Modélisation des muqueuses candidose larves de poisson zèbre par injection vessie natatoire

L’objectif global de cette procédure est de modéliser la candidose muqueuse à l’aide du poisson zèbre juvénile. Pour ce faire, on charge d’abord une solution contenant des albicans vivants dans une micro-aiguille. Dans la deuxième étape, un volume défini de cellules de levure est injecté dans la vessie natatoire d’un poisson zèbre juvénile.

Ensuite, les poissons sont criblés pour un inoculum homogène et incubés pendant la durée souhaitée. Dans la dernière étape, la microscopie confocale est utilisée pour suivre l’interaction dynamique de l’agent pathogène avec le système immunitaire du poisson-zèbre. De plus, la vessie natatoire peut être microscopique disséquée pour obtenir des images confocales à plus haute résolution.

La méthode que nous présentons ici répond à des questions clés de l’immunologie fongique ainsi que de la microbiologie, telles que la séquence précise des événements conduisant à une réponse immunitaire défaillante à l’agent pathogène fongique et aux balises candidales à la surface des muqueuses. Avant de commencer la procédure, réchauffez une boîte d’injection contenant 2 % d’aros dans un incubateur à 33 degrés Celsius. Après 30 minutes, utilisez une pipette de 25 millilitres pour prélever 100 millilitres de milieu E trois plus PTU d’une assiette de poisson zèbre du quatrième jour, en prenant soin de ne pas aspirer le poisson, et ajoutez deux millilitres de quatre milligrammes par millilitre.

Stock de sulfonate de méthane Trica aux médias pour anesthésier les animaux. Après 15 minutes, utilisez un microscope de dissection pour identifier le poisson dont la vessie natatoire est gonflée et utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer 30 poissons zèbres dans la boîte d’injection de préchauffage. Retirez l’excès de support, puis tenez le plat en biais et utilisez une ligne de pêche de 0,012 pouce de diamètre super collée dans un capillaire de boro silicate pour faire trois lignes de 10 poissons alignés verticalement, chaque fois qu’elle vorte complètement un tube d’albicans de mer fraîchement préparés à une concentration de 1,5 fois 10 à la septième UFC par millilitre.

Et puis chargez trois microlitres de la solution de levure dans une micro-aiguille coupée EC. Réglez la durée de l’impulsion sur le réglage approprié. Ensuite, faites pivoter le plat d’injection pour atteindre un angle de 20 degrés entre la micro-aiguille et la tête du poisson en visant l’arrière de la vessie natatoire.

Poussez maintenant la micro-aiguille dans la vessie natatoire, en vous assurant que l’alésage de l’aiguille est dans la lumière et appuyez sur la flaque d’eau. Une fois qu’il est relativement facile de vérifier quels poissons ont été injectés, car le bolus déplace la bulle d’air et l’arrière de la vessie natatoire est ensuite rempli de média, la co-injection de rouge de phénol avec le bolus peut faciliter davantage la visualisation d’une injection réussie. Après avoir injecté les 30 poissons, inondez le plat avec E trois milieux, puis videz le poisson dans le bol de récupération.

Transférez 10 animaux dans un tube à centrifuger de 1,7 millilitre contenant un millilitre de milieu E trois et euthanasiez le poisson avec 200 microlitres de trica. Ensuite, pour chaque animal, disposez quatre gouttes de graisse sous vide dans un carré, à un centimètre d’intervalle sur une micro-lame, et ajoutez deux gouttes de 2 % de fond bas fraîchement préparé au milieu du carré. Ensuite, placez un poisson sur une lame de verre séparée sous un microscope à dissection et vérifiez que le cœur de l’animal a cessé de battre et retirez l’excès d’eau.

Utilisez maintenant une paire de pinces à épiler fines pour maintenir la tête dans une position fixe et une autre pour tirer vers le bas l’intestin antérieur. Ramassez la vessie natatoire par le conduit pneumatique, en la séparant du tube digestif, et placez-la au centre de l’une des micro-lames préparées avant que l’agro ne se solidifie. Enfin, placez une lamelle sur le tissu en appuyant doucement vers le bas jusqu’à ce qu’il touche la graisse sous vide et l’agarose et imagez la vessie natatoire dans les 10 minutes suivant la récolte.

Injection de quatre nanolitres d’albicans de mer à un à 1,5 fois 10 du septième. L’UFC par millilitre donne les données les plus cohérentes, ce qui donne une fourchette de 10 à 50 cellules de levure par poisson. Le rétrécissement de l’inoculum à 15 à 25 cellules de levure donne un phénotype et une réponse encore plus serrés.

Les neutrophiles jouent un rôle clé dans la résistance à la candidose chez la souris et l’homme, et l’infection de la vessie natatoire du poisson zèbre avec des albicans vivants conduit à un recrutement rapide et soutenu de neutrophiles. Cela ne se produit pas lorsque des cellules de levure tuent la chaleur sont injectées. Les filaments se développent rapidement après l’injection des cellules de levure, la croissance filamenteuse se poursuivant pendant les premières 24 heures après l’injection, après quoi ce nombre commence à diminuer la capacité de suivre les poissons de manière non invasive, permet ces études longitudinales et met en évidence les différences individuelles dans la progression de la maladie et les réponses de l’hôte.

Un protocole expérimental qui reste peu praticable dans l’imagerie de la souris, les interactions des cellules immunitaires ou épithéliales avec les c albicans sont relativement faciles dans le modèle présenté ici. Cependant, la dissection de la vessie natatoire qui vient d’être démontrée améliore considérablement la qualité de l’imagerie. Ceci est particulièrement utile lors de la visualisation de lignées de poissons transgéniques où la fluorescence est exprimée de manière ubiquitaire, et il y a une fluorescence étrangère dans les tissus environnants, comme observé dans ces images d’une vessie natatoire disséquée de la lignée de poissons citrines alpha Catine.

En suivant cette procédure. D’autres méthodes, telles que la technologie de morphing ou le traitement d’inhibition chimique, peuvent être utilisées pour répondre à des questions telles que le rôle d’une cellule immunitaire particulière ou d’une voie de signalisation dans la candidose muqueuse.