Haut Débit Fluorometric Technique pour l'évaluation de phagocytose des macrophages et l'actine polymérisation

L’objectif général de l’expérience suivante est de quantifier les modifications du processus phagocytaire ou de l’action dans la polymérisation suite à l’ajout d’agonistes ou d’antagonistes. Ceci est réalisé en ajoutant des particules marquées par fluorescence aux cellules phagocytaires et en laissant suffisamment de temps pour que la phagocytose ait lieu. Dans un deuxième temps, pour arrêter la phagocytose, les cellules sont traitées avec du bleu triam pour éteindre la fluorescence des particules non internalisées, lavées et ensuite fixées avec du paraldéhyde.

Vient ensuite la coloration et la quantification. Afin de faciliter la détection fluorescente des cellules et des particules, cellules maintenues avec DPI ou actine, les résultats montrent l’effet du traitement sur la phagocytose et la polymérisation de l’actine quantifié par un rapport fluorescence vert-rouge à bleu basé sur l’analyse fluorométrique. Le principal avantage de la technique fluorométrique par rapport aux méthodes existantes est qu’il s’agit d’une méthode rentable à haut débit pour l’évaluation de la phagocytose.

Il permet une manipulation minimale de l’échantillon et une quantification rapide de l’intensité fluorescente par cellule. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie et de la biologie cellulaire, telles que l’efficacité et la rapidité de cette clairance pathogène. Action polymérisation modifiant pendant la phagocytose et comment la phagocytose ou la polymérisation axonale est-elle modulée par des agonistes ou des antagonistes.

Pour commencer la plaque de procédure, les macrophages de la lignée cellulaire Murin J 7 74 dans une plaque de 96 puits à fond clair ou noir incubent les cellules d’adhérence à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures pour permettre l’ajout à la plaque. Ensuite, ajoutez les agonistes ou antagonistes souhaités ou le contrôle du véhicule dans les cellules à une concentration de deux x dans 50 microlitres de PBS ou de milieux supplémentés et incubez pendant la durée souhaitée. Au cours de cette étape, assurez-vous que les particules fluorescentes et les étiquettes sont protégées de la lumière à tout moment pendant le traitement, le lavage et l’incubation.

Afin d’éviter le photoblanchiment, utilisez les particules en suspension telles que les billes de dextra marquées par fluorescence ou la solution mère pendant une minute. Ensuite, ajoutez une quantité égale de réactif d’opsonisation aux particules fluorescentes et faites un vortex vigoureux pendant une minute supplémentaire. Par la suite, incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure après l’incubation centrifuge, les particules étaient de cinq minutes.

À 500 fois G.Retirer le surnageant S contenant l’excès de réactif opsonisant. Après cela, lavez les particules avec 100 microlitres de PBS. Vortex l’échantillon pour remettre la pastille en suspension et la centrifuger pendant cinq minutes de 500 à fois G. Répétez ces étapes deux fois de plus pour assurer une optimisation correcte et l’élimination de l’anticorps non lié.

Pour préparer la solution de travail des particules ionisées, remettre les particules en suspension dans cinq millilitres de milieu. Ensuite, rangez-le à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Placez maintenant la solution de travail des particules dans un réservoir de réactif stérile.

Ajoutez 50 microlitres de particules d’opsonisation aux cellules préparées précédemment jusqu’à une concentration finale de 15 nanogrammes par millilitre, et permettez à la phagocytose de se produire dans des conditions de culture cellulaire standard. Pour la méthode de phagocytose continue, comptez 30 minutes à une heure pour que les particules fluorescentes atteignent le fond du puits et entrent en contact avec les cellules. Si vous menez une expérience sur le cours du temps, ajoutez des bactéries à différents intervalles de temps et arrêtez toute la plaque de réactions en même temps.

Pour accélérer le traitement des cellules d’adhérence, retirez le sennet et ajoutez 50 microlitres de triam blue dilué avec du PBS afin d’éteindre la fluorescence des bactéries non internalisées après l’incubation de trian. Lavez la plaque deux fois avec du PBS pour éliminer tout résidu de trian. Ensuite, fixez les cellules avec 50 microlitres de paraldéhyde à 4 % et incubez pendant 15 minutes à température ambiante.

Lavez ensuite l’assiette avec du PBS. Retirez tout le liquide et ajoutez 50 microlitres de DPI Après cinq minutes de coloration, lavez la plaque deux fois avec du PBS. Par la suite, ajoutez 50 microlitres de PBS dans chaque puits et enregistrez la phagocytose après fixation du paraldéhyde.

Lavez la plaque deux fois avec 100 microlitres de PBS par puits pour chaque lavage. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 0,1 % Triton X 100 dans du PBS dans les cellules pour la perméation et incubez-les pendant trois à cinq minutes à température ambiante. Ensuite, lavez deux fois le 0,1 % Triton X avec du PBS.

Bloquez ensuite les cellules avec 1 % de BSA pendant 20 minutes pour éviter une liaison non spécifique de l’étiquette. Préparez maintenant la solution de travail de la coloration Rod domine en ajoutant 100 microlitres de solution mère de méthanol dans cinq millilitres de PBS. Après le blocage, retirez immédiatement la solution BSA.

Ajoutez 50 microlitres de rumine foid et de solution de travail dans chaque puits et incubez les cellules dans l’obscurité pendant 20 minutes à température ambiante. Pour quantifier la phagocytose, placez la plaque dans un lecteur de plaque fluorescente Enregistrez la fluorescence verte à l’aide d’un filtre d’excitation à une longueur d’onde de 488 nanomètres et d’un filtre d’émission à une longueur d’onde de 518 nanomètres et la fluorescence bleue à l’aide d’un filtre d’excitation à une longueur d’onde de 355 nanomètres et d’un filtre d’émission à une longueur d’onde de 460 nanomètres. Pour quantifier la polymérisation de l’actine à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes, enregistrez la fluorescence rouge via un filtre d’excitation à une longueur d’onde de 584 nanomètres et un filtre d’émission à une longueur d’onde de 620 nanomètres et une fluorescence bleue.

Feu et excitation Filtre à une longueur d’onde de 355 nanomètres et un filtre d’émission à une longueur d’onde de 460 nanomètres. Ensuite, divisez la RFU totale de fluorescence verte ou rouge par la lecture de fluorescence bleue en fonction de l’étiquette de la particule ou de la quantification des phagocytes par rapport à l’actine due à une plaque élevée. Pour corriger la variance, utilisez des indices relatifs afin de mieux illustrer les tendances observées et de faciliter une analyse statistique plus fiable.

Cette image illustre les changements dans la polymérisation de l’actine suite à l’ajout d’inhibiteur. Il s’agit de la formation des pseudopodes et voici les changements dans le froissement membranaire. Dans cette image, les cellules ont été autorisées à internaliser des billes X conjuguées ajustées à un rapport perle/cellule de 20 pour une pendant 60 minutes.

Ensuite, les cellules seront lavées avec du trian et du PBS fixé avec du paraldéhyde, perméables à l’acétone et colorants pour l’actine F En utilisant la domine en bâtonnet, la longe F et le dpi, la phagocytose continue des particules opsonisées et non oxydées est tout à fait comparable. Où J 7 74 cellules internalisent des billes supplémentaires. Il est intéressant de noter que la polymérisation de l’actine après la phagocytose augmente, ralentissant à des moments ultérieurs, tandis que la polymérisation de l’actine après l’internalisation des particules unop n’augmente ni l’une ni l’autre des méthodes phagocytaires utilisant des particules dextra n’entraîne de changements dans la viabilité cellulaire Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures avec plusieurs plaques à la fois si elle est effectuée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’analyse métrique Fluor en tant que méthode efficace, rentable et à haut débit d’analyse de la phagocytose et d’autres processus cellulaires.