can evaluate impacts on neuronal function using techniques like patch clamp electrophysiology principle applications to measure changes in neuron firing patterns and other electrophysiological properties resulting from the mutation.
Chapitres dans cette vidéo
0:00
Overview
0:49
Principles of Transfection
1:57
Nucleofection
3:07
Gene Gun Transfection
4:03
Viral Transduction
5:53
Applications
7:40
Summary