Name: Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Découvrez l'analyse du profil phénotypique des macrophages M1 et M2 humains par électrophorèse 2D différentielle sur gel. Cette méthode sensible permet de détecter les variations protéiques avec seulement cinq microgrammes d'échantillon.

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Ce travail a été soutenu par l’Inserm. Marion Bouvet est chercheuse au ministère de la Recherche et de la Technologie. Annie Turkieh est boursière du 7e PC de l’Union européenne HOMAGE (305507).

Le protocole suit les lignes directrices de notre comité des institutions d&#39;éthique de la recherche humaine. Buffy coat partir de donneurs humains sains ont été obtenus à partir de la transfusion sanguine Centre régional (Lille, France). Les échantillons obtenus à partir des couches leucocytaires sont déclarés comme une collection Inserm (n ° DC2010-1209). 1. Matériel et de la culture des médias Préparation <ol><li> Diluer 10x tampon phosphate salin (PBS) dans de l&#39;eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS. </li><li> Faire un milieu RPMI 1640 supplémenté avec de la gentamicine (40 ug / ml) et de L-glutamine (2 mM), avec ou sans 10% de sérum humain. </li></ol> 2. Les cultures primaires de macrophages dérivés de monocytes (MDM) <ol><li> Diluer couche leucocytaire (25 ml) avec du PBS 1x. Disposer soigneusement sur un / tube et centrifuger de Leucosep Ficoll à 1600 g pendant 20 minutes, à la température ambiante. </li><li> Recueillir des monocytes à l&#39;interface dans un nouveau tube. Laver 3 fois avec 10 ml de PBS 1X contenant 0,1% d&#39;acide éthylènediamine tétraacide acétique (EDTA) par centrifugations successives à 1.000 xg, 370 xg et 160 xg pendant 10 min chacun, puis une fois dans 1 x PBS seul à 160 xg pendant 10 min. </li><li> Remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu RPMI-1640 sans sérum et ensemencer les cellules dans des boîtes de 35 mm à une densité de 1 x 10 6 cellules par boîte. </li><li> Après sédimentation pendant 90 minutes dans l&#39;incubateur, jeter le surnageant contenant les cellules non adhérentes. Laver les cellules adhérentes, comprenant des monocytes, 3 fois avec 1 ml de PBS; puis ajouter 1 ml de milieu frais contenant 10% (v / v) de sérum humain à des cellules libres sériques précédemment. </li><li> Après 6 jours de culture, les macrophages différenciés pour donner alternatifs (M2), ajouter recombinant humain de l&#39;IL-4 (15 ng / ml) et maintenir pendant 6 jours. Ensuite, traiter les macrophages différenciés avec un lipopolysaccharide (100 ng / ml) au jour 12 pendant 4 heures pour obtenir les macrophages M1. </li></ol> 3. Extraction de M1 et M2 des macrophages protéines pour électrophorèse 2D <ol><li> Laver macrophtrois fois à l&#39;âge mM de Tris, pH 7,4, et la ferraille dans un tampon contenant 30 mM Tris pH 8, 4% 25 3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), thiourée 2 M et 7 M d&#39;urée. </li><li> Lyse des cellules en utilisant un mélangeur approprié pour tubes de 1,5 ml à centrifuger pendant 5 min dans la glace et conserver à -20 ° C. </li><li> Déterminer la concentration de protéine en utilisant un réactif de Bradford commercial. Stocker des aliquotes de 100 ul des protéines à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. isoélectrofocalisation REMARQUE: Effectuer toutes les procédures d&#39;étiquetage dans l&#39;obscurité. <ol><li> Réduire 5 pg de chaque échantillon (macrophages M1 et M2) ajusté à 9 ul avec du tampon de lyse avec du Tris 2 mM (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Ajouter cyanine 3 (Cy3) extrait de M1 et M2 extrait de colorant réactif sulfhydryle à une concentration de 0,8 nM de protéine / ug. Ajouter cyanine 5 (Cy5) pour M1 et M2 extrait à une concentration de 0,8 nM / pg de protéine et incuberpendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Arrêter la réaction avec l&#39;addition d&#39;un volume égal de tampon d&#39;échantillon contenant 7 M d&#39;urée, thiourée 2 M, 4% de CHAPS, 130 mM de dithiothréitol (DTT) et 2% pharmalytes. </li><li> Mix Cy3 marqué échantillons M1 M2 avec des échantillons Cy5 dans une main et marqué au Cy3 échantillons M2 avec des échantillons M1 Cy5 dans une autre main. </li><li> Réhydrater un gradient de pH immobilisé (IPG) bande (240 mm, pH 3-10 gradient linéaire) avec 450 ul d&#39;échantillons mixtes marqués dans un tampon contenant 7 M d&#39;urée, 2 M thiourée et 4% de CHAPS sur une focalisation isoélectrique (IEF) système de pile pendant 24 heures sans appliquer de courant. </li><li> Effectuer concentrer à 300 volts (V) pendant 3 heures, puis à un gradient de 1000 V pendant 6 heures, à un gradient de 8000 V pendant 3 heures et enfin à 8000 V pendant 3 heures. </li></ol> 5. Deuxième Dimension REMARQUE: Effectuer toutes les procédures d&#39;électrophorèse dans l&#39;obscurité. <ol><li> Incuber les bandes IPG dans un tampon d&#39;équilibration contiennenttion de 0,1 mM de Tris-HCl (pH 8), 6 M d&#39;urée, 2% (p / v) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 30% (v / v) de glycerol pendant 10 min. </li><li> Transférer les bandes IPG équilibrée pendant la seconde dimension (électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (PAGE)) sur 12,5% de gels de PAGE et d&#39;assurer l&#39;étanchéité avec l&#39;agarose bas point de fusion. </li><li> Effectuer l&#39;électrophorèse à 20 ° C en utilisant un système Ettan-Daltsix à une tension constante de 70 V pendant la nuit, suivie par 300 V jusqu&#39;à ce que le front de bleu de bromophénol atteigne le fond du gel. </li></ol> 6. Acquisition d&#39;image et en bioinformatique analyse <ol><li> Des gels d&#39;analyse exprimés entre les deux plaques de verre à faible fluorescence avec un scanner Imager DIGE aux longueurs d&#39;onde d&#39;excitation / émission de 532/580 nm pour Cy3 et Cy5 633/670 nm pour pour donner des images avec une taille de pixel de 100 um. </li><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;image avec un logiciel commercial comme détaillé précédemment 12. </li><li> Calculer et normaliser des volumes au comptant dans chaque image. Attribuer un volume de place normalisée comme un accessoireortion de la valeur totale de chaque spot détecté dans le gel. </li><li> Analyser les différences de volumes au comptant de protéines pour chaque type de macrophages en comparant la valeur du volume de place normalisée entre les deux groupes (M1 et M2). Considérez la différence entre les volumes au comptant à être importante si le changement est 1,5 fois (p &lt;0,05, à sens unique analyse ANOVA). </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Il n’y a pas de conflit d’intérêts déclaré.

Le protocole décrit ici en détail une méthode pour analyser l&#39;impact de divers stimuli des deux sous-types de macrophages, M1 (pro-inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire). Des cultures primaires de macrophages M1 et M2 ont été obtenus à partir de la différenciation de monocytes comme précédemment publié 7. La procédure de l&#39;électrophorèse sur gel 2D DIGE nécessite des matériaux et d&#39;équipements spécialisés, tels que les cellules IEF pour plaques isoélectrofocalisatio...

Les macrophages sont des cellules hétérogènes et plastiques qui sont capables d&#39;acquérir des phénotypes fonctionnels distincts. In vivo, ces cellules répondent à une grande variété de micro signalssuch l&#39;environnement comme les produits microbiens, des cytokines, etc. 1. In vitro, le phénotype pro-inflammatoire (M1) de macrophages peut être induite par le lipopolysaccharide (LPS) et le phénotype anti-inflammatoire (M2) par des cytokines telles que l&#39;interleukine-4 (IL-4). En outre, les macrophages peuvent passer d&#39;un M1 à M2 phénotype activé, et inversement, sur des signaux spécifiques 2. En fonction du phénotype, les macrophages ont différentes fonctions. M1 macrophages sont des cellules qui produisent des cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), afin de tuer des micro-organismes ou des cellules tumorales 3. En revanche, les macrophages M2 empêcher ces réponse inflammatoire comme dans la cicatrisation des plaies et de la fibrose en produisant des anti-inflammatorfacteurs y tels que TGF-β 3,4. Des cellules mononucléaires de sang périphérique humain provenant de donneurs sains ont été isolées par gradient de densité Ficoll centrifugation comme décrit précédemment en utilisant 5 une technique adaptée de Boyum 6. Macrophages en culture peuvent être différenciées en M1 ou M2 phénotype après 6 jours de culture primaire 7. Analyse de l&#39;expression des protéines ou des changements de protéines entre les deux sous-types de macrophages en vertu de divers stimuli contrôlés, tels que la pathogénicité d&#39;accueil ou les toxines microbiennes, sera utile pour déchiffrer la fonctionnalité du pro- et anti-inflammatoires des macrophages. Protéomique sont des outils uniques pour la surveillance directe de protéines qui sont spécifiquement en amont ou en réglementés dans les macrophages humains cultivés en vertu de divers stimuli. Les colorants fluorescents ont résolu certaines des limitations de l&#39;électrophorèse sur gel 2D, tels que la faible sensibilité et l&#39;analyse d&#39;image 8 &lt;<html> / Sup&gt;. Les colorants qui réagissent avec les résidus de cysteine ​​ont augmenté la sensibilité de détection par rapport à ceux faisant réagir avec des résidus de lysine 9. Dans une étude précédente, nous avons démontré l&#39;utilité de l&#39;étiquetage DIGE de saturation pour l&#39;analyse des échantillons rares 10 par rapport à la coloration à l&#39;argent classique 2D électrophorèse 11. Cette technologie est utile pour analyser rapidement des modifications de protéines entre les deux sous-types de macrophages ou entre macrophages traités et non traités de la même sous-type. Les avantages de cette technique sont protéomique avoir accès à l&#39;information de la taille de la protéine et des modifications post-traductionnelles en analysant le gel 2D 12. Il doit être pris en compte que ce pas est une technique à haut débit, ce qui limite le nombre d&#39;échantillons pouvant être analysés. Le développement de tests à haut débit basés sur la spectrométrie de masse tel que revu récemment 13 peut améliorer cette situation. _content &quot;&gt; Ici, nous présentons comment effectuer l&#39;analyse 2D DIGE de l&#39;extraction de la protéine des macrophages en culture dans les processus de l&#39;électrophorèse, isoélectrofocalisation, et SDS-PAGE ainsi que des informations sur l&#39;utilité des logiciels 2D adéquate.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamycine 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>sérum humain</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1 077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Plaque à 6 puits PRIMARIA&nbsp ;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp ;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 0.22 & micro ; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE Cylindre</td><td></td></tr><tr><td>de 100 ml</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Réactif Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-réactif</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>Bande IPG 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protéan Cellule IEF</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Système Ettan-Daltsix</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Imager scanner</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Dynamique</td><td></td><td></td>non linéaire</tr><tr><td>Tubes de 50 ml</td><td>tout fournisseur</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>n</td><td>/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>ur&eacute ; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute ; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>FDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Bleu bromophénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40 %</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyage 2D GE</td><td>Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Dim&eacute ; thylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>mèches d’électrodes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2d

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

L’objectif du protocole d’électrophorèse bidimensionnelle (2D) décrit ici est de montrer comment analyser le phénotype des macrophages humains cultivés. Le rôle clé des macrophages a été démontré dans divers troubles pathologiques tels que les maladies inflammatoires, immunologiques et infectieuses. Dans ce protocole, nous utilisons des cultures primaires de macrophages dérivés de monocytes humains qui peuvent être différenciés en phénotype M1 (pro-inflammatoire) ou M2 (anti-inflammatoire). Ce modèle in vitro est fiable pour l’étude des activités biologiques des macrophages M1 et M2 et aussi pour une approche protéomique. Les techniques protéomiques sont utiles pour comparer le phénotype et le comportement des macrophages M1 et M2 au cours de la pathogénicité de l’hôte. L’électrophorèse sur gel 2D est une technique protéomique puissante permettant de cartographier un grand nombre de protéines ou de polypeptides simultanément. Nous décrivons le protocole d’électrophorèse 2D à l’aide de colorants fluorescents, appelé électrophorèse différentielle sur gel 2D (DIGE). Les protéines des macrophages M1 et M2 sont marquées avec des colorants cyanine avant d’être séparées par focalisation isoélectrique, en fonction de leur point isoélectrique dans la première dimension, et de leur masse moléculaire, dans la seconde dimension. Des taches protéiques ou polypeptidiques séparées sont ensuite utilisées pour détecter les différences dans les niveaux d’expression des protéines ou des polypeptides. Les approches protéomiques décrites ici permettent d’étudier les modifications des protéines des macrophages associées à divers troubles tels que la pathogénicité de l’hôte ou les toxines microbiennes.

Pour effectuer l'analyse protéomique différentielle appropriée, le traitement des échantillons à analyser doivent être vérifiées. Dans l'exemple présenté, la qualité de macrophages de culture de cellules est requis pour les aspects morphologiques et moléculaires comme précédemment publiée 5. La différenciation des monocytes en macrophages et l'homogénéité de la culture a été suivie par microscopie de phase. La figure 1 a montré un exemple de cultures primaires de ...

Les macrophages sont les cellules clés impliquées dans la pathogénicité de l’hôte. Les macrophages présentent une diversité phénotypique et fonctionnelle qui peut être analysée et détectée par analyse protéomique. Cet article décrit comment réaliser l’électrophorèse 2D de cultures primaires de macrophages humains différenciés en phénotype M1 ou M2.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

L’objectif général de cette procédure est d’analyser le phénotype des sous-ensembles de macrophages humains pro-inflammatoires M1 et anti-inflammatoires M deux par différentiel 2D dans l’électrophorèse sur gel. Ceci est accompli en marquant d’abord les protéines extraites de deux cultures primaires de macrophages M1 et M avec des colorants sinus. Dans un deuxième temps, les protéines sont mélangées entre elles et une électrofocalisation ISO par réhydratation est effectuée sur les échantillons.Dans la deuxième dimension, l’électrophorèse est réalisée à l’aide d’un gradient de pH mobilisé ou de bandelettes IPG dans l’obscurité, puis les gels sont balayés à l’aide du scanner d’électrophorèse différentielle en gel. En fin de compte, l’analyse des images numérisées est effectuée pour détecter les différences dans les taches gastroduodénales polypes entre les sous-ensembles de macrophages M1 et M deux. Le principal avantage de cette technique parmi les méthodes existantes comme l’électrophorèse classique sur gel de todi, est que cette technique est plus sensible, ne nécessitant que cinq microgrammes de protéines, ce qui est très important pour les échantillons obtenus sur des patients humains.Mario Bove, un étudiant au doctorat, Olivia Beza et un technicien Magac de mon laboratoire Pour préparer des cultures primaires de macrophages dérivés de monocytes, commencez par diluer 25 millilitres de Buffy coat dans 25 millilitres de PBS. Ensuite, chargez soigneusement le sang dilué sur un gradient de séparation et centrifugez les cellules pendant 20 minutes à 1600 G et à température ambiante lorsque les cellules ont fini de tourner. Prélever les monocytes au niveau de la couche d’interface, suivi de trois lavages successifs des cellules récoltées dans 10 millilitres de PBS contenant 0,1 % d’EDTA après le troisième lavage.Faites tourner les cellules une fois de plus dans du PBS seul, puis remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu RPMI 1640 sans graine de sérum. Les cellules dans des boîtes de 35 millimètres à une densité de un fois 10 à six cellules par boîte, puis après une sédimentation de 90 minutes dans l’incubateur, jetez le surnageant et lavez les monocytes adhérents trois fois avec un millilitre de PBS. Culture suivante, les cellules dans 10 millilitres de milieu frais contenant 10 % de volume par volume de sérum humain pendant six jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Ensuite, pour produire des macrophages anti-inflammatoires M deux, complétez certaines des cultures avec 15 nanogrammes par millilitre d’IL 4 le sixième jour de culture pour obtenir des macrophages pro-inflammatoires le 12e jour. Traiter les autres cultures de macrophages différenciés avec 100 nanogrammes par millilitre de LPS pendant quatre heures afin d’isoler les sous-ensembles de macrophages pour l’électrophorèse 2D. Ensuite, lavez la culture d’intérêt trois fois avec du tris de 25 millimolaires, puis libérez les cellules du fond des plaques avec un tampon d’extraction de chaps.Ensuite, transférez les cellules dans un micro-tube à centrifuger de 1,5 millilitre et lacez-les à quatre degrés Celsius. Après cinq minutes, transférez les cellules dans des aliquotes de 100 microlitres à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse de la concentration en protéines pour l’électrofocalisation ISO des sous-ensembles de macrophages. Tout d’abord, ajustez les échantillons à des aliquotes de neuf microlitres, puis réduisez les solutions cellulaires avec un tampon de lyse complété par deux millimolaires de PTEP à 37 degrés Celsius.Au bout d’une heure, incubez les extraits avec S SI trois et S SI cinq à 37 degrés Celsius, en arrêtant la réaction après 30 minutes avec l’ajout d’un volume égal de tampon d’échantillon. Créez ensuite deux mélanges séparés de volumes égaux de protéines S, SI, trois protéines M1 marquées avec SCI, cinq protéines M marquées deux. Ensuite, réhydratez une bande IPG avec 450 microlitres d’échantillons mélangés marqués dans un tampon d’extraction chaps sur un système de cellule de focalisation isoélectrique pendant 24 heures sans appliquer de courant.Le lendemain, lancez la mise au point à 300 volts pendant trois heures, puis mettez en place un gradient à 1000 volts pendant six heures, suivi de deux gradients de 8 000 volts pendant trois heures chacun pour effectuer une électrophorèse de deuxième dimension incuber les bandes IPG dans le tampon d’équilibration. Après 10 minutes, transférez les bandes sur des gels à 12,5 % et scellez-les avec des aros à faible point de fusion. Ensuite, utilisez un système edin dsic à une tension constante de 70 volts pour effectuer l’électrophorèse à 20 degrés Celsius pendant la nuit, suivie d’une course de 300 volts jusqu’à ce que le front bleu de bromo phénol atteigne le bas du gel pour acquérir des images des gels.Placez-les entre les deux plaques de verre à faible fluorescence d’un scanner imageur d’électrophorèse différentielle et de gel, et balayez les gels à des longueurs d’onde d’émission d’excitation de 5 32, 5 80 nanomètres pour trois et 6 33 6 70 nanomètres pour cinq pour produire des images d’une taille de pixel de 100 micromètres. Analysez le avec le logiciel approprié, puis calculez et normalisez les volumes ponctuels dans chaque image, en attribuant un volume ponctuel normalisé en proportion de la valeur totale de chaque point détecté dans le gel. Analysez les différences de volumes de taches protéiques pour chaque type de macrophage en comparant la valeur normalisée du volume de taches entre les deux groupes de macrophages, en considérant que la différence entre les volumes de taches est significative si la variation est de 1,5 fois.Dans cette expérience. Les profils protéiques 2D des deux sous-types de macrophages M1 pro-inflammatoire et M deux anti-inflammatoires ont été déterminés par différentiel 2D. Dans l’électrophorèse sur gel, le même motif de protéines a été observé pour M1 ou M deux, indépendamment des colorants cyan utilisés.Fait intéressant, l’analyse bio-informatique du gel a révélé que 20 zones contenant des taches, des augmentations et des diminutions entre les volumes de taches ont été quantifiées comme visualisées par les taches de coloration jaune, bleue et verte ont été considérées comme ayant une expression différentielle significative si le changement de pli du volume de la tache normalisée était supérieur à 1,5 avec une valeur P inférieure à 0,05. À la suite de ce CHE, des méthodes telles que la spectrométrie quantitative, la spectrométrie de masse ou l’analyse protéomique supplémentaire peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que le type de protéines exprimées de manière différentielle entre les deux sous-ensembles de macrophages en réponse à divers stimuli.

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