Préparation et caractérisation d'un libre-Transgene humain souches pluripotentes induites lignée cellulaire et la conversion en des conditions définies de qualité clinique

L’objectif global de l’expérience suivante est de dériver des cellules souches pluripotentes humaines induites par l’homme, reprogrammées et basées sur des facteurs lentiviraux, et de convertir ces cellules en conditions de grade clinique présumées. Ceci est accompli en reprogrammant d’abord des fibroblastes humains dermiques adultes avec une seule cassette de cellules souches lentivirales ex size ou une voiture souche en CSP HI. Ensuite, les CSP HI reprogrammées sont exposées au virus du ronronnement adéno-cri pour l’excision complète et l’élimination de la voiture souche du génome hôte.

Ensuite, l’extraction de l’ADN génomique des CSP HI libres de la nageoire, suivie d’une analyse agel, confirme l’excision correcte de la voiture de tige. Enfin, les IPC du facteur trois H sont convertis en conditions présumées de qualité GMP par une méthodologie de conversion lente en conditions entièrement définies sans xéno. En fin de compte, la reprogrammation virale des fibroblastes dermiques humains adultes et la conversion complète des H IPC en conditions de qualité clinique soulignent la large applicabilité de cette méthodologie pour reprogrammer les cellules humaines adultes et les convertir en conditions cliniquement pertinentes.

Les implications de cette technique s’étendent aux applications cliniques des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, car elles sont totalement exemptes de facteur et converties en conditions de qualité clinique, ce qui les rend compatibles avec les thérapies humaines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la reprogrammation, l’excision et les étapes de conversion de grade clinique sont difficiles à apprendre en raison des principales procédures complexes et spécifiques qui doivent être suivies pour produire du facteur trois et des cellules souches pluripotentes humaines induites de qualité clinique pour commencer la décongélation. Des fibroblastes humains par voie cutanée adulte dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.

En prenant soin de ne pas immerger le haut de la fiole dans l’eau. Placez la suspension d’un millilitre de cellules dans un flacon chronique de 15 millilitres pour remettre les cellules en suspension et diluer le DMSO de manière goutte à goutte. Ajouter lentement quatre millilitres de hum medium préchauffé centrifuger le violet 200 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.

Aspirez ensuite le sup, le nacent et le reus. Suspendez les cellules dans le milieu à 100 000 cellules par millilitre dans un puits d’une plaque préco à six puits à 0,2 % de gélatine. Ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire, puis ajoutez deux millilitres de suspension à une seconde.

Eh bien, pour être utilisé pour mesurer la multiplicité de l’infection ou du MOI, balancez la plaque d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour répartir uniformément les cellules avant de les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans une chambre humidifiée. 24 heures plus tard, après avoir compté les cellules, décongiez deux fois, centrez les huit unités de transduction ou S de concentré lentiviral équivalent et utilisez un milieu de cuisson pour le diluer à une fois 10 à huit cuillères à café par millilitre en utilisant un demi-milieu complété par huit microgrammes par millilitre de réactif de transfection. Transduisez les cellules à un rapport d’infection de multiplicité de 10.

Mélangez uniformément les puits de transduction et incubez pendant la nuit environ 24 heures après la transduction lentivirale. Retirez le milieu huff et remplacez-le par un milieu standard de cellules souches pluripotentes humaines ou PSC. Changez le milieu tous les jours deux à six jours du six jour en deux plats de 10 centimètres recouverts de gélatine à 0,2 %, une assiette de 1,5 à 1,75 fois 10 aux six fibroblastes embryonnaires de souris dérivés du facteur de composant du complément un ou de la mucoviscidose un souris dans un demi-milieu le septième jour.

Ajoutez des voyages à température ambiante dans un puits d’une plaque à six puits des fibroblastes reprogrammés. Elle soulève doucement les cellules et fait tourner une plaque de 100 fois G avec une plaque moyenne PSC humaine fraîche toutes les cellules dans un rapport de un à 16 sur deux plaques de méthamphétamine CFI de 10 centimètres. Répartissez les agrégats en spirale dans le sens des aiguilles d’une montre et incubez pendant environ 48 heures avant de remplacer le milieu.

Après trois à quatre semaines, utilisez une aiguille de calibre 21 pour prélever huit à 10 morceaux individuels de colonies spécifiques avec une morphologie typique de type ESC et sous-clonez-les dans des puits individuels de CFI MFS après expansion. Confirmer que les cellules sont pluripotentes par la formation du corps embryonnaire et l’analyse de l’expression des marqueurs après avoir vérifié le site d’intégration de la voiture souche comme décrit dans le protocole textuel ci-joint. Excisez la voiture en aspirant d’abord l’ancien milieu PSC humain dans trois millilitres de milieu PSC standard combinés.

45 microlitres d’adeno Cree pur concentré ou virus avec huit microgrammes par millilitre d’agents de transfection. Ensuite, ajoutez-les aux cellules et incubez pendant 24 heures après l’incubation, aspirez le supinate viral induisant le milieu PSC humain pour laver les cellules deux fois. Ajoutez ensuite un milieu HPSC avec deux microgrammes par millilitre de mycine pure et remplacez-le quotidiennement après cinq jours, sous-clonez les colonies restantes et élargissez-les comme décrit plus tôt dans la vidéo.

Ensuite, décongelez un flacon de matrice de membrane basale pré Eloqua sur de la glace et diluez le milieu basal froid jusqu’à une concentration finale de un à 30. Utilisez un millilitre par puits pour enrober le nombre souhaité de puits d’une plaque à six puits et laissez la plaque reposer à température ambiante pendant une heure. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 18, hachurez au moins 20 à 30 colonies d’un puits préalablement recouvert de mes.

Prenez soin de réduire le soulèvement et le transfert des cellules de la plaque. Après l’incubation d’une heure, aspirez la matrice du puits enrobé avec une pipette de 200 microlitres. Retirez les morceaux des colonies en les grattant doucement de l’ancienne plaque et placez-les soigneusement dans trois millilitres de milieu fraîchement combiné, un dans une plaque recouverte de matrice.

Après 48 heures d’incubation, changez de milieu tous les jours lorsque les PSC HI convertis post-excisés et sans mangeoire atteignent une fluidité de 80 %. Utilisez un kit d’extraction d’ADN commercial pour extraire l’ADN génomique à l’aide des amorces présentées ici qui sont spécifiques aux intégrations exogènes du lentivirus de la voiture souche. Analysez l’ADN par PCR pour une excision appropriée afin de faire passer les CSP HI post-excisées à des conditions de grade GMP.

Mélangez le milieu combiné HPSC un et le milieu conforme aux BPF de qualité clinique ou le milieu combiné deux à un rapport de 80 à 20 préchauffage à 37 degrés Celsius. Aspirez l’ancien milieu combiné des cellules et remplacez-le par trois millilitres de la nouvelle solution de milieu chaud. Remplacer le milieu tous les jours pendant trois jours, en passant selon le protocole textuel pour maintenir une taille et une densité de colonie appropriées le quatrième jour, remplacer le milieu par un mélange 50 50 de milieux chauds combinés un et deux incuber pendant trois jours.

En remplaçant le milieu tous les jours le septième jour, on passe à un rapport de 20 à 80 milieux combinés chauffés un et deux respectivement et on le remplace tous les jours pendant trois jours. Le 10e jour, passez à un moyen chaud 100 % combiné et changez tous les jours. Les cellules sont maintenant dans un milieu sans xéno complètement défini.

Ensuite, après avoir utilisé un substrat exempt de xéno défini pour enrober un puits d’une plaque à six puits, remplacez le milieu libre de xéno dans un puits de cellules de confluence par un milieu frais contenant une roche x. Après une heure d’incubation, utilisez une aiguille de calibre 18 pour insérer mécaniquement les cellules dans les cellules fraîchement préparées. Eh bien, laissez les cellules incuber sans être dérangées pendant deux jours pour permettre une fixation maximale avant de caractériser les cellules selon le protocole de texte.

Cette figure montre une image représentative de trois différentes lignées H-I-P-S-C pré-excisées après reprogrammation avec l’approche de la voiture souche sur une couche de mes. Dans cette figure, on montre la quantification des facteurs associés à la pluripotence standard des facteurs associés à la pluripotence, y compris SOX deux, OCT quatre et nanog. L’utilisation de la QPCR est illustrée ici.

Enfin, comme on le voit ici, des CSP IH pré-converties et post-converties dans des conditions de grade GMP ont été testées par cytométrie en flux pour l’acide sialique et l’acide neuronique glycol indiquant des antigènes non humains. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de reprogrammer les fibroblastes dermiques adultes humains avec le virus de reprogrammation stemco, d’exciser le virus du génome, puis de convertir complètement ces CSP HI en conditions de qualité clinique entièrement compatibles avec les thérapies humaines. N’oubliez pas que travailler avec du staca, un vecteur antiviral de troisième génération peut être extrêmement dangereux et des précautions.

Un tel EPI approprié et une salle de culture tissulaire VSL deux plus doivent être utilisés lors de l’exécution de cette procédure.