Name: Whole-monter imagerie de lembryon de souris projections sensorielles Axon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie complète pour visualiser les projections axonales nociceptives chez l'embryon de souris. Ce protocole optimisé permet d'évaluer rapidement les phénotypes de croissance des axones sensoriels dans des modèles génétiquement modifiés.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Louis Reichardt pour les souris TrkA taulacZ et Dr. Annette Markus pour la discussion et suggestions perspicaces. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la Fondation Burke ainsi que la Fondation Whitehall subvention de recherche 2010-08-61, une subvention de la Fondation Wings de vie (WFL-US-028/14) pour la recherche, accorder ZB1-1102-1 de la Christopher et Dana Reeve Foundation, et les subventions et 1R01EY022409 3R01EY022409-01S1 du National Eye Institute, à JZ. KJO est un compagnon de Goldsmith.

NOTE: Toutes les procédures sont conformes à la NIH Guide pour l&#39;entretien et utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole d&#39;animal a été approuvé par le IACUC au Weill Cornell Medical College. 1. Préparation des tissus <ol><li> Euthanasier femelles chronométré-grossesse par dislocation cervicale 15. Disséquer embryonnaires E16 - E18 embryons de femelles chronométré-grossesse et placer des embryons individuellement dans les puits d&#39;une plaque à 6 puits, remplis de solution saline tamponnée phosphate froide (PBS). </li><li> Rincer embryons dans du PBS froid. </li><li> Retirer une petite partie de la membrane amniotique de l&#39;embryon et le placer dans une solution pré-préparés protéinase K pour le génotypage ultérieure. Alternativement, si la membrane amniotique est perdu, enlever une petite partie de la pointe de la queue de l&#39;embryon et le placer dans une solution de proteinase K </li><li> Percez des trous dans la peau tout autour de l&#39;embryon en utilisant des épingles insectes (au moins 100 par côté). </li><li> Retirer du PBS et ajouter lentement frais 2% de paraformaldéhyde (PFA),pH 7,4, au puits. </li><li> Agitez doucement pendant 2 h à 4 ° C. </li><li> Rincer les embryons à deux reprises dans du PBS et les stocker dans du PBS à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la coloration. </li></ol> 2. génotypage <ol><li> Plongez membranes amniotiques ou queues d&#39;embryons dans la protéinase K mélange selon les instructions du fabricant. </li><li> Incuber à 56 ° C pendant 10 min. </li><li> Extraire l&#39;ADN en utilisant un kit de purification d&#39;ADN disponible dans le commerce. </li><li> Prendre 0,5 ul du total 200 ul purifiés solution d&#39;ADN génomique, le combiner avec 0,5 pl de chacune des amorces sens et antisens spécifiques d&#39;un gène (10 uM), 2 ul de mélange dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP) , 0,2 ul de polymerase de Taq (5 U / ul) et du tampon de PCR 2 pi (10x), ajoutez H 2 O à un volume total de 20 ul. NOTE: Les séquences des amorces sont les suivantes (tableau 1): TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; Frag PCRlongueur ment: 400 paires de bases (pb). Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NéoR: GCC CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragments longueurs: type sauvage, 304 pb; Bax null, 507 pb. TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR de longueur des fragments: 360 pb. </li><li> Exécuter une PCR avec le programme suivant pour TrkA: étape 1: 1 min à 95 ° C, étape 2: 10 sec à 95 ° C, étape 3: 20 sec à 68 ° C, étape 4: 30 sec à 72 ° C. Répétez les étapes 2 à 4 pour 40 cycles. <ol><li> Pour LacZ et Bax, exécutez une PCR avec le programme suivant: étape 1: 1 min à 95 ° C, étape 2: 10 sec à 95 ° C, l&#39;étape 3: 1 min à 54 ° C, étape 4: 1 min à 72 ° C, répétez les étapes 2 à 4 pour 35 cycles. </li></ol></li><li> Exécuter les échantillons de PCR sur un gel d&#39;agarose à 2% à 100 V dans un tampon Tris-acétate 1x-EDTA pendant 20 min avec une voie de échelle d&#39;ADN pour évaluer la longueur des fragments. </li><li> Analyser embryons pour la présence de type sauvage TrkA, TRKA-tauLacZ et Bax allèles nuls. Les génotypes des embryons expérimentaux sont TrkA taulacZ / WT: Bax - / - TrkA et taulacZ / taulacZ: Bax - / -, en fonction des questions expérimentales. Les embryons qui ne ont pas le journaliste tauLacZ seront négatifs pour axonale coloration et peuvent donc servir de témoins négatifs pour calibrer le processus de coloration. </li></ol> 3. embryon coloration <ol><li> Utilisez un kit commercial pour lacZ coloration avec quelques modifications telles que décrites ci-dessous dans les sections 3.2 à 3.8. Ici, utiliser le kit Millipore. </li><li> Plongez embryons dans le tampon A pendant au moins 1 h, secouant doucement à la température ambiante. </li><li> Immerger directement embryons dans le tampon B pendant au moins 15 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. </li><li> Lorsque des embryons sont dans le tampon A / B, solution de pré-base chaude de tissus à 37 ° C. Utilisation 5 ml de solution de base de tissu par embryon. </li><li> Lorsque des embryons sont dans le tampon A / B, préparer une nouvelle 5-bromo- 4- chloro- 3- indolyle α-D-galactopyranoside (X-gal) à une concentration de 40 mg / ml dans 100% de diméthylsulfoxyde (DMSO). </li><li> Diluer X-gal dans la solution préchauffée base de tissu à une concentration de 1 mg / ml et ajouter 5 ml de X-gal / le mélange de base de tissu à un flacon à scintillation en verre. </li><li> Transfert d&#39;embryons dans un flacon à scintillation en verre contenant le mélange de base X-gal / tissus. Sceller le couvercle avec du Parafilm et incuber à 37 ° C pendant la nuit, la vérification de présence de bleuissement. </li><li> Embryons de Postfix avec frais PFA 4%, pH 7,4. Agitez doucement pendant 4 heures à 4 ° C. </li><li> Rincer embryons deux fois dans PBS froid. </li></ol> 4. tissus déshydratation et de compensation <ol><li> La place embryons dans 50% de méthanol / 50% d&#39;un mélange PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans les flacons de verre. </li><li> Continuer à déshydrater dans 75% de méthanol / 25% de PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans des flacons en verre. </li><li> Continuer à se déshydrater dans 90% de méthanol / 10% PBS pendant 30 min à température ambiante en agitant dans des flacons de verre. </li><li> Continuer à déshydrater dans 100% de methanol pendant 30 min (2x) à la température ambiante en agitant dans des flacons en verre. </li><li> Lorsque des embryons sont déshydratant, préparer un mélange 1: 1 (v: v) un mélange d&#39;alcool de benzoyle et benzoyle benzoate. REMARQUE: l&#39;alcool de benzoyle et benzoyle benzoate est toxique. </li><li> Immerger les embryons dans le complexe 1: 1 (v: v) mélange de methanol à 100%: 100% BABB pendant 15 min. Utilisez uniquement parce que le verre BABB va se dissoudre en plastique. </li><li> Plongez embryons dans 100% BABB effacer complètement le tissu et de visualiser coloration X-gal dans l&#39;embryon effacé. REMARQUE: Image dès que possible parce que la tache X-gal va se estomper au fil du temps. </li></ol> 5. Mont entiers Imaging <ol><li> Stabiliser l&#39;embryon, immergé dans 100% BABB, aux angles appropriés pour la photographie utilisant des pinces métalliques. Illuminez utilisant une combinaison de sources jusqu&#39;à la lumière et sous-lumière lumière. </li><li> Acquérir des images avec un microscope disséquantéquipé d&#39;un appareil photo numérique. Prenez plusieurs expositions aux champs lumineux à cinq plans focaux successives 0,5 mm d&#39;intervalle le long de l&#39;axe Z. Les temps d&#39;exposition et diaphragmes peuvent varier en fonction de l&#39;éclairage et de la caméra spécifications et doivent être optimisés pour chaque configuration. </li><li> Utilisez un logiciel de traitement d&#39;image pour traiter des images de superposition et de générer des photomontages. </li></ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
<li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibers+in+Fabry+disease%3A+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li>
<li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+the+distance%2C+or+not%2C+with+neurotrophin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li>
<li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li>
<li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia%3A+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li>
<li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li>
<li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li>
<li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li>
<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents.

Le X-gal procédure de souris embryonnaires TrkA taulacZ coloration décrite ci-dessus permet la visualisation rapide et détaillée des projections axonales longue distance dans l&#39;embryon fixe intacte. En raison de la Bax fond nul ces souris permettent de sonder des mécanismes qui peuvent contribuer à la croissance de l&#39;axone et la survie neuronale de signalisation. Accouplement avec transgéniques ou knock-out souris d&#39;intérêt permet une évaluation globale des phénotypes axonales et...

Mise en place des réseaux neuronaux précis est un processus complexe du développement essentiel pour le fonctionnement du système nerveux. La perturbation de ce processus conduit à un dysfonctionnement neuronal qui a été impliquée dans des maladies neurologiques humaines 3.1. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la croissance axonale et la cible innervation chez les mammifères, nous avons développé un protocole de visualiser les trajectoires axonales de TrkA exprimant neurones sensoriels utilisant une combinaison de deux lignées de souris génétiquement modifiées. TrkA est un récepteur pour le facteur NGF de croissance des nerfs et est un marqueur fonctionnel des neurones sensoriels nociceptifs 4. TrkA est fortement exprimé dans les neurones nociceptifs au cours du développement précoce et la médiation de la survie des neurones dépendant du NGF, la croissance des axones, arborisation cible innervation et 9.5. Chez les souris TrkA taulacZ, le gène de type sauvage TrkA est remplacé par une expression de c taulacZassette 10, de telle sorte que la morphologie axonale des neurones positifs putatifs TrkA peut être visualisée par β-gal (X-gal) 11 coloration. Utilisation d&#39;une ligne TrkA taulacZ / WT hétérozygote, nous pouvons examiner les facteurs qui peuvent réglementer ou interférer avec le développement de projections sensorielles afférentes in vivo. En outre, l&#39;expression TrkA est absent chez les souris homozygotes TrkA taulacZ / taulacZ, qui peuvent donc être utilisés pour évaluer la croissance de l&#39;axone promouvoir des mécanismes en l&#39;absence de signalisation du NGF / TrkA. Etant donné que les neurones nociceptifs dépendent de NGF / TrkA signalisation non seulement pour la croissance des axones, mais aussi pour la survie, on emploie une autre lignée de souris, dépourvu du gène Bax pro-apoptotique, pour inhiber l&#39;apoptose dans les neurones de DRG embryonnaires, les sauver de la mort cellulaire qui est par ailleurs observé en l&#39;absence de signalisation TrkA. Le Bax - / - fond 12 permet ainsi pour la molécudissection lar des voies qui affectent spécifiquement 7-9,13-15 de croissance axone signalisation. Dans TrkA - / -: - Bax / - souris, les neurones DRG survivre, mais sensorielle innervation afférente dans la peau est complètement abolies 14,15. Nous pouvons activer sélectivement les voies de signalisation pour déterminer leurs contributions respectives à l&#39;élaboration de projections axonales. L&#39;utilité de cette méthode est qu&#39;elle permet à l&#39;évaluation des changements de phénotypes de croissance axonale lorsque différentes modifications génétiques sont élevés sur le TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - ou TrkA taulacZ / WT: Bax - / - milieux.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rinçage des tissus A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rinçage des tissus B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Solution de base de teinture des tissus</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Flacon à scintiallation en verre</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Labline</td><td>Modèle 120</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Plat 6 puits</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td>IDT</td><td>amorces d’ADN</td><td></td> personnalisées</tr><tr><td>Takara dNTP mélange</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA tampon</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>machine PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Alcool benzylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Lampe annulaire</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles axon

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

La visualisation de pleine longueur projections neuronales dans les embryons est essentiel d&#39;acquérir une compréhension de la façon dont les mammifères réseaux neuronaux se développent. Nous décrivons ici un procédé pour marquer in situ un sous-ensemble de ganglion de la racine dorsale (DRG) de projections axonales à évaluer leurs caractéristiques phénotypiques utilisant plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Les neurones TrkA-positif sont des neurones nocicepteurs, dédiées à la transmission des signaux de douleur. Nous utilisons une lignée de souris TrkA taulacZ d&#39;étiqueter les trajectoires de tous les axones périphériques TrkA-positif dans l&#39;embryon de souris intactes. Nous élevons en outre la ligne TrkA taulacZ sur un fond nul Bax, qui abolit essentiellement apoptose neuronale, afin d&#39;évaluer les questions indépendamment de possibles effets de manipulations génétiques sur la survie neuronale liés à la croissance. Par la suite, les souris génétiquement modifiées d&#39;intérêt sont élevés avec le TrkA TaullacZ / Bax ligne nulle et sont alors prêts pour l&#39;étude en utilisant les techniques décrites ici. Cette présentation contient des informations détaillées sur les plans d&#39;élevage de souris, le génotypage au moment de la dissection, la préparation des tissus, la coloration et la compensation pour permettre la visualisation de pleine longueur trajectoires axonales dans l&#39;ensemble du montage préparation.

Les génotypes de TrkA WT / taulacZ: Bax - / - TrkA et taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryons peuvent être déterminées sans ambiguïté par génotypage PCR standard (figure 1). Coloration X-Gal affiche des informations détaillées tonnelles axonales périphériques sous-cutanée chez les embryons classiquement colorées (figures 2, 3a), et dans tout l'embryon après compensation de tissu (figures 3b, 4). Nous...

Nous présentons ici un protocole optimisé pour génotypager, colorer et préparer des souris fœtales pour l’imagerie des projections axonales du nocicepteur périphérique chez l’animal entier, comme méthode efficace pour évaluer les phénotypes de croissance des axones sensoriels chez les souris génétiquement modifiées en développement.

Whole-monter imagerie de l&#39;embryon de souris projections sensorielles Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’évaluer efficacement les phénotypes de croissance des axones sensoriels chez les souris fœtales en développement. Ceci est réalisé en sélectionnant et en génotypage d’abord correctement des souris rapporteures tau laxy, de sorte que des tests de coloration en aval puissent être effectués dans un deuxième temps. Les embryons de souris sont fixés et colorés pour permettre la visualisation des projections axonales sensorielles chez l’animal entier.Ensuite, les embryons sont déshydratés et éliminés afin de visualiser complètement les projections axonales profondes qui ne seraient autrement pas visibles. Les résultats démontrent que ces méthodes sont un moyen efficace d’évaluer rapidement les phénotypes de croissance axonale nociceptive embryonnaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la croissance des axones sensoriels en permettant aux chercheurs de croiser leur gène d’intérêt sur la piste d’un fond tlac Z et de dépister tout changement dans les phénotypes de croissance des axones sensoriels.Les implications de notre technique s’étendent à la thérapie dans le sens où les scientifiques peuvent uti

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Visualisation des projections des motoneurones et de la ramification des axones à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

Source : Jeong, S. Visualisation du modèle de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la visualisation des projections axonales dans les embryons de Drosophila. L’immunomarquage des motoneurones, la dissection précise pour exposer les structures neuronales et la microscopie à contraste d’interférence différentielle révèlent collectivement une architecture neuronale détaillée, mettant l’accent sur les modèles de projection axonale.

Visualisation des modèles de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez la drosophile

Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

La peau des mammifères contient un large éventail de structures - comme les follicules pileux et les terminaisons nerveuses - qui présentent des modèles distinctifs de l'organisation spatiale. Analyser la peau comme un support plat profite de la géométrie à 2 dimensions de ce tissu pour produire toute l'épaisseur des images haute résolution des structures de la peau.

Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l&#39;analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.

Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière

Ici, nous décrivons une procédure pour la compensation des tissus, marquage fluorescent et l’imagerie à grande échelle du tissu de cerveau de souris qui, ainsi, permet la visualisation de l’organisation en trois dimensions des types de cellules dans le néocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.

Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Au cours du développement du cortex cérébral, les neurones et les cellules gliales proviennent de la zone ventriculaire qui tapisse le ventricule et migrent vers la surface du cerveau. De nombreux gènes sont impliqués dans ce processus. Ce protocole introduit la technique d’imagerie en accéléré des neurones en migration et des progéniteurs gliaux.

Imagerie en accéléré de neurones migrateurs et de progéniteurs gliaux dans des tranches de cerveau de souris embryonnaires

Cette étude présente une approche in vivo d’imagerie à deux photons pour visualiser les structures des terminaisons axoniques des mécanorécepteurs (LTMR) à faible seuil dans la peau des pattes avant des souris. Utilisant des images répétées et haute résolution d’axones individuels, cette méthode offre une nouvelle plateforme pour étudier la structure et la fonction du circuit sensoriel cutané pendant le développement et chez l’adulte.

Imagerie intravitale à deux photons de la morphologie des axones sensoriels tactiles dans la peau de souris

Découvrez une méthode d'imagerie complète pour visualiser les projections axonales nociceptives chez l'embryon de souris. Ce protocole optimisé permet d'évaluer rapidement les phénotypes de croissance des axones sensoriels dans des modèles génétiquement modifiés.

Whole-monter imagerie de l'embryon de souris projections sensorielles Axon

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