Name: Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour In Vitro Les dosages de la myélinisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez la production de lentivirus pour la transduction sélective des cellules précurseurs d'oligodendrocytes et leur utilisation dans des modèles de myélinisation in vitro. Cette méthode permet d'étudier le rôle des protéines dans la myélinisation du système nerveux central.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil national australien de la santé et de la recherche médicale (bourse NHMRC #454330 à JX, subvention de projet #628761 à SM et APP1058647 à JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 à JX), le programme de soutien aux subventions de recherche de l’Université de Melbourne et la bourse Melbourne Research CI à JX, ainsi que des bourses d’études supérieures australiennes à HP et AF. Nous tenons à souligner le programme d’infrastructure opérationnelle du Ministère de l’Innovation, de l’Industrie et du Développement régional, Victoria (Australie).

REMARQUE: Tous les animaux utilisés pour cette étude étaient de sexe mixte et a grandi aux installations vétérinaires du Département d'anatomie et de pathologie et Le Florey Institute of Neuroscience et de la recherche en santé mentale à l'Université de Melbourne. Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par les comités d'éthique expérimentation animale à l'Université de Melbourne. 1. Clonage de 2K7 Lentivector <ol><li> Avant de cloner le gène d'intérêt dans le vecteur lentiviral 2K7, sous-cloner le gène dans le vecteur pENTR (3637 pb, résistant à la kanamycine) en utilisant des techniques moléculaires classiques 11. Utiliser les sites de restriction EcoRI et SacII pour le sous-clonage. </li><li> Amplification de l'2K7 Lentivector <ol><li> Transformer l'ADN lentivector 2K7 mélangeant doucement par 100 ng d'ADN plasmidique avec des cellules compétentes et on incube sur de la glace pendant 30 min. </li><li> ADN choc thermique / cellules compétentes mélanger à 42 ° C pendant 90 secondes et la plaque sur des assiettes LB-agar contenant à la fois ampicillin (100 ug / ml) et du chloramphenicol (15 ug / ml) à 37 ° C pendant 16-18 h. REMARQUE: Chloramphenicol est utilisé pour empêcher une recombinaison entre les longues répétitions terminales. </li><li> Le lendemain, grandir choisi clones bactériens dans un milieu LB contenant de l'ampicilline (100 ug / ml) et du chloramphenicol (15 ug / ml) à 37 ° C pendant 16-18 h. Extraire l'ADN en utilisant un plasmide commerciale kit ADN Maxiprep selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Sous-clonage de pENTR vecteur 2K7 Lentivector (Figure 1) <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig1highres.jpg"> Figure 1:. Représentation schématique du processus de recombinaison passerelle Le gène d'intérêt, ici représentée comme Flag-Erk1, est cloné dans le vecteur pENTR L1-L2. Ceci est ajouté au vecteur pENTR L4-R1 contenant le promoteur CMV et le vecteur squelette 2K7. Ces trois vecteurs sont recombinés par l'enzyme LR Clonase II Plus pourinsérer le gène d'intérêt et le promoteur dans le vecteur du virus 2K7 prêt. <ol><li> Ajoutez ce qui suit à un tube de 1,5 ml et mélanger doucement: L4-R1-pENTR pDNOR-CMV (promoteur) (60 bng) 1 à 2,5 pl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (avec le gène d'intérêt) (80 bng) 1 à 2,5 pl K7 lentivecteur (80 ng / ul) 1 pl TE-tampon, pH 82-5 ul Total 8 pi </li><li> Retirer mélange d'enzymes clonase de -80 ° C et décongélation sur de la glace pendant 2 min. Assurez-vous que cette enzyme est une autre partie aliquote de -80 ° C, l'enzyme a considérablement réduit l'efficacité de clonage avec des cycles répétés de congélation-décongélation </li><li> Ajouter 2 ul d'enzyme par réaction et bien mélanger par vortex et incuber le mélange réactionnel clonase au 23-25 ​​° C pendant 6 à 24 h. </li><li> Ajouter 1 pi de solution de proteinase K (fourni avec le kit d'enzyme) au mélange réactionnel clonase et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Transformer mélange réactionnel clonase dans des cellules compétentes et faire croître l'sélectionnezcolonies dans du milieu LB contenant de l'ampicilline (100 ug / ml) à 37 ° C pendant 16-18 h. </li><li> Extraire et purifier l'ADN en utilisant un plasmide commercial kit ADN Miniprep selon les instructions du fabricant. </li><li> Confirmez l'ADN par digestion en utilisant les enzymes de restriction Spe I et Sac II et un tampon approprié selon les instructions du fabricant pour éliminer le fragment contenant le promoteur et le gène d'intérêt. NOTE: Cette étape est essentielle pour vérifier si l'ADN sous-cloné le gène a correcte de l'insert d'intérêt avec le squelette du vecteur droite. La taille du vecteur lui-même sans fragment inséré est 6,7 kb. La taille du fragment inséré libéré comprend à la fois le promoteur et le gène d'insert d'intérêt. Calculer les tailles de fragments attendus de l'empreinte pour le gène spécifique via un programme d'édition de séquence d'ADN, par exemple, les APE - un plasmide Editor. </li><li> Vérifiez la taille des deux squelette du vecteur d'ADN et le fragment libéré en exécutant un gel d'''</li><li>''</li><li>' '</li></ol></li><li>'</li></ol><ol><li>'' ' </li><li><ol><li>''</li><li>''<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:344px;">&gt;</td><td style="width:120px;"></td><td style="width:105px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:344px;"></td><td style="width:120px;"></td><td style="width:105px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:344px;"></td><td style="width:120px;"></td><td style="width:105px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:344px;">'</td><td style="width:120px;"></td><td style="width:105px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:344px;"></td><td style="width:120px;"></td><td style="width:105px;"></td></tr>"&gt;<td height="21" style="height:21px;width:344px;"></td><td style="width:120px;"></td><td style="width:105px;"></td></tbody></table></li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li></ol></li><li>'</li><li>'</li><li>''</li><li>'''</li><li><li></ol><ol><li>'''</li><li><ol><li><li><li></ol></li><li>'''&gt;''</li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig2highres.jpg"> '&lt;&gt;<li><li>'' '</li><li><li>'</li><li><li><li><li><li>'</li><li><li>'&lt;</li><li><li><li><ol><li>'' </li><li>''</li><li>'' </li><li>'<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td><td style="width:104px;"></td><td style="width:73px;"></td><td style="width:83px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="25"><td height="25" style="height:25px;"></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr height="21"><td colspan="4" height="21" style="height:21px;">''</td></tr></tbody></table></li><li>'</li><li>'''</li><li>'<ol><li>''</li><li></ol></li><li><li><li><li><li>'''</li><li><li></li><li><li>'</li><li><li>'</li><li><li><li><li><li>'</li><li></li></ol><ol><li></li><li>''</li><li>'</li></ol><ol><li>'</li><li><li><li>' '</li><li><li>'''</li><li><li>'</li></ol></li>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant cette recherche.

La myélinisation des axones est un processus crucial pour le fonctionnement optimal des deux systèmes nerveux central et périphérique de vertébrés. La génération et la maintenance des axones myélinisés est un processus complexe et coordonnée impliquant des interactions moléculaires entre neuronale, gliale (à partir de cellules de Schwann ou oligodendrocytes) et protéines de la matrice extra-cellulaire. L&#39;importance et l&#39;applicabilité de ce protocole est qu&#39;il permet la manipulation des protéines dans un type...

La myélinisation des axones est crucial pour la transmission rapide et efficace des potentiels d&#39;action dans les deux les systèmes nerveux central et périphérique. Des cellules spécialisées, les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique et les oligodendrocytes dans le système nerveux central, se enroulent autour des axones et ensheathe dans la myéline, efficace isolantes du nerf et de faciliter la conduction saltatoire 1. Le procédé de la myélinisation peut être étudiée in vitro en utilisant des neurones ganglionnaires de la rétine, 2 nanofibres par génie 3, ou neurones ganglionnaires de la racine dorsale co-cultivées avec des cellules de Schwann ou des oligodendrocytes 4 7.5. Le dosage in vitro de la myélinisation est un modèle établi pour l&#39;étude du système nerveux myélinisation et il reproduit la plupart des processus fondamentaux qui se produisent pendant la myélinisation in vivo 5-8. Le test implique la co-culture des populations purifiées de ganglions de racine dorsale (DRG) neurones, avec OPC (CNS myélinisation) ou des cellules de Schwann (PNS pour la myélinisation). Dans des conditions spécifiques de ces cellules myélinisantes ensheathe axones DRG dans l&#39;ordre, structurellement vérifié, feuille multi-lamellaire ultra de la membrane plasmique qui expriment la même complément de protéines spécifiques de la myéline présents in vivo isolant. Le modèle de cellule la plus couramment utilisée de l&#39;étude de myélinisation du SNC in vitro est le co-cultures de neurones DRG et OPC, qui ont été utilisés avec succès pour étudier l&#39;effet que des facteurs exogènes tels que les neurotrophines exercent sur ​​myélinisation du SNC in vitro 5,6. Les facteurs exogènes tels que les facteurs de croissance ou de petites molécules inhibiteurs pharmacologiques ont été largement utilisés pour étudier le rôle des voies de signalisation dans la myélinisation utilisant le DRG-OPC modèle de co-culture 7,9. Cependant, dans les paramètres de co-culture mixte contenant à la fois des neurones et des oligodendrocytes, il est resté formellement possible que soit les facteurs de croissance ou du pharinhibiteurs macologique auraient exercé des effets à la fois les neurones et les oligodendrocytes (OL) DRG. Cela offre la possibilité de disséquer spécifiquement les rôles que les protéines exprimées uniquement par DRG ou oligodendroglie exerce sur la myélinisation utilisant ce système cellulaire double. Pour confirmer sans équivoque que la voie de signalisation dans oligodendrogliale régule directement la myélinisation, transduction lentiviral des OPC, avant le semis sur les neurones de DRG pour le dosage in vitro de la myélinisation, se est avéré être une manière élégante de surexpression de type sauvage et les protéines mutantes, ainsi comme knockdown expression des protéines exprimées de manière constitutive par les oligodendrocytes. Ainsi, cette approche offre une avenue pour interroger et manipuler spécifiquement les voies de signalisation au sein oligodendrocytes pour étudier la myélinisation 9,10. Dans cet article, nous présentons les méthodes que nous avons développées pour surexprimer une protéine d&#39;intérêt dans les oligodendrocytes sélective via un lentivirusapproche pour étudier la myélinisation in vitro. La technique commence avec la génération de vecteurs d&#39;expression contenant le gène d&#39;intérêt, que ce soit dans un type sauvage, forme négative constitutivement active ou dominant qui sont ensuite ensuite clone dans le vecteur pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Ce vecteur (contenant le gène d&#39;intérêt), le donneur CMV promoteur (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) et le lentivecteur de 2K7 sont combinés dans une réaction enzymatique pour produire un vecteur de 2K7 contenant le promoteur CMV, le gène d&#39;intérêt, un site interne d&#39;entrée des ribosomes et la GFP (Figure 1). Cette passerelle clone construction d&#39;2K7 combiné avec l&#39;enveloppe du virus PMD2.G et le paquet de virus pBR8.91 peut être co-transfecté dans des cellules HEK293T pour générer lentivirus qui peut ensuite être utilisé pour transduire des OPC. Une fois infectés par le lentivirus les OPC expriment un niveau élevé de la protéine d&#39;intérêt. Ces OPC peuvent ensuite être ensemencées sur les cultures de neurones DRG et l&#39;effet que l&#39;expressionles niveaux des élevés de la protéine désirée exerce sur la myélinisation peut être interrogé. Les co-cultures sont évaluées pour l&#39;expression de la protéine de myéline par analyse Western blot et visualisés pour la formation de segments axonales myélinisées par immunocytochimie.

<table><tbody><tr><td>2K7 lentivecteur&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Aimable cadeau du Dr Suter9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime ;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre anti-souris IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement</td><td>Stem Cell Technologies&nbsp ;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Humain)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotine (d-Biotine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Réactif</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Média de montage en fluorescence</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Vecteurs d’entrée pour promoteur et gène d’intérêt</td><td></td><td></td><td>Générer selon les protocoles 1-2</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskoline&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Voir les solutions mères</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Souris IgM&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rat de</td><td>chèvre Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Insuline&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634° ;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminine&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Voir les solutions mères</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Voir les solutions mères</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine- 200 mM (100x) liquide</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus enzyme</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, sans Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td> Souris &alpha<td></td></tr><tr><td> ; &beta ; III Tubuline&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>Souris & alpha ; MBP (monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na pyruvate&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (souris)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps O1 - Souris anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternative si les cellules d’hybridome O1 ne sont pas disponibles</td></tr><tr><td>Cellules</td><td></td><td></td><td>d’hybridome O1 Milieu conditionné contenant un anticorps anti-O1 à utiliser pour l’immunopanning</td></tr><tr><td>Anticorps O4 - Souris anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternative si les cellules d’hybridome O4 ne sont pas disponibles</td></tr><tr><td>Cellules</td><td></td> <td>d’hybridome O4</td><td>Milieu conditionné contenant un anticorps anti-O4 à utiliser pour l’immunopannage</td></tr><tr><td>Cellules compétentes</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl cellules compétentes</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Suspension de papaïne</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Cadeau aimable du Dr Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Humain)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine 100x solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine (PEI)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp ;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progestérone&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase comprimé (Mini complet)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td></td><td>Fourni avec l’enzyme Clonase</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Lapin &alpha ; neurofilament</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lapin & alpha ; MBP (polyclonal)</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Cellules d’hybridome Ran2</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>Milieu conditionné contenant l’anticorps anti-Ran2 à utiliser pour l’immunopanning</td></tr><tr><td>Anticorps anti CD140A/PDGFRa chez le rat</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> SOC <td>Fourni avec des bactéries compétentes</td></tr><tr><td>Sélénite de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH8</td><td></td><td></td><td>Voir solutions mères</td></tr><tr><td>TNE Tampon</td><td></td><td></td><td></td>de lyse</tr><tr><td>Oligo-éléments B</td><td>Cellgro&nbsp ;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin (apo-Transferrin humain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine à partir du blanc d’œuf de poule</td><td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (1x), rouge de phénol (0,05 %)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Lectine non conjuguée de Griffonia Simplicifolia BSL-1</td><td>Vector laboratories&nbsp ;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire oligodendrocyte précurseur pour in vitro les dosages de la myélinisation

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

La myélinisation est un processus complexe qui implique à la fois les neurones et la myéline formant des cellules gliales, les oligodendrocytes dans le système nerveux central (SNC) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (SNP). Nous utilisons un test in vitro de la myélinisation, un modèle établi pour étudier myélinisation du SNC in vitro. Pour ce faire, les cellules précurseurs d&#39;oligodendrocytes (OPC) sont ajoutés aux primaires rongeurs ganglion de racine dorsale (DRG) neurones purifiés pour former des co-cultures myélinisantes. Pour interroger spécifiquement les rôles que les protéines exprimées par les oligodendrocytes particuliers exercent sur la myélinisation nous avons développé des protocoles qui transduction sélective OPC à l&#39;aide du lentivirus surexprimant type sauvage, les protéines négatives dominantes ou constitutivement active avant d&#39;être ensemencées sur les neurones DRG. Cela nous permet d&#39;interroger spécifiquement les rôles de ces protéines dans la régulation oligodendrogliales myélinisation. Les protocoles peuvent également être appliqués dans l&#39;étude des OTses types cellulaires, offrant ainsi une approche qui permet la manipulation sélective des protéines exprimées par un type cellulaire souhaité, tels que les oligodendrocytes ciblée pour l&#39;étude de la signalisation et des mécanismes de compensation. En conclusion, combinant le dosage de la myélinisation in vitro avec lentiviraux infectés OPC fournit un outil stratégique pour l&#39;analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans la myélinisation.

Le drapeau marqués kinase 1 (Flag-Erk1) liés signal construction utilisé pour la production lentivirus est vérifiée par l'enzyme de restriction digérer des constructions utilisées, y compris les constructions d'2K7 et les emballages et accessoires constructions nécessaires à la production de virus extracellulaire (figure 3) . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> Figure 3: vérification de la c...

Nous présentons ici des protocoles qui offrent une base flexible et stratégique pour manipuler viralement les cellules précurseurs d’oligodendrocytes afin de surexprimer des protéines d’intérêt afin d’interroger spécifiquement leur rôle dans les oligodendrocytes via le modèle in vitro de myélinisation du système nerveux central.

Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour In Vitro Les dosages de la myélinisation

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

L’objectif global de cette procédure est de manipuler viralement les cellules précurseurs d’oligodendrocytes ou OPC pour surexprimer les protéines d’intérêt. Pour l’étude in vitro de la nation de myélinisation du SNC, cela est accompli en clonant d’abord un vecteur lentiviral. Les prochaines étapes consistent à produire le lentivirus et à déterminer la concentration virale optimale pour l’expérience.Ensuite, des OPC disséqués et cultivés sont transduits avec le lentivirus. La dernière étape consiste à ensemencer les OPC transduits sur des neurones cultivés disséqués à partir du DRG. En fin de compte, l’expression de la protéine myélinisée des co-cultures myélinisantes est évaluée par l’analyse par transfert Western et visualisée pour la formation de segments axonaux myélinisés par immunomarquage.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les outils pharmacologiques, est que l’approche lentivirale nous permet de surexprimer sélectivement soit de type sauvage, soit des protéines mutantes dans le type cellulaire souhaité, comme dans ce cas, les oligodendrocytes En préparation, cloner les vecteurs 2K sept lents requis comme décrit dans le protocole textuel le matin du jour de la transfection, préparer 32 millions de cellules T HEK 2 93 dans une fiole T 1 75 contenant 25 millilitres de milieu. Il est essentiel que ces cellules soient collées avant la transfection, alors plaquez-les plus tôt si nécessaire. Dans un tube Falcon de 50 millilitres, préparer un mélange maître pour la transfection du ballon T 1 75 comme indiqué dans le tableau un, ajouter de l’ADN au vortex DMEM chaud, puis ajouter du PEI stérile en dernier pour éviter les précipitations prématurées.Mélangez bien en retournant le tube trois ou quatre fois, puis incubez le mélange pendant environ 15 minutes sur le banc. Changez le média sur les cellules, puis ajoutez le mélange de transfection. DROPWISE mélange doucement le milieu sur les cellules, puis incube les cellules pendant la nuit.Le lendemain. L’expression de la GFP peut être vérifiée par microscopie à fluorescence. 48 heures après la transfection, prélevez le premier lot de surnageant viral et ajoutez 25 millilitres de milieu frais aux cellules.Centrifuger le surnageant viral à 1,140 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant viral sans la pastille de débris cellulaires dans un nouveau tube et stockez-le à quatre degrés Celsius. Le lendemain, 72 heures après la transfection, prélever le dernier lot de centrifugeuse de surnageant viral pour éliminer les débris cellulaires et s’accumuler avec le premier lot de surnageant viral éliminé.Concentrez ensuite le virus en ultra-centrifugeant le surnageant viral à 170 000 Gs pendant 90 minutes. À quatre degrés Celsius. Déchargez l’ultracentrifugeuse et versez le surnageant, laissant un palais d’IPE précipité et du virus, qui n’est pas visible au fond du tube de 30 millilitres.Répétez ce processus. Centrifuger tout le supernat viral par lots dans les mêmes tubes de 30 millilitres pour concentrer le virus afin de le remettre en suspension dans chaque tube d’ultracentrifugation. Ajoutez 500 microlitres de média Sato et couvrez le tube d’un film.Ensuite, faites tourbillonner le tube pendant 30 secondes et délogez mécaniquement la pastille à l’aide d’une pointe de pipette. Répétez ce cycle de délogation du vortex environ six fois pour vous assurer que la pastille est complètement suspendue dans le média Sato. Maintenant, regroupez tous les virus remis en suspension à Sato dans un micro tube frais.Faites brièvement tourner le surnageant accumulé à vitesse maximale pendant une minute. Pour granuler le PEI, prélever le surnageant contenant le virus et filtrer en faisant passer la solution à travers un filtre de 0,45 micron à l’aide d’une seringue pour envelopper. Aliquotez le virus purifié à Sedia dans des volumes de 2050 et de 100 microlitres et stockez-les tous à moins 80 degrés Celsius.Pour ce protocole, disposez de cellules précurseurs primaires d’oligodendrocytes. Les OPC cultivés en plaques de 10 centimètres avec 10 millilitres de sedia contenant les facteurs de croissance suivants, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT trois, et pour les cellules doivent avoir été cultivées pendant 24 heures sous 8 % de dioxyde de carbone. Commencez par aspirer le média et retirez-le complètement.Remplacez-le ensuite par 10 millilitres du même milieu avec les facteurs de croissance. Infectez vos OPC avec du lentivirus, en exprimant la protéine d’intérêt en ajoutant le volume requis de virus goutte à goutte dans le milieu. Également dans une plaque OPC séparée, mélangez le lentivirus témoin qui n’exprime que la GFP dans la culture de milieu, les cellules pendant encore 48 heures.Ensuite, collectez les OPC des plaques pour les ensemencer sur les neurones GRG en culture. Rincez d’abord chaque assiette avec huit millilitres d’EBSS deux fois. Compléter un millilitre de trypsine EDTA 0,05 % avec neuf millilitres d’EBSS chaud.Ajoutez cinq millilitres de trypsine diluée dans chaque plaque. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux minutes maximum. Neutralisez la trypsine en ajoutant cinq millilitres de 30 % de FBS dans EBSS.Puis à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Lavez les OPC de la surface de la plaque. Tournez la plaque d’un quart de tour à chaque fois pour récupérer toutes les cellules.Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à température ambiante pendant 15 minutes à 180 G.Aspirez maintenant le surnageant et le réusateur. Suspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu saddo chaud sans facteurs de croissance et comptez les cellules.Ensuite, préparez les neurones DRG qui sont cultivés sur les lamelles de 22 millimètres en aspirant complètement le milieu de leur plaque. Ensuite, ensemencez doucement 200 000 OPC goutte à goutte sur chaque lamelle. Le volume de semis doit être inférieur à 200 microlitres par lamelle.Laissez les cellules se déposer sans déplacer la plaque Après 10 minutes, garnissez chaque puits d’un millilitre de poudre chaude. Rejouez maintenant les OPC sœurs restants. Les protéines contenant des facteurs de croissance peuvent être utilisées ultérieurement pour vérifier l’expression de la protéine d’intérêt.Un drapeau étiqueté kinase liée au signal extracellulaire. Des enzymes ont été utilisées pour vérifier la construction de l’emballage et la construction accessoire afin de déterminer la dilution optimale du virus à utiliser sur les OPC. Le lentivirus IR a été titré dans les lymphocytes T HEK 2 93 à une gamme de dilution virale jusqu’aux lymphocytes T HEK 2 93.Les niveaux d’expression du gène d’intérêt ont augmenté avec le temps. Ensuite, des OPC purifiés ont été infectés et cultivés pendant au moins deux jours pour assurer l’expression du transgène. Les niveaux de FLAG et de GFP ont été confirmés dans les OPC sœurs.Les OPC ont ensuite été installés sur des neurones DRG. Les OPC se sont ensuite différenciés en oligodendrocytes et, comme l’ont évalué les westerns, ils ont commencé à exprimer des protéines de myéline. Certains oligodendrocytes matures myélinisés, qui ont été visualisés par la coloration MBP des axones, ont été colorés par des neurofilaments ou de la tubuline bêta-trois pour s’assurer que les densités axonales étaient prises en compte.Lors de l’analyse des niveaux de myélinisation Après l’ensemencement des OPC, il est important de cultiver. Les APC sœurs. De cette façon, la protéine d’intérêt ou l’étiquette sur la protéine d’intérêt, cette expression peut être vérifiée dans les APC sœurs si elle ne peut pas être vérifiée dans la co-culture.

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Production et utilisation de lentivirus à des cellules sélective transduction primaire Oligodendrocyte précurseur pour In Vitro Les dosages de la myélinisation

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