Une procédure pour l'implantation d'une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale In Vivo Imagerie du cordon spinal de souris

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure pour l'implantation d'une chambre d'imagerie optique chronique sur la moelle épinière dorsale d'une souris vivante. La chambre, la procédure chirurgicale, et l'imagerie chronique sont examinées et démontrées.

L’objectif global de cette procédure est d’implanter une chambre d’imagerie sur la moelle épinière dorsale d’une souris afin de permettre une imagerie optique longitudinale sans avoir besoin de crises chirurgicales répétées. Ceci est accompli en exposant d’abord trois vertèbres thoraciques et en enlevant les tissus mous au-dessus de la colonne vertébrale. La deuxième étape consiste à clamper les vertèbres exposées à l’aide des pièces latérales de la chambre et à effectuer une laminectomie dorsale.

Ensuite, la plaque supérieure de la chambre est fermement fixée sur la moelle épinière exposée et scellée à l’aide d’un élastomère de silicone et d’un verre de protection. La dernière étape consiste à sceller la peau autour de l’implant à l’aide d’adhésifs et à permettre à l’animal de se rétablir. En fin de compte, la microscopie à fluorescence multiphotonique est utilisée pour imager le comportement cellulaire et la structure tissulaire de la moelle épinière avec une résolution subcellulaire au fil du temps.

Le principal avantage de notre nouvelle méthodologie par rapport aux méthodes existantes, telles que l’ouverture chirurgicale répétée de la moelle épinière, est la possibilité d’avoir un nombre presque arbitraire de points temporels d’imagerie répartis sur une longue période de temps sans les complications associées à une chirurgie répétée, telles qu’une infection potentielle, un traumatisme chirurgical ou un stress animal. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous considérions le succès précédent de l’imagerie longitudinale après une lésion de la moelle épinière chez le poisson zèbre transparent. Nous avons ensuite décidé d’étendre ce paradigme au modèle mammifère.

Commencez cette procédure en rasant la zone de l’arc thoracique d’une souris anesthésiée à l’aide de fluor. Retirez ensuite les poils coupés. Ensuite, administrez le mélange de solution saline, de kétoprofène et de dexaméthasone à la souris par voie sous-cutanée.

À l’aide de cotons-tiges. Effectuez trois lavages alternés d’iode et d’éthanol à 70 %, et attendez une minute entre les lavages. Après cela, administrez 100 microlitres de bupivacaïne à 0,125 % au centre du patch rasé par voie sous-cutanée pour réduire la douleur au site d’incision.

Transférez ensuite la souris sur les attaques stéréo personnalisées. Insérez le thermomètre rectal et attendez environ 10 minutes pour que la bupivacaïne fasse effet au microscope. Créez une incision de cinq millimètres au-dessus des vertèbres d’intérêt avec une lame de scalpel.

Après cela, augmentez la taille de l’ouverture dans la peau par dissection émoussée. Ensuite, dissociez doucement le fascia conjonctif entre la peau et le muscle sous-jacent. Maintenez la peau en arrière pour une plus grande zone de travail avec les écarteurs et faites attention à ne pas augmenter le poids sur la poitrine et gêner la respiration.

Saisissez ensuite le rostral, la plus grande vertèbre qui sera exposée à travers le muscle sus-jacent avec une paire de pinces. Coupez le tissu des deux côtés de l’apophyse dorsale en l’éloignant de trois vertèbres. Par la suite, retirez tout le tissu sus-jacent du stratifié dorsal.

Ensuite, coupez soigneusement les tendons attachés aux vertèbres sur les deux bords latéraux de la colonne vertébrale. Retirez délicatement autant de tissu que possible des bords latéraux de la colonne vertébrale afin d’obtenir une surface de serrage propre. Ensuite, débridez doucement les vertèbres de tous les tissus mous restants.

À l’aide d’un grattoir à os et d’un coton-tige, coupez tout tissu incongru à l’aide des ciseaux chirurgicaux. Ensuite, ajustez les écarteurs pour retenir le tissu entourant la colonne vertébrale. Avec la peau, fixez les barres latérales de l’implant aux broches des poteaux de livraison et placez-les dans les supports de poteaux.

Ensuite, serrez les trois vertèbres. Utilisez les barres latérales en appliquant juste assez de pression pour les maintenir en toute sécurité. Ensuite, utilisez la pince pour aider à assurer un serrage nivelé des trois vertèbres.

Assurez-vous que les barres latérales sont à la fois nivelées et parallèles avant d’effectuer la laminectomie. Après cela, nettoyez et séchez soigneusement la surface dorsale des vertèbres serrées à l’aide de cotons-tiges. Dans cette procédure, insérez les pointes des ciseaux Vana dans l’espace épidural de la vertèbre médiale serrée et serrez légèrement les poignées.

Si l’os est sec, il devrait se fissurer le long de la lame dorsale. Répétez cette procédure du côté controlatéral pour libérer la lame tout en saisissant la lame lâche Doucement par l’apophyse dorsale avec des pinces, coupez soigneusement tout tissu conjonctif aux extrémités rostrale et dorlotée de la lame. Ensuite, lavez soigneusement tout sang recouvrant la moelle épinière avec une solution saline à 0,9 % ou une colonne vertébrale cérébrale artificielle, absorbez l’excès de liquide avec des cotons-tiges.

Après cela, coupez les bords latéraux de l’os et passez aux barres latérales de l’implant. Par la suite, contrôlez le saignement à l’aide de cotons-tiges et d’une solution saline. Dans le cas où une partie du périoste s’est détachée et recouvre la moelle épinière, retirez délicatement le tissu à l’aide de cotons-tiges et d’une aiguille de calibre 29 à 30.

Veillez à ne pas blesser la moelle épinière et à ne pas confondre le périoste lâche avec un dator bien enveloppé. À la fin. Scellez les bords exposés restants de l’os avec des dents dentaires, de l’acrylique et du cyanoacrylate.

Faites particulièrement attention à ce que la colle ne pénètre pas sur la moelle épinière exposée. Maintenant, positionnez soigneusement la plaque supérieure sur l’animal de sorte que les quatre fentes s’alignent avec les quatre trous sur les barres latérales et que l’ouverture recouvre la moelle épinière exposée. À l’aide d’un tournevis bijoutier, commencez soigneusement par la première vis, en stabilisant l’arbre du tournevis avec une autre paire de pinces.

Ne serrez pas la vis à ce stade, mais insérez-la de manière à ce que les premiers filets soient engagés. Répétez ce processus pour les trois autres vis. Avec les quatre vis en place, serrez chaque vis en alternance par petits incréments jusqu’à ce que toutes les vis soient fermement fixées.

Ensuite, utilisez l’élastomère de silicone de marque Quick Sill pour remplir l’espace entre la moelle épinière et la fenêtre en verre et appliquez-le sur la moelle épinière exposée. Assurez-vous de vous débarrasser de tout silicone contenant des bulles d’air de l’embout mélangeur avant son application. Placez ensuite rapidement un couvercle de cinq millimètres dans l’insert de la plaque supérieure.

Appliquez une pression suffisante pour presser progressivement l’élastomère liquide afin qu’il entoure la moelle épinière, sans entraîner de compression de la moelle épinière. Ensuite, couvrez les bords de l’élastomère exsudé avec du dental, de l’acrylique et du cyanoacrylate, et utilisez les adhésifs pour faire adhérer l’élastomère à l’os environnant autant que possible afin d’empêcher l’élastomère de se déplacer sur la surface de la moelle épinière. Ensuite, retirez les écarteurs et tirez la peau vers le haut autour du bord de l’implant.

Utilisez le cyanoacrylate pour faire adhérer la peau aux bords de l’implant. Après cela, insérez les vis dans les ailes de la plaque supérieure. Par la suite, scellez les espaces dans les fentes des vis de la plaque supérieure à l’aide d’acrylique dentaire avant de remettre l’animal dans la cage pour le récupérer.

Avant les séances d’imagerie, anesthésie à nouveau la souris et fixez les vis exposées de l’implant aux tenons filetés pour la stabilisation. Cette figure montre qu’une chambre vertébrale chronique reste optiquement transparente pendant plusieurs semaines. Il s’agit d’images blanches à claires de la moelle épinière allant de quelques minutes à trois semaines après l’opération.

Les repères vasculaires sont identifiables à tous les points de repère. Peu de changements sont observés un jour après la chirurgie. Une prolifération fibreuse dense est présente dans une partie de la fenêtre dès trois jours et entraîne une obscurcissement partiel de la zone d’imagerie.

Une légère néovascularisation est également présente mais n’obscurcit pas le système vasculaire d’origine en lumière blanche ou en imagerie PEF. La chambre vertébrale chronique permet une imagerie multiphotonique répétée sans avoir besoin de chirurgies répétées. Voici les images d’une souris transgénique exprimant YFP dans un sous-ensemble d’axones DRG dans le fii dorsal de la moelle épinière.

Le système vasculaire a été marqué par injection intravasculaire de colorant indiquée en rouge. L’activité de la microglie peut également être suivie au fil du temps chez les souris transgéniques YFP CX, trois CR, GFP, tandis que les axones et la microglie restent visibles. Le contraste et la résolution diminuent modestement avec le temps.

Une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est correctement exécutée après son développement. Cette technique nous a ouvert la voie à l’exploration de l’hétérogénéité temporelle et spatiale du dépérissement axonal après une lésion de la moelle épinière.

Et les souris.