Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

L’objectif général de l’expérience suivante est d’estimer la production thymique et osseuse en quantifiant les cercles d’excision des récepteurs des lymphocytes T ou REX et K supprimant les cercles d’excision de recombinaison ou les corrige en un seul essai. Ceci est réalisé en construisant d’abord un plasmide à triple insertion contenant des fragments de la séquence d’ADN des corrigés TRX et d’un gène de référence à copie unique afin de maintenir un rapport de un à un entre les trois cibles après l’amplification de l’ADN. Ensuite, une courbe standard est construite en effectuant des dilutions en série du plasmide à triple insert, ce qui permet la quantification absolue des trois séquences cibles par PCR en temps réel et en temps réel.

Enfin, un test PCR en temps réel est effectué permettant de quantifier absolument les tres et les fissures. Les résultats rapportés montrent les changements de la production thymique et osseuse avec l’âge et le sexe chez les enfants et les adultes en bonne santé. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu besoin d’analyser à la fois la moelle osseuse et le débit thymique chez les nouveau-nés ou les nourrissons, étant donné que la quantité de sang habituellement prélevée est rare par rapport aux adultes.

Par conséquent, nous avons décidé de combiner les deux méthodes de quantification des pistes et des corrections en un seul test afin d’optimiser la préparation des échantillons et les coûts des réactifs. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des déficiences immunitaires primaires et acquises, mais la méthode peut également être utilisée dans toutes les maladies impliquant une perte de cellules TMB ainsi que pour étudier de nouvelles reconstitutions après une greffe de moelle osseuse. Elle peut également être appliquée à la recherche fondamentale, principalement celle concernant l’homéostasie des lymphocytes.

Le principal avantage est d’utiliser un triple surplus car une seule cure standard est nécessaire, réduisant ainsi la variabilité expérimentale. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de la longue procédure requise pour la préparation du plasmide à triple insertion ou en raison des problèmes liés à la préparation de la courbe standard. Pour commencer, obtenir un échantillon contenant des cellules très susceptibles d’avoir des TRX et des fissures détectables par PCR, comme le sang périphérique d’un jeune sujet sain collecté dans des tubes EDTA en utilisant une méthode standard de séparation par gradient de densité.

Séparez les cellules mononucléées du sang périphérique après avoir extrait l’ADN des cellules conformément au protocole de texte, utilisez des amorces spécifiques du gène Fort TRX REX et du gène constant alpha TCR pour amplifier les fragments de gène du signal Rex, du signal Rex conjoint et de la constante alpha TCR. Insérez le produit PCR de l’articulation du signal Trax dans le site accepteur TA du vecteur topo PCR 2.1 et utilisez l’ADN plasmidique pour transformer XL une cellule bleue chimiquement compétente par choc thermique, isolez les colonies blanches résistantes à l’ampicilline qui ont perdu la complémentation de la bêta-lactase sur une nouvelle boîte maîtresse et utilisez la PCR pour identifier les colonies contenant le fragment de trek. Après avoir cultivé l’une des colonies positives au trek et isolé l’ADN, utilisez SP un pour digérer le plasmide et le produit amplifié du gène de la constante TCR alpha et ligaturer le fragment de gène de la constante alpha TCR dans le plasmide.

Répétez la transformation, la sélection et l’expansion de la colonie et l’isolement de l’ADN pour insérer le bon fragment, utilisez le postérieur trois plutôt que le SP un pour digérer le plasmide et le bon fragment de PCR et répétez le processus pour ligaturer et isoler l’ADN. Une fois que les séquences des trois inserts ont été vérifiées, élargissez la colonie et purifiez l’ADN plasmidique par préparation MIDI selon le protocole texte pour préparer une courbe standard. Après avoir calculé la masse et la concentration du plasmide comme indiqué ici, décongelez une aliquote du plasmide et montrez-en une pour linéariser deux microgrammes avec l’aliquote linéarisée de l’ADN.

Utilisez la formule C un V un est égal à C deux V deux. Pour calculer le volume de dilution nécessaire pour préparer le premier point de la courbe standard de la série, comme indiqué ici, préparez une série de une à 10 dilutions pour obtenir les points de la courbe standard restants. Conservez la dilution du plasmide à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée Pour préparer les échantillons pour la PCR en temps réel, disposez une plaque PCR qui comprend au moins deux répétitions pour chaque échantillon à analyser de la manière suivante avec deux tubes séparés, l’un pour Rex et les fissures, et l’autre pour la constante alpha TCR.

Préparez les mélanges maîtres pour le nombre total de puits nécessaires. Ajouter 20 microlitres dans les puits de la plaque. Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’ADN génomique extrait de cellules mononucléées du sang périphérique ou BMC P.

Ajoutez cinq microlitres d’eau dans les puits de contrôle sans gabarit avant d’utiliser un couvercle adhésif optique pour sceller la plaque de réaction. Ensuite, décongelez la dilution de la courbe standard de l’ADN plasmidique et préparez la dilution la plus élevée. Ne découvrez que les puits situés entre les rangées A à H et les colonnes un à quatre.

Et après un bref vortex, ajoutez cinq microlitres de chaque point de dilution à son point désigné. Assurez-vous bien qu’il n’y a pas de bulles au fond des puits et que les réactifs se déposent au fond. Utilisez un système de PCR en temps réel pour exécuter le test avec le protocole suivant.

50 degrés Celsius pendant deux minutes et chauffage initial à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, suivi de 45 cycles de dénaturation à 95 degrés Celsius pendant 15 secondes. Et une sonde d’amorce combinée e agenouillement et allongement à 60 degrés Celsius pendant une minute. Pour analyser les données de PCR en temps réel, ouvrez le fichier de résultats enregistré dans le logiciel et cliquez sur l’onglet des résultats en haut de la fenêtre.

Cliquez sur le menu d’analyse et sélectionnez les paramètres d’analyse. Laissez le logiciel déterminer automatiquement le seuil en sélectionnant tous les détecteurs et le TC automatique pour le cycle de seuil. Laissez le logiciel définir une base de référence automatique pour l’élimination de l’arrière-plan par défaut.

Cliquez sur l’onglet nommé graphique d’amplification, et dans la partie la plus à droite de la fenêtre, sélectionnez l’un des trois détecteurs dans le menu déroulant correspondant. Juste en dessous de sélectionner CT manuel pour régler manuellement un seuil dans la partie inférieure de la fenêtre, sélectionnez les puits correspondant aux points de dilution de la courbe standard du détecteur choisi pour afficher les tracés d’amplification en cliquant et en faisant glisser la souris sur les cellules correspondantes du tableau. Pour ajuster manuellement le seuil, faites glisser la ligne de seuil rouge vers le haut ou vers le bas, puis cliquez sur Analyser pour réanalyser les résultats.

Pour vérifier l’impact de la définition du seuil sur les résultats, sélectionnez l’onglet Rapport et consultez le TC résultant des points de dilution de la courbe standard respective. Lorsque vous déplacez le seuil pour obtenir un placement optimal dans l’onglet Graphique d’amplification, vérifiez que le seuil se trouve dans une région d’amplification exponentielle suffisamment au-dessus du bruit de fond, mais en dessous de la phase de plateau. Si le tracé d’amplification n’est pas affiché dans l’échelle logarithmique, faites un clic droit sur le graphique pour rappeler les paramètres du graphique et définir le paramètre Y ais après l’exécution comme log.

Placez le seuil à mi-chemin dans la partie linéaire du graphique et observez les courbes d’amplification à peu près parallèles les unes aux autres. Cliquez sur l’onglet du rapport pour voir les résultats de la TDM. Assurez-vous que le placement du seuil a produit des résultats qui maximisent la précision des deux répétitions de chaque courbe standard.

Points de dilution. Vérifiez que le seuil est placé au point qui reflète le mieux les ordres de grandeur extrêmes des points de dilution de la courbe standard sous l’onglet rapport. Faites glisser à nouveau la souris dans le tableau dans la partie inférieure de la fenêtre pour sélectionner les cellules correspondant aux puits de la courbe standard Pour tous les détecteurs, vérifiez que le TC résultant des trois cibles est très similaire aux mêmes points de dilution.

Par exemple, différence, pas plus de 0,5 CT, réajustez les seuils si nécessaire et vérifiez à nouveau sous l’onglet rapport dans la partie inférieure de la fenêtre. Sélectionnez les puits NTC et vérifiez qu’il n’y a pas d’amplification dans les puits NTC, ce qui correspond à un TC de indéterminé. Sélectionnez l’onglet Courbe standard et, à droite de la fenêtre de tracé, sélectionnez Détecteurs dans le menu déroulant et vérifiez si la pente de la courbe standard signalée est comprise entre moins 3,55 et moins 3,32, ce qui correspond à des efficacités PCR de 91 à 100 %Assurez-vous que le coefficient de détermination ou R au carré est supérieur à 0,998 en vérifiant sa valeur juste en dessous de la pente et de l’ordonnée à l’origine.

Cliquez sur l’onglet rapport et dans les cellules correspondantes du tableau sous le graphique, vérifiez que le TC du témoin positif est cohérent avec les résultats des tests précédents sur le même témoin positif connu. Cliquez sur le menu Fichier, enregistrez, puis exportez vers un fichier CSV pour exporter les quantités de tous les puits dans un fichier texte contenant des valeurs séparées par des virgules. Enfin, importez le fichier CSV dans un tableur et calculez le nombre de pistes ou de corrections par 10 aux six PBM en définissant la formule suivante de manière appropriée.

Le test décrit dans cette vidéo a été réalisé sur un échantillon représentatif de 87 témoins sains, 42 enfants âgés de zéro à 17 ans et 45 adultes de 24 à 60 ans. Comme le montre ici, le nombre de randonnées diminuait fortement avec l’âge en raison de l’involution thymique de zéro à trois à quatre ans chez les adultes.

Le nombre de randonnées dépend également du sexe, car il diminue plus rapidement chez les hommes que chez les femmes, ce qui peut avoir un impact sur la capacité à définir des plages de référence appropriées. Ces graphiques montrent que le nombre de fissures diminuait toutefois avec l’âge, de manière similaire au modèle observé avec les T Trex uniquement chez les enfants. Alors que chez les adultes, la production de moelle osseuse est assez stable tout au long de la vie et ne dépend pas du sexe.

La préparation du plasmide triple en insertion nécessite environ deux ou trois semaines, mais par la suite, les allocations de plasmides stockées dureront trois ans. La partie restante de la technique peut être réalisée en seulement quatre à cinq heures si elle est effectuée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important d’effectuer toutes les manipulations liées aux plasmides dans une zone dédiée pour éviter la contamination croisée de l’ADN.

Il est également essentiel de vérifier la stabilité du tube standard lors de l’analyse des résultats après son développement. Cette technique a fourni aux chercheurs dans le domaine de l’immunologie clinique ou de l’hématologie, un outil amélioré pour l’identification des déficits immunitaires primaires afin de surveiller l’issue de la reconstitution immunitaire, après une greffe de moelle osseuse, ou simplement d’étudier l’homéostasie des lymphocytes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’obtenir le triplet dans le plasmide, de préparer la courbe standard, d’exécuter l’expérience de PCR en temps réel et d’effectuer les calculs nécessaires pour obtenir une quantification absolue reproductible du trax et des fissures.