Isolement de cellules primaires murins cerveau endothéliales microvasculaires

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des cellules endothéliales microvasculaires primitives murines, cérébrales ou MBX. Ceci est accompli en isolant d’abord puis en homogénéisant les méninges libres du cerveau antérieur des souris adultes. Dans la deuxième étape, l’homogénat tissulaire est traité par digestion enzymatique.

Ensuite, dans l’étape finale, les cellules endothéliales sont séparées par densité, gradient, centrifugation et plaquées pour la culture cellulaire. En fin de compte, la coloration immunofluorescente des cellules isolées pour l’expression de CD 31 peut être utilisée pour confirmer la pureté de la culture de méchas MB. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’utilisation de lignées de cellules endothéliales cérébrales immortalisées, est que les résultats obtenus avec des cellules primaires offrent une meilleure transférabilité à la situation in vivo.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche de la barrière hémato-encéphalique, par exemple, quelles voies sont impliquées dans la pensée des cellules immunitaires. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies neurovasculaires, infectieuses, inflammatoires ou dégénératives du système nerveux central. Comme le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique est impliqué de manière critique dans l’agent pathogène de ces maladies.

Cette procédure sera démontrée par Lisa Eeping, une étudiante diplômée de notre laboratoire. Après avoir isolé les cerveaux de dix, huit à 12 semaines, C 57 BL, six souris stockent les tissus dans cinq millilitres de PBS stérile. Ensuite, à l’aide d’une pince, vous retirez les troncs cérébraux, le cervelet et le thalami, puis roulez soigneusement chaque cerveau sur du papier buvard stérile.

Pour enlever les méninges, regroupez les cerveaux dans un tube de faucon de 50 millilitres et ajoutez 13,5 millilitres de DM em, puis hachez le tissu d’abord avec une pipette de 25 millilitres, puis avec une pipette de 10 millilitres jusqu’à ce que le milieu devienne laiteux. Digérez le tissu en collagénase et en ADN à 37 degrés Celsius sur un agitateur orbital à 180 tr/min. Après une heure, ajoutez 10 millilitres de DM em à la suspension tissulaire et centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 1000 G et quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille en vrac, puis utilisez une pipette de 25 millilitres pour triturer la pastille environ 25 fois dans 25 millilitres de B-S-A-D-M-E-M. Après avoir fait tourner à nouveau les cellules, utilisez une pipette en verre brisé de grand diamètre pour retirer la couche supérieure laiteuse de myéline. Retirez ensuite la couche BSA à l’aide d’un PE normal ou d’une pipette.

Remettez la pastille en suspension dans neuf millilitres de DM em, puis ajoutez un millilitre d’espace disque de collagénase et 0,1 millilitre d’ADN aux cellules. Digérer la solution à 37 degrés Celsius sur l’agitateur orbital à 180 tr/min. Pendant la digestion, mettez en place un gradient de densité perca dans une ultracentrifugeuse.

Après une heure, ajoutez 10 millilitres de DM E em à la suspension cellulaire digérée pour arrêter la réaction, puis faites tourner les cellules et remettez en suspension la pastille Dans deux millilitres de DM Eem, ajoutez soigneusement la suspension cellulaire au-dessus du gradient par appel, puis séparez les cellules par centrifugation. Après la séparation, les cellules peuvent être visibles sous la forme d’une interface trouble. Trempez soigneusement l’aiguille stérile dans l’interface à un angle de 30 degrés et recueillez environ 12 millilitres de solution.

L’interface n’est souvent pas visible pour obtenir autant de cellules avec le moins de contamination possible. Une petite partie de l’interface doit être aspirée. En plus de cela, la pointe de l’aiguille stérile doit être déplacée avec précaution et continuellement vers chaque partie de l’interface, Transférez les cellules dans un nouveau Faucon de 50 millilitres contenant cinq millilitres de DM em, puis après avoir fait tourner à nouveau les cellules, réus, suspendez le palais dans 0,2 millilitre de milieu cellulaire endothélial par une surface d’un centimètre carré d’une plaque de culture cellulaire.

Ensuite, retirez la solution d’enrobage des plaques de culture cellulaire revêtues et rincez chaque puits avec du PBS stérile en deux étapes de lavage consécutives. Enfin, maintenez les cultures cellulaires dans un milieu de cellules endothéliales à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur stérile. Changer de milieu tous les deux à trois jours immédiatement après l’isolement.

Les cellules murines et contaminantes forment des conglomérats que l’on peut observer flotter dans la culture cellulaire. Un traitement moyen avec de la mycine conduit à la sélection de BMAX murin car les cellules contaminantes sont beaucoup plus sensibles à la cytotoxicité médiée par la mycine pure et les BM E non affectés commencent à attacher au collagène quatre plaques de culture cellulaire enrobées de fibronectine jusqu’au cinquième jour, les BME prolifèrent à une densité d’environ 80 à 90 % formant une monocouche de Les cellules inhibées par contact alignées longitudinalement et non chevauchantes caractérisées par leur aspect fusiforme typique par sélection de mycine puram, Une haute pureté allant jusqu’à 99 % de BMAX murin est atteinte, comme le confirme le marqueur de cellule endothéliale CD 31. Les BM E forment des monocouches étroitement scellées interconnectées par des protéines à jonction serrée.

Après sept à huit jours de culture, ces couches cellulaires accumulent des valeurs stables pour une résistance électrique comprise entre 20 et 30 ohms par centimètre carré et une capacité substantielle à ce moment-là, des tests fonctionnels tels que des expériences de migration cellulaire ou des tests de perméabilité avec du bleu d’Evans ou du dextran peuvent être effectués Une fois maîtrisés. Cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures après cette procédure. D’autres méthodes telles que les tests de migration, les expériences de perméabilité ou les mesures électrophysiologiques peuvent être effectuées pour répondre à ces questions visionnaires, par exemple, comment le trafic des cellules immunitaires est-il modifié dans certaines conditions expérimentales ?

Ou comment les canaux de fer sont-ils impliqués dans la régulation de la barrière hémato-encéphalique ? Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler l’urine, les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau par homogénéisation mécanique, centrifugation enzymatique, digestion et gradient de densité.