Isolement de myofibroblastes de Mouse et œsophage humain

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les myofibroblastes primaires de l’œsophage de souris et d’homme. Ceci est accompli en prélevant d’abord tout l’œsophage de la souris nouveau-née donneuse avec des tissus humains. La muqueuse est séparée de la musculeuse propria.

La deuxième étape consiste à hacher le mouchoir et à le laver plusieurs fois dans HBSS. Ensuite, le tissu est digéré avec de la collagénase diss et haché davantage, libérant les cellules mésenchymateuses ainsi que l’épithélium attaché. La population cellulaire hétérogène est ensuite cultivée dans un milieu de myofibroblastes dans lequel les myofibroblastes adhèrent tandis que les cellules épithéliales ne survivent pas et sont emportées.

En fin de compte, l’immunochimie et la cytométrie en flux sont utilisées pour confirmer que les cellules en culture primaire sont des myofibroblastes. La démonstration des procédures sera assurée par moi-même, Matthew Gargas, un technicien, et chow new, un post-doctorant de mon laboratoire, Tori. Après avoir euthanasié une souris âgée de huit à 12 jours, épinglez la face dorsale de l’animal et mouillez la surface ventrale avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, à l’aide d’une pince, saisissez et soulevez la peau en avant de l’ouverture urétrale. Coupez le long de la ligne médiane ventrale de l’ouverture urétrale jusqu’au menton. Ne coupez que la peau.

Faites ensuite des incisions de l’ouverture urétrale aux genoux, en formant un Y renversé.Après les incisions aux genoux, faites des incisions des deux côtés de la cage thoracique. Après avoir terminé les incisions, retirez soigneusement la peau et mettez-la de côté. Maintenant, soulevez le péritoine et coupez-le jusqu’au diaphragme et à la cage thoracique.

Gardez les ciseaux pointés vers le haut pour éviter d’endommager le contenu intrathoracique et abdominal. Ensuite, soulevez doucement le lobe gauche du foie pour exposer l’estomac sous-jacent, la jonction gastrique œsophagienne et la partie abdominale de l’œsophage à l’aide de ciseaux chirurgicaux coupés le long de la ligne médiane du sternum et de la cage thoracique jusqu’à la ceinture cervicale. Encore. Ce faisant, gardez les ciseaux inclinés loin des organes sous-jacents.

Ensuite, écartez la cage thoracique pour exposer le contenu de la cavité thoracique. Maintenant, retirez doucement le cœur et les deux lobes des poumons. Utilisez des applicateurs en coton pour absorber le saignement au besoin.

L’œsophage thoracique est un tube étroit et flexible situé à l’arrière de la trachée et à l’avant de la vertèbre thoracique. Chez les nouveau-nés, trouvez la jonction gastrique œsophagienne pour identifier l’œsophage de l’estomac. Franchement, disséquez le système vasculaire entourant l’œsophage, y compris la graisse et le tissu mésentère, jusqu’à l’origine œsophagienne au niveau de la cavité cervicale.

Maintenant, réséquez toute la longueur de l’œsophage et transférez-le dans du HBSS réfrigéré si vous le souhaitez. Retirez également une partie de l’estomac à des fins d’orientation. Commencez ce protocole en hachant des fragments de muqueuse obtenus à partir de tissus de souris ou humains dans HBSS dans un micro-tube de 1,7 millilitre ou un tube de cinq millilitres respectivement.

Maintenant, lors de l’obtention de cellules stromales œsophagiennes humaines, il est important de séparer la muqueuse de la musculeuse propria sous-jacente par une dissection nette. Maintenant, dans le tube, le tissu est encore frappé en morceaux de deux à trois millimètres à l’aide de ciseaux fins. Une fois que le fragment de muqueuse œsophagienne, le sédiment décante lentement le HBSS, en prenant soin de ne pas jeter le tissu par inadvertance.

Vous pouvez également utiliser une pipette à grande pointe pour éliminer les HBSS supplémentaires. Ajoutez ensuite du HBSS frais. Mélangez le tube en secouant doucement et laissez le tissu se déposer.

Une fois installé, décantez à nouveau le HBSS et répétez ce lavage. Pas huit fois en tout. Après les huit lavages, incubez le tissu avec de la collagénase 11 et incubez le tissu murin jusqu’à 25 minutes sur un shaker à bascule réglé à vitesse lente et à température ambiante.

Dans les mêmes conditions, incubez des tissus humains pendant six heures. Après la digestion, mélangez encore plus le tissu à l’aide de ciseaux fins, puis centrifugez le tissu à 200 G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et décantez le tissu granulé dans un tube propre de 1,7 millilitre.

Ensuite, sous le capot de culture tissulaire, lavez les cellules cinq fois dans du DMEM avec 2 % de sorbitol pour éliminer les cellules non viables et autres débris. Pour chaque lavage, laissez les cellules se déposer par gravité et décantez la solution de lavage. Après les lavages, ensemencez les cellules dans trois puits de six.

Mettez-les en plat et cultivez-les dans du DMEM supplémenté filtré sous vide. Les tissus humains peuvent nécessiter plus de puits ou de plaques, selon la taille de la culture de l’échantillon, les cellules, jusqu’à ce que les puits soient confluents à 80 %. Ensuite, passez d’abord les cellules d’adhérence dans des flacons T 25, utilisez 0,05 % de trypsine dans l’EDTA pour déloger les cellules.

Ajoutez ensuite un média pour neutraliser la réaction. Collectez les cellules délogées dans un tube à centrifuger. Ensuite, faites tourner les cellules à 400 G pour les collecter au microscope.

Observez la morphologie en forme de fuseau des cellules adhérentes pour distinguer les cellules stromales cultivées des cellules musculaires et immuno-les pour Desmond. À l’aide d’un protocole standard, plaquez brièvement 15 000 cellules dans quatre lames de chambre à puits et cultivez-les dans un milieu de myofibroblastes pendant 24 heures. Le lendemain, fixez les cellules, puis avant d’appliquer l’anticorps primaire, bloquez les cellules fixées avec 5 % de sérum de chèvre dans du PBS, les anticorps primaires et secondaires doivent également être dilués dans 5 % de sérum de chèvre.

Incuber avec l’anticorps primaire à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Rincez ensuite les cellules trois fois avec du PBS après les lavages. Ajoutez les anticorps secondaires et incubez les cellules pendant une heure.

À température ambiante, utilisez trois lavages dans du PBS pour éliminer les anticorps secondaires. Ensuite, les cellules colorées peuvent être analysées après les lavages. Appliquez le DPI avec un support de montage et une lamelle pour établir la pureté des cellules œsophagiennes.

Vérifiez-les pour les marqueurs de surface des cellules hématopoïétiques et endothéliales. Utilisation de la cytométrie en flux. Cultivez un nombre suffisant de flacons de culture jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être récoltés.

Ensuite, détachez les cellules stromales œsophagiennes de souris en culture à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Suite à leur collecte. Lavez deux fois les cellules avec la mémoire tampon de télécopie et comptez les cellules.

Maintenant, à l’aide d’une procédure de coloration standard, colorez avec du CD 45 pour identifier les cellules immunitaires et colorez avec du CD 31 pour identifier les cellules endothéliales, puis faites passer les cellules dans le cytomètre en flux. Les cellules stromales de l’œsophage ont été isolées à l’aide d’une digestion mécanique et enzymatique et cultivées dans des plaques à six puits dans les heures qui ont suivi le placage. Les cellules étaient dans une suspension mixte faiblement collée à la plaque.

Au cours des 24 heures suivantes, des cellules en forme de fuseau ont germé à partir de la suspension cellulaire et ont adhéré fermement au fond de la plaque. Ces cellules ont couvert l’ensemble du puits en cinq jours et ont réussi à conserver leur morphologie pour au moins 15 passages vus ici, les cellules sont à une faible densité. Ce sont les cellules en forme de fuseau près de la co-fluidité, l’immuno-coloration des cultures primaires de cellules stromales œsophagiennes.

Des lames cultivées en chambre ont démontré une expression abondante des marqueurs cytosquelettiques des myofibroblastes. La pureté des cultures Alpha, SMA et menton a été évaluée par cytométrie en flux. La diffusion vers l’avant et sur le côté a été établie pour les cellules stromales œsophagiennes primaires, suivie d’une stimulation et d’une analyse des cellules vivantes pour les protéines de surface cellulaire.

Les cellules stromales œsophagiennes primaires n’exprimaient pas le CD 45 hématopoïétique et les marqueurs de surface des cellules endothéliales CD 31. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’établir des cultures primaires de myofibroblastes à partir d’œsophage de souris et d’œsophage humain. Oui.