Name: Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à loreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Découvrez une approche chirurgicale post-auriculaire pour la livraison virale directe dans la cochlée de souris via la membrane de la fenêtre ronde. Cette méthode minimise le saignement et la mortalité animale.

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Ce travail est soutenu par une subvention R21 des National Institutes of Health et par une subvention de Hearing Research, Incorporated.

NOTE: Toutes les procédures et la manipulation des animaux respecté les lignes directrices en matière d&#39;éthique du NIH et exigences du protocole approuvées du soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université de Californie, San Francisco. 1. Préparation de l&#39;animal pour la chirurgie <ol><li> Effectuer des procédures chirurgicales dans un espace propre dédié. Autoclave tous les instruments de chirurgie, stériliser avec un stérilisateur de billes de verre avant la chirurgie. NOTE: Dans ce protocole, utilisez jour postnatal (10-12) P10-12 souris FVB. Différents âges et souches de souris peuvent être utilisés pour répondre aux besoins d&#39;un projet spécifique. Souris âgés de plus de P40 peut être difficile parce que l&#39;os de bulle devient plus difficile. </li><li> Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg / kg), le chlorhydrate de xylazine (10 mg / kg) et d&#39;acépromazine (2 mg / kg). Commencer la préparation chirurgicale seulement après que l&#39;animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que pincement de l&#39;orteil. Si nécessay, administrer une dose de rappel (un cinquième de la dose initiale) du cocktail anesthésiant pour restaurer le plan anesthésique d&#39;origine. REMARQUE: Prenez soin à cette étape parce que la plupart de la mortalité observée à cet âge est causée par surdose d&#39;anesthésique. </li><li> Couvrir les yeux de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique de protection pour garder les yeux humides pendant l&#39;anesthésie, la suppression clin réflexe de l&#39;animal. </li><li> Placez la souris avec le cou étendu sur un coussin chauffant toute la procédure jusqu&#39;à ce que la souris est totalement éveillé, pour éviter post-anesthésie hypothermie. </li><li> Rasez la région post-auriculaire gauche avec un clipper et désinfecter avec 70% d&#39;éthanol et povidone-iode avant manipulation chirurgicale. </li></ol> 2. La procédure chirurgicale et Vector Injection <ol><li> Utiliser une approche post-auriculaire pour exposer la bulle tympanique. Incisez le tissu sous-cutané avec de petits ciseaux pour exposer le muscle post-auriculaire. Après la rétraction du tissu adipeux de the côté postérieur de l&#39;incision, séparer les muscles à droite et gauche perpendiculaire à l&#39;incision pour exposer l&#39;os temporal. Assurez-vous que cette incision est assez long pour travailler confortablement avec visualisation adéquate. </li><li> Perforer la bulle tympanique avec une aiguille G 25 et d&#39;élargir le trou si nécessaire avec une pince en pelant l&#39;épine dorsale pour permettre l&#39;accès à la tour basal de la cochlée, puis creuser suffisamment pour visualiser l&#39;artère stapédienne et la membrane de la fenêtre ronde (MLE) . </li><li> Piquer la gestion des déchets radioactifs doucement dans le centre avec une pipette borosilicate capillaire. Observez efflux fluide à travers la gestion des déchets radioactifs à ce point; ce est normal. Attendre jusqu&#39;à ce que l&#39;écoulement se est stabilisée (le fluide effluxed de la cochlée est séchée avec un papier filtre stérile). REMARQUE: Prenez soin lors de la tenue et de faire progresser l&#39;aiguille de verre afin que la perforation RWM est aussi faible que possible. Selon le microscope utilisé, détiennent les pipettes en utilisant un micromanipulateur ou à la main en utilisant une pipettetitulaire. </li><li> Préparer les pipettes d&#39;injection à l&#39;aide d&#39;une pipette extracteur de la même façon pipettes de patch-clamp sont préparés. Assurez-vous que le diamètre de la pointe est grande (environ 15 pm de diamètre) de sorte que le pipetage de virus et arrière se fait aisément. </li><li> Dresser 1-2 pi de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP dans une pipette d&#39;injection. Après l&#39;efflux est stabilisé (5-10 min), micro-injection de ce volume fixe dans la rampe tympanique par le même trou préalablement faite dans RWM. </li><li> Sceller la niche RW rapidement après avoir retiré la pipette avec un petit bouchon de muscle et le fixer avec une petite goutte de colle de tissu placé sur le muscle pour éviter les fuites de la fenêtre ronde. REMARQUE: Sceller ce trou très bien après que l&#39;aiguille est enlevée avec un petit bouchon de muscle pour empêcher toute fuite de périlymphe de la cochlée-cette étape est essentielle pour préserver l&#39;audition. Le défaut de sceller complètement le MLE se traduira par la perte d&#39;audition au fil du temps. </li><li> Après l&#39;injection, couvrir letrou dans la bulle auditive avec le tissu adipeux, les muscles revenir post-auriculaires et les tissus adipeux à leur position normale et suturer la plaie en couches avec une suture absorbable chromique 6-0 ou plus petit. </li><li> Désinfectez la plaie avec de la povidone-iode. </li></ol> 3. Soins postopératoires <ol><li> Placez la souris dans une cage chaud et ne les laissez pas sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient complètement rétablis, puis replacez-les avec la mère. Il est recommandé de retirer le mâle de la cage avant de mettre les chiots de retour avec la mère. </li><li> Administrer sous-cutanée Carprofène (2 mg / kg) pour l&#39;analgésie postopératoire et toutes les 24 heures par la suite pour trois jours, pour gérer l&#39;inflammation et la douleur. Surveiller les animaux quotidiennement les signes de détresse, la perte de poids anormale, la douleur, ou une infection. Généralement par le 3 e jour après la chirurgie toutes les souris doivent agir normalement. Si des signes de détresse ou de maladie apparaissent dans une souris après la 3 e jour, envisager l&#39;euthanasie til la souris selon les directives institutionnelles. </li></ol> 4. L&#39;évaluation de la fonction cochléaire Après livraison viral en utilisant auditif du tronc cérébral (ABR) Recordings NOTE: La réponse du tronc cérébral (ABR) est un auditoire potentiel extrait de l&#39;activité électrique dans le cerveau continue et enregistré par l&#39;intermédiaire d&#39;électrodes placées sous le cuir chevelu évoquée. L&#39;animal est stimulé avec du son. L&#39;enregistrement résultant est constitué de cinq vagues qui reflètent l&#39;activité électrique des points successifs dans la voie auditive dans les 10 premières millisecondes après l&#39;apparition d&#39;un stimulus auditif. <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine comme décrit à la section 1.2 de ce protocole, à l&#39;exception sans acépromazine. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant à travers le test d&#39;audition jusqu&#39;à ce que la souris est totalement éveillé, pour éviter post-anesthésie hypothermie. REMARQUE: Utilisezles stimuli sonores suivants dans cette expérience: cliquez (5 ms durée; 31 Hz taux de présentation). </li><li> Placez électrodes aiguilles sous-cutanés au sommet, au-dessous du pavillon de l&#39;oreille gauche (de référence), et en dessous de l&#39;oreille controlatérale (sol) et commencer ABRs enregistrement comme décrit précédemment dans une chambre insonorisée 27,28. Enregistrez formes d&#39;onde ABR dans cinq intervalles dB de niveau de pression sonore en baisse par rapport amplitude maximale. </li><li> Déterminer les seuils ABR postopératoire dès que quatre jours après l&#39;accouchement virale REMARQUE: Le seuil est définie comme le niveau de stimulation le plus bas auquel Réponse de pics pour les ondes I-V ont été clairement et de façon répétée présente sur une inspection visuelle. </li><li> Mesurer la vague I pour analyser l&#39;activité du nerf cochléaire. Le niveau de stimulation le plus bas qui produit un signal détectable ABR est défini comme le seuil. </li></ol> 5. Cochlear Transgene expression des protéines par immunofluorescence <ol><li> Anesthésier la souris par une surdose de intraperitoneal injection d&#39;un mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine tel que décrit à la section 1.2 de ce protocole, à l&#39;exception sans acépromazine. </li><li> Décapiter la tête seulement après que l&#39;animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que pincement de l&#39;orteil. </li><li> Disséquer la cochlée et le processus sur l&#39;ensemble de montage immunofluorescence comme décrit 26. Un protocole détaillé de l&#39;ensemble du montage cochléaire immunofluorescence en utilisant des anticorps anti-myosine 7a anti-VGLUT3 et est décrite dans Akil et al., 2013 29. </li><li> Pour l&#39;étiquetage des GFP, incuber les entiers montures cochléaires nuit à 4 ° C avec un anticorps de lapin anti-GFP au 1: 250 dilution. </li><li> Rincer la cochlée deux fois pendant 10 min avec du PBS et ensuite incuber pendant 2 heures à l&#39;anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à Cy2 dilué à 1: 4000 dans du PBS. </li><li> Rincer la cochlée deux fois avec du PBS pendant 10 minutes et les incuber avec du DAPI pendant 15 min. </li><li> Monter la cochlée sur des lames de verre et observer under un microscope avec immunofluorescence confocale. </li></ol>

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<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
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</ol>

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Dans ce travail, nous décrivons en détail une technique qui peut être utilisé pour la thérapie génique cochléaire, dans le but de rétablir ou sauvetage fonction auditive normale qui est compromise par un défaut génétique. Comme il est généralement atraumatique, cette approche est sans danger pour le transfert de gènes cochléaire ou d&#39;autres thérapies moléculaires potentielles 30. D&#39;autres approches pour la thérapie cochléaire ont été décrits, y compris une approche ventrale 24, 31,32 et coc...

La thérapie génique a longtemps été suggérée comme un traitement potentiel pour la perte auditive génétique, mais le succès dans ce domaine est resté inaccessible 1. À ce jour, les méthodologies viralement médiation ont prédominé en raison de la capacité théorique de cibler des types cellulaires spécifiques dans la cochlée relativement inaccessible. Les deux adénovirus (AV) et le virus adéno-associé (AAV) ont été utilisés pour la livraison de gènes cochléaire. AAV sont avantageux dans la cochlée d&#39;un certain nombre de raisons. Ils sont des virus à réplication déficiente et peuvent transférer efficacement molécules transgéniques pour différents types de cellules, y compris les neurones, une cible importante pour un certain nombre de causes de la perte auditive. AAV entrée dans la cellule est médiée par des récepteurs spécifiques 2; Ainsi, le choix d&#39;un serotype particulier doit être compatible avec les types de cellules à une transduction. AAV peut effectivement transfection de cellules de cheveux 3 et intégrer dans le génome de l&#39;hôte, entraînant stable, expression à long terme de la transgenic protéines et le changement phénotypique dans la cellule 4. Bien que pas nécessairement avantageux pour des applications à court terme tels que la régénération des cheveux-cellulaire, l&#39;expression à long terme est très important pour le sauvetage stable de défauts génétiques. Parce que les AAV ne sont pas associés à une maladie humaine ou l&#39;infection et ne démontrent aucune ototoxicité 5,6,7, ils sont un candidat idéal pour une utilisation en thérapie génique pour les formes héréditaires de perte de 8 entendre. Transfert de matériel génétique exogène dans l&#39;oreille interne des mammifères en utilisant des vecteurs viraux a été étudié au cours de la dernière décennie et est en train de devenir une technique prometteuse pour le traitement des formes à la fois génétiques et acquis de la perte auditive neuf. La cochlée est potentiellement une cible idéale pour la thérapie génique pour plusieurs raisons: 1) son petit volume nécessite un nombre limité de virus nécessaire; 2) son isolement relatif des autres effets des limites des systèmes d&#39;organes secondaires; et 3) les chambres remplies de liquide faciliter viraleenvoi dans toute le labyrinthe 10, 11,12,13,14, 15. Des modèles murins de la surdité congénitale permettent une utilisation de plusieurs méthodes d&#39;étude pour suivre le développement de l&#39;oreille interne d&#39;une manière reproductible systématique. Alors que la petite taille de cochlée de souris ne présente une certaine difficulté chirurgicale, la souris sert un modèle extrêmement important dans l&#39;étude de la perte auditive génétique, avec plusieurs avantages expérimentaux sur les autres espèces 16. Des modèles de souris permettent d&#39;évaluer un éventail de caractéristiques à travers l&#39;analyse de liaison génétique, la collecte d&#39;observations morphologiques détaillées, et la simulation de scénarios pathogènes; en tant que tels, ils sont de bons candidats pour la thérapie génique à médiation virale. De vastes études génétiques chez les souris combinées avec les avancées technologiques ont permis de générer des souris génétiquement modifiées de façon reproductible dans les laboratoires 17,18, 19, 20,21. AILLEURSe, il existe de nombreux modèles à la fois pour acquises et héréditaires auditives phénotypes de perte chez la souris, ce qui permet des tests rigoureux dans ce modèle animal 22, 23,24. Ainsi, la correction auditive en utilisant la thérapie génique virale médiation dans un modèle de souris est une première étape appropriée dans la recherche d&#39;un remède pour la maladie humaine. Nous avons précédemment montré que les souris transgéniques dépourvues de glutamate transporteur vésiculaire 3 (VGLUT3) naissent sourds en raison du manque de la libération de glutamate à l&#39;IHC ruban synapse 25. Étant donné que cette mutation ne conduit pas à une dégénérescence primaire des cellules ciliées sensorielles, ces souris mutantes sont potentiellement un excellent modèle pour tester dans laquelle la thérapie génique pour cochléaire surdité congénitale. A ce jour, un certain nombre de techniques de délivrance viraux pour la thérapie génique cochléaire ont été décrites, y compris autour de diffusion de la membrane de fenêtre, l&#39;injection de la membrane de fenêtre ronde et la livraison via une cochléostomie. Il ya puissanteial avantages et les inconvénients de chacune de ces approches neuf. Nous rapportons ici une méthode chirurgicale pour la livraison de gènes à médiation virale de l&#39;oreille interne VGLUT3 KO souris à travers la membrane de la fenêtre ronde (MLE). La méthode d&#39;injection RWM post-auriculaire est peu invasive avec une excellente conservation de l&#39;audience, et est relativement rapide. Comme nous l&#39;avons déjà publié, dans un effort pour restaurer l&#39;audition dans ce modèle de souris, un vecteur AAV1 portant le gène de VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) a été introduit dans la cochlée de ces souris sourds au jour postnatal 12 (P! @), Résultant en la restauration de l&#39;audition 26. Audience chez les souris KO VGLUT3 a été vérifiée par la réponse du tronc cérébral (ABR), tandis que l&#39;expression de la protéine transgénique a été vérifiée par immunofluorescence (IF). Cette méthodologie démontre ainsi que la thérapie génique à médiation virale peut corriger un défaut génétique qui serait sinon résultats de la surdité.

<table><tbody><tr><td>Kétamine</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acépromazine</td><td>Fourni par UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analgésie du carprofène</td><td>Fourni par UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bétadine</td><td>Bétadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dexaméthasone pommade ophtalmique (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 25G</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Pipette capillaire en borosilicate</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Suture PDS*plus Antibactérien</td><td></td><td>Ethicon PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Colle tissulaire (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Lapin Anticorps anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td>Micropipette <td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Flaming/ Marron &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Extracteur Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modèle P-97&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système TDT BioSig III&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ; Technologies</td><td></td><td></td> Tucker-Davis</tr></tbody></table>

méthode chirurgicale pour virally mediated gene livraison à l&#39;oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

La thérapie génique, utilisé pour réaliser la récupération fonctionnelle de surdité neurosensorielle, promet d&#39;accorder une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et génétiques sous-jacents qui contribuent à la perte d&#39;audition. Introduction de vecteurs dans l&#39;oreille interne doit être fait d&#39;une manière qui distribue largement l&#39;agent tout au long de la cochlée, tout en minimisant les blessures aux structures existantes. Ce manuscrit décrit une approche chirurgicale post-auriculaire qui peut être utilisé pour la thérapie cochléaire de la souris en utilisant moléculaire, pharmacologique, et la livraison virale à des souris de jour postnatal 10 ans et plus par l&#39;intermédiaire de la membrane de la fenêtre ronde (MLE). Cette approche chirurgicale permet la livraison rapide et directe dans la rampe tympanique tout en minimisant la perte de sang et d&#39;éviter la mortalité animale. Cette technique consiste négligeable ou pas de dommages aux structures essentielles de l&#39;oreille interne et moyenne ainsi que les muscles du cou tout en préservant totalement audience. Pour démontrer l&#39;efficacité de cette technique chirurgicale, la glutam vésiculairetransporteur mangé trois KO (VGLUT3 KO) chez la souris sera utilisé comme un exemple d&#39;un modèle de souris de la surdité congénitale qui récupère entendu après la livraison de VGLUT3 à l&#39;oreille interne en utilisant un virus adéno-associé (AAV-1).

Pour vérifier les caractéristiques techniques et l'utilité de l'approche post-auriculaire pour la thérapie moléculaire cochléaire, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP et AAV2-GFP ont été livrés à des souris P10-12 oreille interne via le MLE. Cette approche démontre l'expression du transgène avec succès dans les cellules ciliées internes (IHC) (VGLUT3 Figure 1 et la GFP Figure 2 et la GFP figure 3A), les cellules ciliées externes (CCE) (GFP Figure 2) et des cellules d...

L’approche chirurgicale post-auriculaire décrite permet une administration rapide et directe dans la rampe tympanique cochléaire de souris tout en minimisant la perte de sang et la mortalité animale. Cette méthode peut être utilisée pour la thérapie cochléaire en utilisant l’administration moléculaire, pharmacologique et virale à des souris postnatales à travers la membrane de la fenêtre ronde.

Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l&#39;oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

L’objectif général de cette procédure est de décrire une approche chirurgicale postauriculaire qui permet l’administration rapide et directe du virus dans le timi de l’échelle Cochléaire de la souris à travers la membrane de la fenêtre ronde. Ceci est accompli en exposant d’abord la bulle tympanique. Dans la deuxième étape, le tissu est perforé et l’artère edia et la membrane de la fenêtre ronde sont visualisées.La membrane ronde de la fenêtre est ensuite perforée et le virus est injecté dans le spon. Dans la dernière étape, le trou est scellé. En fin de compte, l’expression de la protéine transgène et la récupération de l’audition de l’animal peuvent être évaluées par microscopie immunofluorescente et mesure de la réponse auditive du tronc cérébral respectivement.Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la cochographie, la stomie et l’approche ventrale sont que l’injection postulaire de la membrane de la fenêtre ronde est peu invasive et relativement rapide, permet des injections de volume plus élevé et facilite la transfection généralisée de diverses cellules dans toute la cochlée. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront des difficultés car la procédure dépend fortement d’une compréhension approfondie de l’anatomie de la cochlée. Après avoir confirmé l’anesthésie par l’orteil, pincez raser la région postauriculaire gauche et désinfecter la peau d’une souris postnatale de 10 à 12 avec 70 % d’éthanol et de povidone iodée.Couvrez ensuite les yeux d’une pommade ophtalmique protectrice et positionnez l’animal avec le cou tendu sur un coussin chauffant. Lorsque la préparation chirurgicale est terminée, incisez le tissu sous-cutané avec de petits ciseaux pour exposer le muscle postauriculaire. Après avoir rétracté le tissu adipeux vers le côté postérieur de l’incision, séparez les muscles des côtés droit et gauche perpendiculairement à l’incision.Pour exposer l’os temporal, utilisez une aiguille de calibre 25 pour perforer la bulle tympanique, en recollant l’os avec une pince si nécessaire pour élargir le trou et permettre l’accès à la tour basale de la cochlée. Ensuite, élargissez suffisamment le trou pour permettre la visualisation de l’artère staed et de la membrane de la fenêtre ronde. Percez doucement la membrane ronde de la fenêtre au centre avec une pipette capillaire en silicate burro.Séchez la membrane ronde de la fenêtre avec un papier filtre stérile. Attendez ensuite cinq à 10 minutes pour que le flux de liquide se stabilise à cette étape. Faites attention lorsque vous tenez et avancez la pipette, afin de réduire au maximum la perforation de la membrane de fenêtre ronde.Selon l’utilisation du microscope, la pipette peut être tenue à la main ou à l’aide d’un manipulateur micrométrique. Comme vous pouvez le voir ici, nous tenons la pipette à la main car le microscope est trop proche de la souris pour permettre un micromanipulateur. Maintenant, aspirez un à deux microlitres du virus dans une pipette en verre tiré avec une pointe de 15 micromètres de diamètre et micro-injectez le virus dans l’échelle du timoni à travers le même trou précédemment fait dans la membrane de la fenêtre ronde.Retirez ensuite la pipette et scellez rapidement la niche de la fenêtre ronde avec un petit bouchon de muscle, en la fixant avec une petite goutte d’adhésif pour tissu. Couvrez le trou dans la bulle auditive avec du tissu adipeux et ramenez les muscles postauriculaires et le tissu adipeux à leur position normale. Ensuite, à l’aide d’une suture chromique résorbable de 6,0 ou moins, fermez la plaie et désinfectez la zone d’incision avec de la povidone iodée.Placez ensuite la souris dans une cage chaude, en rendant le pop à la mère après une récupération complète avec une surveillance quotidienne. Pour évaluer la fonction cochléaire dès quatre jours après l’administration virale, placez un animal transfecté sous sédatif sur un coussin chauffant, puis placez des électrodes d’aiguille sous-cutanées au sommet sous le pavillon de l’oreille gauche et sous l’oreille controlatérale. Enfin, commencez à enregistrer les réponses auditives du tronc cérébral ou un BR dans une chambre insonorisée comme décrit précédemment, en mesurant la première vague pour analyser l’activité du nerf cochléaire comme on le voit dans le support du trou cochléaire.Cette approche démontre l’expression réussie du transgène dans les cellules ciliées internes, les cellules ciliées externes et les cellules de soutien sans lésion significative de l’organe COR T que différents types de cellules exprimant la GFP peuvent être observés dans le trou cochléaire. Mount démontre que le choix du sérotype viral adéno-associé doit être compatible avec les types de cellules à transduire. Le nombre de cellules transfectées varie en fonction de la concentration et du volume injecté par le virus.Dans ce cas, l’augmentation de 0,6 à un microlitre a entraîné une augmentation du nombre de cellules transfectées à un niveau comparable à celui du transgène du fessier trois de type V sauvage a été restaurée chez les souris KO injectées comme le montrent ces images ici, l’effet de l’administration de la membrane de fenêtre ronde postauriculaire du virus V GL trois dans l’oreille interne des souris knock-out V gl trois sur le sauvetage auditif est démontré comme on le voit dans le graphique. Les traces A BR ont été restaurées chez les trois souris knock-out sauvées de la VLU, atteignant des seuils comparables à ceux observés chez les souris de type sauvage. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre son temps pour chaque étape afin d’éviter d’endommager les structures de l’oreille interne et moyenne ainsi que les muscles du cou.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une approche post-chirurgicale pour l’administration de traitements expérimentaux viraux pharmacologiques moléculaires dans le squelette des MA à travers la membrane de vent ronde.

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Source : Akil, O., et al., Méthode chirurgicale pour la livraison de gènes à médiation virale à l’oreille interne de la souris à travers la membrane de la fenêtre ronde. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la procédure d’administration d’un gène thérapeutique dans l’oreille interne d’un bébé souris atteint d’une perte auditive d’origine génétique. À l’aide d’un vecteur viral adéno-associé (AAV), le gène est injecté à travers la membrane de la fenêtre ronde, ce qui permet aux particules...

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