Name: Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Apprenez à quantifier simultanément les TREC et KREC par PCR en temps réel pour évaluer la production thymique et médullaire. Cette méthode optimise l'analyse immunologique avec des échantillons sanguins limités.

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Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La quantification du TREC et du KREC peut être considérée comme une bonne estimation de la production récente de thymus et de moelle osseuse, à condition que certaines mises en garde soient prises en compte. Même si une méthode de quantification absolue utilisant une courbe standard nécessite plus de réactifs et plus d’espace sur la plaque de réaction de PCR en temps réel, elle garantit des résultats quantitatifs très précis car des quantités d’échantillons inconnues sont interpolées à partir de courbes standard construi...

Cercles d&#39;excision du récepteur des cellules T (TREC) et des cercles recombinaison excision K-suppression (KRECs) sont de petits éléments d&#39;ADN circularisées qui sont excisés dans une proportion de lymphocytes T et les cellules B, respectivement, au cours d&#39;un processus de recombinaison d&#39;ADN génomique, ce qui conduit à la formation d&#39;un répertoire très diversifié de récepteurs T et cellules B. Ils ne ont aucune fonction, mais parce qu&#39;ils sont stables et ne peuvent être reproduites, elles sont diluées après chaque division cellulaire, ainsi que la persistance dans l&#39;une des deux cellules filles. Par conséquent, les niveaux dans le sang périphérique peuvent être considérées comme une estimation de la production de la moelle osseuse et le thymus. Bien que le dosage TREC a été largement utilisé au cours des 15 dernières années pour évaluer l&#39;ampleur de la production thymique, une KREC le dosage, qui a été initialement développé pour mesurer la prolifération des lymphocytes B et sa contribution à l&#39;homéostasie des lymphocytes B dans la santé et la maladie, 2 a été récemment proposé comme marqueur de l&#39;os mflèche sortie. 3,4 Ici, nous décrivons la méthode que nous avons développé pour la quantification simultanée des deux TREC et KRECs. 4 Avec cette méthode combinée, la variabilité associée à la quantification de l&#39;ADN par PCR en temps réel est éliminé par l&#39;utilisation d&#39;une courbe standard unique, obtenue par dilution d&#39;un plasmide à triple insert contenant des fragments de TREC, KRECs et récepteur de cellules T alpha constant (TCRAC) gène dans un rapport de 1: 1: 1. Cela permet une évaluation plus précise du nombre de copies TREC et KREC. De plus, la quantification simultanée des deux cibles dans la même réaction permet de réduire les coûts de réactifs. Le dosage TREC / KREC proposé peut être utile de mesurer l&#39;ampleur de T et cellules B néo-production chez les enfants ou adultes avec déficit immunitaire combiné sévère (SCID), 4 immunitaire commun variable, 5 maladies auto-immunes, 6-8 et l&#39;infection à VIH . 9 En outre, il peut être utilisé poursurveiller le rétablissement immunitaire après greffe de cellules souches hématopoïétiques, 10 le remplacement de l&#39;enzyme, 11 et antiviral 9 ou immunomodulateurs thérapies. 8.6 Enfin, parce que les patients SCID sont comptabilisées en utilisant un dosage TREC malgré les défauts génétiques sous-jacentes, et une agammaglobulinémie patients peuvent être identifiés en utilisant KREC quantification , le dosage TREC / KREC peut également être utilisé pour détecter immunodéficiences dans les programmes de dépistage néonatal. 12 Dans ce cas, le test doit être effectué sur l&#39;ADN extrait de petites taches de sang effacé et séché sur du papier filtre, doit être hautement sensible et spécifique pour les maladies cibles, ainsi que les très reproductible et rentable. L&#39;introduction de KREC quantification dans le test devrait améliorer les performances de dépistage néonatal de déficits immunitaires, qui a régulièrement été effectuées dans les certaines parties des Etats-Unis (WI, MA, CA) depuis 2008 quand le Wisconsin est devenu le premier à Introduce l&#39;analyse de TREC dans son programme de dépistage postnatal. 13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>Méthode de séparation par gradient de densité</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>Extraction d’ADN</td></tr><tr><td>Oligonucléotides d’ADN non modifiés HPSF 0,01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp ;</td><td></td><td>Remettre le produit lyophilisé en suspension à 100 pmol/&micro ; l</td></tr><tr><td>ADN polymérase AmpliTaq : y compris 10x Buffer II et 25 mM MgCl2</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue Subcloning Grade Cellules compétentes</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TE (1 mM TRIS et 0,1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Sondes à double marquage HPLC 0,01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp ;</td><td></td><td>Remettre le produit lyophilisé en suspension à 100 pmol/&micro ; l</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Thermocycler</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Fast 7500 Système de PCR en temps réel</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de détection de séquences SDS 1.4</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification simultanée de t-cell receptor cercles excision (trec) et cercles k-suppression recombinaison excision (krecs) par pcr en temps réel

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

cercles d’excision des récepteurs des lymphocytes T (TRECs) et les cercles d’excision de recombinaison K-supprimant (KRECs) sont des éléments d’ADN circularisés formés au cours du processus de recombinaison qui crée des récepteurs des lymphocytes T et B. Parce que les TREC et les KRECs sont incapables de se répliquer, ils sont dilués après chaque division cellulaire et persistent donc dans la cellule. Leur quantité dans le sang périphérique peut être considérée comme une estimation de la production thymique et médullaire. En combinant un test TREC bien établi et couramment utilisé avec une version modifiée du test KREC, nous avons développé une PCR quantitative duplex en temps réel qui permet de quantifier les lymphocytes T et B nouvellement produits en un seul test. Le nombre de TREC et de KRECs est obtenu à l’aide d’une courbe standard préparée en diluant en série des articulations de signal TREC et KREC clonées dans un plasmide bactérien, ainsi qu’un fragment du gène de la constante alpha du récepteur des lymphocytes T qui sert de gène de référence. Les résultats sont exprimés en nombre de TREC et de KREC/106 cellules ou par ml de sang. La quantification de ces fragments d’ADN s’est avérée utile pour surveiller la reconstitution immunitaire après une greffe de moelle osseuse chez les enfants et les adultes, pour améliorer la caractérisation des déficiences immunitaires ou pour mieux comprendre l’activité de certains médicaments immunomodulateurs.

L'analyse a été effectuée sur un échantillon représentatif de 87 témoins sains: 42 enfants âgés de 0 à 17 (mâles / femelles: 25/17) et 45 adultes âgés de 24 à 60 (hommes / femmes: 29/16). Les résultats ont été obtenus sous forme de TREC et KRECs 10 6 par les PBMC, puis les TREC et KRECs par ml de sang ont été calculés. Le nombre de TREC diminue avec l'âge en raison de l'involution thymique 4, en particulier d'une manière très forte 0-3 - 4 years. Chez les adultes, le no...

Ici, nous décrivons une méthode de quantification simultanée des cercles d’excision des récepteurs des lymphocytes T (TREC) et des cercles d’excision de recombinaison K-supprimant (KREC). Le test TREC/KREC peut être utilisé comme marqueur de la production thymique et de la moelle osseuse.

Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’estimer la production thymique et osseuse en quantifiant les cercles d’excision des récepteurs des lymphocytes T ou REX et K supprimant les cercles d’excision de recombinaison ou les corrige en un seul essai. Ceci est réalisé en construisant d’abord un plasmide à triple insertion contenant des fragments de la séquence d’ADN des corrigés TRX et d’un gène de référence à copie unique afin de maintenir un rapport de un à un entre les trois cibles après l’amplification de l’ADN. Ensuite, une courbe standard est construite en effectuant des dilutions en série du plasmide à triple insert, ce qui permet la quantification absolue des trois séquences cibles par PCR en temps réel et en temps réel.Enfin, un test PCR en temps réel est effectué permettant de quantifier absolument les tres et les fissures. Les résultats rapportés montrent les changements de la production thymique et osseuse avec l’âge et le sexe chez les enfants et les adultes en bonne santé. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu besoin d’analyser à la fois la moelle osseuse et le débit thymique chez les nouveau-nés ou les nourrissons, é

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