Name: Mesure induite glutathion-réponse dalimentation à Hydra (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez une méthode simple pour quantifier la réponse alimentaire de l'Hydre au glutathion réduit. Cette technique mesure l'écart entre les tentacules et la bouche pour étudier la chémoréception et le comportement de prédation.

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Les auteurs remercient K. P. Madhu, Nita Beliappa et le personnel du Centre des médias de l’Institut indien d’éducation et de recherche scientifiques, Pune, pour leur aide dans la production vidéo. Les travaux ont été soutenus par un financement dans le cadre du programme du Centre d’excellence du Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde à SG et par une bourse postdoctorale du Département de la science et de la technologie du gouvernement de l’Inde à RK.

1. Hydra culture et la mesure de la réponse d'alimentation <ol><li> Maintenir polypes hydra en culture en les alimentant tous les jours avec des artémias et les conserver dans un moyen (1 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2, 0,1 mM de KCl, 0,1 mM et MgSO 4) contenu dans un bol verre à 18 ° C sous la lumière 12 h 12 cycles sombres de h comme décrit plus haut 12. </li><li> Pour mesurer la réponse d'alimentation, de transfert d'âge mûr polype hydre ayant 5 à 6 tentacules à un seul puits d'une plaque de 24 puits. Retirez le moyen résiduel du bien en l'inclinant, puis ajouter immédiatement 500 pi de milieu frais. </li><li> Préparer la solution de glutathion 9 uM dans le milieu hydre. Etant donné que la solution de glutathion est sujette à l'oxydation, en utilisant toujours une solution fraîchement préparée de glutathion pour chaque expérience. </li><li> Transférer la plaque de la plate-forme de formation d'image d'un microscope comportant des dispositifs pour l'enregistrement de l'image. Utilisez un fond sombre telle que le comportement opolype hydre f peut être clairement illustré dans le contexte contrasté. </li><li> La salle utilisée pour l'observation et l'imagerie du comportement de Hydra gratuit de feux dont l'intensité, la fluctuation des courants d'air et le bruit. De telles perturbations peuvent également causer le polype hydre à afficher contraction des tentacules - même en l'absence de glutathion. </li><li> Laisser le polype pour se détendre pendant 5 min. </li><li> Assurez-vous que le polype est situé le long de la région centrale du bien telle que le comportement peut être imagée clairement. Si le polype est au bord du puits, apporter au centre par le moyen de rinçage à l'aide d'une pipette de nouveau et lui permettre de se relaxer. </li><li> Capturer une image de l'hydre à l'état détendu. Ce sera l'observation du point zéro-temps. </li><li> Ajouter rapidement 9 uM solution de glutathion pour atteindre une concentration finale de 3 uM dans le puits. Selon le but de l'expérience et de la réponse montre hydre, tester une gamme de différentes concentrations de glutathion et chooSE concentration appropriée requise. </li><li> Lancer le chronomètre immédiatement après addition d'une solution de glutathion et de capturer des images après chaque 15-30 sec pour 4-5 min. Ne pas modifier les paramètres d'agrandissement au cours de l'imagerie time-lapse. </li><li> Ajouter la solution de glutathion doucement et avec un débit uniforme de telle sorte que la position de l'animal dans le puits serait très peu perturbé dans le champ de vision du microscope. Toutefois, si le polype se déplace largement après addition d'une solution de glutathion, déplacer la plaque très doucement pour amener le polype dans le champ de vision pour la capture d'image. </li><li> Dans l'expérience de contrôle, utilisez défaut moyen glutathion tout en gardant tous les autres paramètres identiques. </li><li> Assurez-vous d'effectuer toutes les étapes expérimentales ci-dessus au cours de la première moitié de la journée - avant 13 heures pour éviter l'effet possible du rythme circadien sur la mesure de la réponse de l'alimentation. </li><li> Ouvrez chacune des images capturées à l'aide de l'Image Manipulation Program GIMP (GNU). </li> Utilisez la fonction "Mesure" disponible à partir de Menu&gt; Outils&gt; Mesurer pour déterminer la distance entre l'extrémité apicale de chacun des tentacules et hypostome. Si l'ouverture de la bouche est observée dans aucune des images, déterminer la distance entre le centre de la bouche ouverte et l'extrémité apicale du tentacule. Reportez-vous à cette distance que la propagation de tentacule. <li> Calculer la propagation de tentacule moyenne pour chaque polype avant et après exposition de glutathion. Calculer le rapport de la propagation de tentacule moyenne au point zéro de temps pour que à chacun des points de temps ultérieurs. Ce rapport sera appelé rapport tentacule propagation. </li><li> Répétez mesures pour au moins 20 polypes. </li></ol><img alt="Equation 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="Equation 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. Validation de la méthode utilisant leLa famine modèle <ol><li> Pour la famine, transférer quelques polypes hydra dans un bol en verre séparée et ne les nourrissez pas pendant 5 jours. Nourrir le groupe de quelques polypes de contrôle quotidien avec artémias dans un bol de taille similaire. Changer le support à la fois expérimentale bols par jour pour éviter le développement de champignons dans le milieu. </li><li> Le jour de l'expérience, nourrir le groupe de l'hydre de commande avec artémias pendant 1 heure et utiliser ces hydre pour les expériences ultérieures après avoir retiré artémias non consommés et mort du milieu. </li><li> Mesurer la réponse d'alimentation de l'hydre de faim par rapport à l'hydre de groupe de contrôle par la méthode décrite précédemment à l'étape 1. Pour éviter tout biais dû au temps de l'observation, alterner les mesures de chacun des affamés et contrôler polypes Hydra. </li></ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
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<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Comportement alimentaire dans hydre représente l&#39;un des systèmes les plus chimiosensoriels ancestrales dans les métazoaires. Bien que la présence de GSH dans le liquide crustacé libéré après la capture des proies assisté nématocyste-été détecté depuis longtemps 1, ni la protéine GSHR ni le gène codant putatif / s ont été caractérisés à ce jour de Hydra. Quelques tentatives ont été effectuées pour caractériser GSH protéines de liaison à hydre 8, 14, 15. Cependant, l&#39;identité de ces protéines...

Hydra est l’organisme le plus primitif possédant un système nerveux et une chimiosensation pour détecter une réduction du glutathion (GSH) pour capturer la proie1. Il se nourrit d’une variété d’animaux tels que des nématodes, des crustacés, des larves d’insectes, des têtards et des poissons nouvellement éclos1. Le mouvement de ces organismes proies provoque une décharge mécanosensorielle des capsules urticantes appelées nématocystes de l’hydre, qui sont insérées dans la proie2. Le GSH présent dans le liquide libéré de la proie blessée active par la suite la réponse alimentaire chez hydra, ce qui comprend l’enroulement des tentacules pour amener la proie vers la bouche, l’ouverture de la bouche et l’engloutissement consécutif de la proie. Il a été démontré que plusieurs molécules, telles que la dopamine3, le glutamate4, le GABA, la glycine5, les récepteurs NMDA6 et l’allatotropine7, sont impliquées dans la réponse alimentaire de l’hydre. Il a également été démontré que la réponse chimiosensorielle induite par le GSH est modulée par l’état alimentaire de l’animal, de sorte que l’hydre affamée présente une réponse alimentaire accrue1. Une telle augmentation de la sensibilité au GSH est biologiquement pertinente, car en cas de famine, l’hydre doit trouver ses proies à une sensibilité plus élevée. 
Bien que la réponse alimentaire induite par le GSH puisse être clairement observée au microscope, les méthodes généralement utilisées pour mesurer les observations de la réponse alimentaire sont non quantitatives. Dans la plupart des cas, le temps pendant lequel la bouche de l’hydre reste ouverte a été pris comme mesure de la réponse alimentaire8,9 ; Alors que dans un autre cas, la quantification était basée sur le nombre d’hydres par rapport à une population montrant la réponse alimentaire10. Cependant, l’observation du temps d’ouverture de la bouche des polypes de l’hydre est lourde et sujette à des variations induites par des paramètres incontrôlables tels que la direction de l’orientation de la bouche lors des observations. De même, comme la réponse alimentaire est un paramètre quantitatif, les approches basées sur la population sont sujettes à des variations/erreurs causées par l’opinion ou le biais d’observation de l’observateur individuel. Pour contourner ces problèmes, nous avons développé une méthode de quantification relative de la réponse alimentaire chez l’hydre (Hydra vulgaris Ind-Pune11) basée sur la distance entre l’extrémité apicale du tentacule et la bouche du polype de l’hydre.

<table><tbody><tr><td>Incubateur réfrigéré</td><td>Panasonic</td><td>MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo pour microscope</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion réduit</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Stocké à 4 &deg ;C. Amenez la bouteille à température ambiante avant de l’ouvrir pour éviter l’oxydation Programme</td></tr><tr><td>d’édition d’images</td><td>GIMP</td><td>Version 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à hydra

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra est l’un des organismes les plus primitifs possédant un système nerveux et une chimiosensation pour détecter une réduction du glutathion (GSH) pour capturer la proie. Le mouvement des organismes proies provoque une décharge mécanosensorielle des cellules urticantes appelées nématocystes de l’hydre, qui sont insérées dans la proie. La réponse alimentaire chez l’hydre, qui comprend l’enroulement des tentacules pour amener la proie vers la bouche, l’ouverture de la bouche et l’engloutissement consécutif de la proie, est déclenchée par la présence de GSH dans le liquide libéré de la proie blessée. Pour pouvoir identifier le mécanisme moléculaire de la réponse alimentaire chez l’hydre qui est inconnu à ce jour, il est nécessaire d’établir un test pour mesurer la réponse alimentaire. Ici, nous décrivons une méthode simple de quantification de la réponse alimentaire dans laquelle la distance entre l’extrémité apicale du tentacule et la bouche de l’hydre est mesurée et le rapport de cette distance avant et après l’ajout de GSH est déterminé. Il s’est avéré que le rapport, appelé propagation relative des tentacules, donnait une mesure de la réponse alimentaire. Ce test a été validé à l’aide d’un modèle de famine dans lequel l’hydre affamée montre une réponse alimentaire améliorée par rapport à l’hydre nourrie quotidiennement.

Le glutathion provoque hydre exposer curling des tentacules vers la bouche dans le but d'engloutir la proie. Cette curling de tentacules apporte extrémités apicales des tentacules plus près de la hypostome. Cela se traduit par la réduction de la propagation du tentacule, ou la distance linéaire entre l'extrémité apicale du tentacule et hypostome (figure 1). La propagation de tentacule relative, ou le rapport de tentacule moyenne réparties avant et après l'ajout de glutathion, en moyenne sur plusieurs po...

Ici, nous décrivons un test simple pour la quantification de la réponse alimentaire chez l’hydre induite par la forme réduite du glutathion. Ce test repose sur la mesure de la distance entre l’extrémité apicale du tentacule et la bouche de l’hydre.

Mesure induite glutathion-réponse d&#39;alimentation à Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement alimentaire chez Hydra. En réponse à la forme réduite de glutathion, Hydra se nourrit d’une variété d’animaux, de nématodes, de crusta et de poissons nouvellement éclos. Sur la couche externe de cet animal à deux couches de cellules, il y a des cellules spécialisées appelées nématocystes.Les nématocystes ont des déclencheurs qui, lorsqu’ils sont activés par le mouvement des proies dans le liquide environnant, provoquent la décharge des fils de cordage. Les fils urticants sont insérés dans la proie. La proie blessée libère du glucose gluant.Ion hydro a une sensation de chimiothérapie pour détecter le glutathion dans le liquide environnant. Cela déclenche un comportement alimentaire impliquant son système nerveux. Le comportement alimentaire chez Hydra comprend l’enroulement des tentacules pour amener la proie vers une ouverture hyperscopique de la bouche et l’engloutissement de la proie.En fait, l’ajout de glutacité dans l’environnement provoque la réaction alimentaire de l’hydre, même en l’absence de proie. Pour comprendre l’interaction entre la sensation de chimiothérapie et le système nerveux, nous devons quantifier le comportement et créer des mesures précises et fiables. Dans quelques rapports antérieurs, le temps pendant lequel la bouche reste ouverte est pris comme mesure de la réponse alimentaire, mais l’observation de la durée de l’ouverture de la bouche chez les polypes hydro est fastidieuse et est sujette à des variations induites par des paramètres incontrôlables tels que l’orientation de la bouche due aux observations.Une autre méthode de quantification du comportement est basée sur le nombre d’hydres dans une population montrant la réponse alimentaire. Cependant, comme la réponse alimentaire est un paramètre quantitatif individuel, les approches basées sur la population sont des variations subjectives causées par l’opinion de l’observateur individuel. Les principaux avantages de la méthode alternative que nous décrivons ici sont qu’elle est très facile à exécuter et hautement reproductible.Maintenez hydra à 18 degrés Celsius sous une lumière de 12 heures. Cycles d’obscurité de 12 heures dans un milieu contenu dans un bol en verre et nourrissez-les quotidiennement avec de l’émie pour mesurer la réponse alimentaire. Transférez un polype hydroélectrique mature dans un puits d’une plaque de 24 puits pour éliminer le milieu résiduel du puits à l’aide d’un pivot.Ceci est facilité par l’inclinaison de la plaque, jetez l’excès de milieu, puis ajoutez immédiatement 500 microlitres de milieu frais Préparation de la solution de glutathion. Une solution de glutathion à neuf micromolaires est préparée à l’aide d’un milieu hydro. N’oubliez pas que la solution de glutathion est sujette à l’oxydation, alors utilisez toujours une solution de glutathion fraîchement préparée.Pour chaque expérience, transférez la plaque sur la plate-forme d’imagerie d’un microscope. En prévoyant l’enregistrement d’images, utilisez un fond sombre de sorte que le comportement des polypes hydroélectriques puisse être clairement imagé sur le fond contrasté. Assurez-vous que le polype est situé le long de la partie centrale du puits capturé une image de l’hydre dans l’état détendu.Il s’agira d’une observation de point temporel zéro. Ajoutez rapidement une solution de glutathion à neuf micromolaires pour atteindre une concentration finale de trois micromolaires dans le puits. Démarrez la minuterie immédiatement après avoir ajouté la solution de glutathion et capturez des images toutes les 15 ou 30 secondes pendant quatre à cinq minutes sans modifier les paramètres de grossissement.Pour les mesures, nous utilisons la version deux de gim, gim. Un programme de manipulation d’images GNU est un logiciel téléchargeable gratuitement sur Internet. Ouvrez chacune des images capturées dans gim.Ce programme dispose d’un outil de mesure disponible à partir du menu outils. Mesurez la distance entre l’hypers, la stomie, l’extrémité apicale de chacun des tentacules peut être mesurée à l’aide de cet outil. Cette distance s’appelle l’étalement des tentacules.Calculez l’écartement moyen des tentacules pour chaque polype avant et après le glutathion. Calculez le rapport de l’écartement moyen des tentacules à temps zéro. Pointez cela à chacun des points temporels suivants.Appelons cela l’extension relative des tentacules. Faites de telles mesures pour au moins 20 polypes pour la famine. Transférez quelques polypes hydro dans un bol en verre séparé et ne les nourrissez pas pendant cinq jours.Nourrissez quotidiennement les polypes témoins avec de l’artia le jour de l’expérience. Nourrissez le groupe témoin d’Hydra avec des artia pour un R et utilisez ces hydres pour les expériences suivantes. Mesurez la réponse alimentaire de l’hydre affamée par rapport à l’hydre du groupe témoin par la méthode décrite plus haut dans cette vidéo pour éviter tout biais dû au temps d’alternance, les mesures de chacun des polypes hydrophiles affamés et contrôlés.Le glutathion fait que l’hydre présente une enroulement des tentacules vers la bouche. Une telle courbure rapproche les extrémités apicales des tentacules de l’hypo-tempête. Cela se traduit par une réduction de la distance linéaire entre les extrémités apicales du tentacule et une hyper tempête ou une propagation du tentacule.Le tentacule relatif s’est étalé après l’ajout du milieu. Le manque de glutathion ne diminue que transitoirement. Il rebondit à un en une minute environ.La famine est connue pour provoquer une amélioration du comportement alimentaire induit par le glutathion. La propagation des tentacules une minute après l’ajout de glutathion était significativement plus faible pour le groupe du personnel par rapport au groupe rassasié. Tous les animaux utilisent la sensation de chimiothérapie pour détecter la nourriture.Hydra utilise un signal chimique sous forme de glutathion libéré par la proie blessée, a un système nerveux simple sans aucune structure semblable au cerveau, de sorte que le mécanisme moléculaire de la sensation de chimiothérapie et sa modulation dépendante de l’état d’alimentation sont également susceptibles d’être simples. La compréhension de ce mécanisme peut éclairer l’évolution d’une régulation de l’alimentation chez les animaux supérieurs. Cependant, ni le récepteur qui peut lier le glutathion ni aucun autre composant de la cascade de signalisation en aval n’ont été signalés à Haïda à ce jour.Les inhibiteurs pharmacologiques des voies de signalisation sensorielle courantes des chimiothérapies et l’utilisation de techniques de biologie moléculaire avancées pour modifier l’expression de ces protéines de signalisation et du récepteur du glutathion peuvent s’avérer être des outils puissants pour comprendre le mécanisme moléculaire de l’alimentation. Chez Hydra, cependant, une mesure fiable du comportement alimentaire modifié est nécessaire pour comprendre l’étendue des modifications causées par de telles investigations expérimentales. Nous avons présenté ici une méthode qui est non seulement fiable, mais aussi facile à réaliser et hautement reproductible.

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Dosages quantitatifs-la prise alimentaire avec de la nourriture teint fournissent un robuste et haut débit moyens d’évaluer la motivation alimentation. Combinant le dosage de la consommation de nourriture avec thermogenetic et optogenetic écrans est une approche puissante pour enquêter sur les circuits neurones sous-tendant l’appétit chez les adultes Drosophila melanogaster.

Combinant les dosages quantitatifs-la prise alimentaire et activation par la force des neurones pour étudier l’appétit chez la drosophile

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Cet article présente une méthode pour étudier le trafic de récepteur de glutamate (GluR) dans les cultures hippocampal primaires dissociées. Utilisant une approche d'alimentation par anticorps pour étiqueter les récepteurs endogènes ou surexprimés en combinaison avec des approches pharmacologiques, cette méthode permet d'identifier les mécanismes moléculaires régulant l'expression de surface du GluR en modulant processus d'internalisation ou de recyclage.

Une approche d'alimentation d'anticorps pour étudier le trafic de récepteurs de glutamate dans les cultures hippocampal primaires dissociées

Décrit ici est un protocole qui permet la quantification colorimétrique de la quantité de nourriture consommée dans un intervalle de temps défini par les larves de Drosophila melanogaster exposées à des régimes de qualité macronutriment différente. Ces tests sont menés dans le cadre d’un criblage thermogénétique neuronal.

Quantification de l’apport en macronutriments dans un écran neuronal thermogénétique à l’aide de larves de drosophiles

Cet article décrit un protocole pour déterminer les différences dans l’état redox basal et les réponses redox aux perturbations aiguës dans les neurones primaires de l’hippocampe et cortical en utilisant la microscopie vivante confocale. Le protocole peut être appliqué à d’autres types de cellules et de microscopes avec un minimum de modifications.

Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

La quantification des formes oxydées et réduites du glutathion (GSSG et GSH, respectivement) a été réalisée grâce à l’utilisation d’ortho-phtalaldéhyde (OPA). L’OPA devient très fluorescent une fois conjugué au GSH, mais il est incapable de conjuguer le GSSG jusqu’à ce qu’il soit réduit. Ici, nous décrivons un test multiparamétrique pour quantifier les deux en utilisant la quantification des protéines pour la normalisation.

Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro

Ce protocole décrit un test permettant de quantifier le taux d’alimentation de Caenorhabditis elegans basé sur la mesure de l’élimination des bactéries en culture liquide.

Quantifier l’apport alimentaire chez Caenorhabditis elegans en mesurant la clairance bactérienne

Grâce à l’imagerie en accéléré, le processus complet de régénération des sphéroïdes d’Hydra peut être suivi. Ce protocole décrit la génération de sphéroïdes Hydra , discute de diverses stratégies de montage et détaille comment réaliser une imagerie en temps réel à long terme en utilisant la microscopie confocale à disque tournant ainsi que la microscopie à fluorescence à feuilles lumineuses.

Préparation et imagerie en temps réel des sphéroïdes hydres en régénération

Découvrez une méthode simple pour quantifier la réponse alimentaire de l'Hydre au glutathion réduit. Cette technique mesure l'écart entre les tentacules et la bouche pour étudier la chémoréception et le comportement de prédation.

Mesure induite glutathion-réponse d'alimentation à Hydra

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