La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

L’objectif global de cette procédure est de quantifier objectivement les paramètres synaptiques, y compris la taille des synaptes, la fragmentation et la densité relative des protéines dans la membrane post-synaptique. Pour ce faire, il faut d’abord disséquer le muscle d’intérêt des animaux de laboratoire. Ensuite, le muscle disséqué est cryosectionné, et les sections sont immuno-colorantes pour la microscopie à fluorescence.

Ensuite, sur phos, des images des jonctions neuromusculaires des différents groupes de traitement sont échantillonnées objectivement, et l’intensité relative de la coloration pour les spécialisations synaptiques est quantifiée. En définitive, des mesures quantitatives reproductibles des effets d’un traitement ou d’une modification génétique sur l’organisation structurale de la jonction neuromusculaire sont obtenues par microscopie confocale. Eh bien, cette méthode fournit des protocoles objectifs standardisés utilisant la microscopie confocale pour évaluer les changements dans la structure de la jonction neuromusculaire dans des modèles murins de troubles tels que la myasthénie grave et la maladie du motoneurone.

En général, les personnes qui tentent cette méthode peuvent la trouver difficile car l’échantillonnage du NPLS sur le microscope confocal de manière impartiale et objective nécessite une planification. Après échantillonnage, l’analyse du NPLS doit être effectuée de manière cohérente et reproductible, où la variabilité d’un animal à l’autre entre les paramètres nplate peut rendre cela difficile. Après avoir isolé la cryosection et la coloration immunofluorescente, les jonctions neuromusculaires de souris ou njs, selon le protocole de texte, aveuglent les lames en étiquetant chacune d’entre elles avec un nombre aléatoire qui reste connu uniquement d’un deuxième chercheur jusqu’à ce que la quantification des paramètres NMJ soit terminée. Placez une lame sur la platine du microscope et utilisez un ensemble de filtres TRIT C pour la visualiser sous un éclairage à grand champ.

Déplacez-vous progressivement à travers les champs de gauche à droite et en arrière jusqu’à ce qu’une plaque d’extrémité apparaisse sur le champ avec le sténopé confocal réglé sur une unité d’air de 1,0, et en utilisant une faible puissance laser, optimisez les niveaux de gain et de décalage pour trit C rouge BGT sur la plaque d’extrémité à imager. Ensuite, à l’aide du laser de 488 nanomètres, optimisez la fluorescence C, qui représente la synaptophysine, puis collectez une pile Z de la plaque d’extrémité avec un intervalle de 0,7 micron entre chaque tranche optique. Enregistrez les images avec un nom de fichier qui inclut la date de la session d’imagerie, le nom de code de la diapositive et le numéro de la plaque d’extrémité.

Répétez la procédure d’échantillonnage et d’imagerie qui vient d’être démontrée jusqu’à ce que 20 plaques d’extrémité soient prélevées sur la lame ou l’échantillon. Répétez ensuite le processus pour les lames codées restantes sous les mêmes paramètres confocaux. Prenez quelques images de la diapositive de contrôle.

Utilisez le freeware image J pour ouvrir un Zack et dans un canal fluorescent, préparer une image de projection maximale. Enregistrez les projections sous forme de fichiers TIF avec le nom du fichier, y compris la date de session de l’image, le code de l’échantillon, le numéro de la plaque d’extrémité et le canal fluorescent. Utilisez maintenant l’image J pour ouvrir la projection Z.

Sélectionnez le récepteur de l’acétylcholine ou un canal d’image CHR et sélectionnez le type d’image huit bits pour convertir l’image colorée RVB 24 bits en une image en niveaux de gris de huit bits à l’écran avec l’outil polygone. Dans le canal de coloration BGT rouge, tracez un contour approximatif autour de la plaque d’extrémité d’intérêt, à l’exclusion de toute coloration qui ne provient pas de la plaque d’extrémité d’intérêt. Sélectionnez Seuil de réglage de l’image pour appliquer un seuil d’intensité minimum à l’image.

Ajustez le niveau de seuil pour isoler les parties colorées A CHR tout en excluant le signal de fond environnant en tant que sous-seuil. Ouvrez ensuite une deuxième fenêtre avec l’image originale en tons pleins pour comparaison. Pour confirmer les paramètres de seuil avec le contour du polygone toujours présent, sélectionnez analyser, analyser les particules dans le menu contextuel.

Spécifiez la plage de tailles en nombre de pixels de 50 à l’infini, ce qui élimine la sélection de minuscules artefacts résultant du bruit électrique. Dans le multiplicateur de photos, cliquez sur analyser les particules pour générer une fenêtre avec une liste de zones discrètes au-dessus du seuil et leurs valeurs d’intensité de fluorescence numérotées telles qu’elles apparaissent dans l’image binaire. Copiez ces données dans une feuille de calcul étiquetée pour mesurer la surface totale de la plaque d’extrémité.

Dans le polygone, sélectionnez Analyser la mesure, copiez et collez les données des zones et des intensités A CHR dans une feuille de calcul avec des colonnes étiquetées. Passez au canal synaptophysine. Préparez une image de projection maximale.

Sélectionnez une zone d’intérêt et définissez le seuil d’intensité minimum tel que démontré ci-dessus. Pour mesurer la zone de chevauchement, procédez comme suit. Ouvrez le fichier d’origine contenant les images des deux couches et sélectionnez les piles d’images.

Empilez les images pour le diviser en deux images distinctes. À l’aide du plugin de colocalisation de l’image J, sélectionnez la colocalisation du plugin et saisissez les valeurs de seuil précédemment enregistrées pour le CHR A et les canaux nerveux dans la boîte de requête du canal respectif. Le résultat est une image superposée en pixels blancs.

Convertissez l’image de chevauchement nouvellement créée en un format d’échelle de gris et appliquez un seuil à la valeur maximale, qui ne sélectionnera que les pixels blancs correspondant à la zone de chevauchement des deux canaux précédents. Enregistrez dans la feuille de calcul la valeur de surface résultante de la colocalisation, qui représente la zone de chevauchement en pixels, préparez une feuille de calcul de données. L’échantillonnage signifie calculer et tracer les écarts-types et les erreurs-types sous forme d’histogrammes ou de nuages de points.

Tracez et plaquez les zones CHR sous forme de nuages de points ou d’histogrammes de fréquence pour déterminer si les données sont normalement distribuées avant les tests statistiques. Après avoir préparé la coloration immunofluorescente et l’imagerie des sections transversales de fibres musculaires comme indiqué dans le protocole texte, ouvrez un fichier image original et pendant que vous visualisez le canal A CHR, sélectionnez piles d’images empilées aux images pour diviser les canaux, sélectionnez le type d’image huit bits pour convertir le format d’échelle de gris huit bits à l’écran. Faites-le pour les deux canaux de fluorescence.

Sélectionner les images empilées d’images à empiler et ouvrir une nouvelle pile à partir de deux images de huit bits précédemment séparées, ce qui permet de basculer entre les deux canaux de fluorescence dans la fenêtre unique avec l’outil polygone. Tracez une ligne serrée autour de la limite de la coloration A CHR, sélectionnez Analyser la mesure pour mesurer l’intensité moyenne de A CHR dans la zone fermée. Copiez cette valeur dans une feuille de calcul étiquetée tout en conservant le contour du polygone.

Passez au deuxième canal de fluorescence et sélectionnez Analyser la mesure. Cela donnera la coloration moyenne de la protéine d’intérêt dans la zone synaptique définie par une coloration CHR. Choisissez une zone à l’écart des taches visibles de la plaque d’extrémité.

Sélectionnez ensuite Analyser la mesure pour mesurer l’intensité moyenne de la fluorescence de fond. Répétez la mesure pour les autres canaux de fluorescence et copiez les valeurs de fond dans la feuille de calcul des valeurs de fluorescence. Soustrayez les valeurs de fond moyennes des valeurs de la plaque d’extrémité pour obtenir les intensités corrigées pour A CHR et la protéine d’intérêt à chaque plaque d’extrémité.

Enfin, divisez les valeurs d’intensité nplate corrigées pour la protéine d’intérêt par l’intensité de fluorescence BGT corrigée pour obtenir les rapports d’intensité de fluorescence comme indiqué ici. L’intensité de fluorescence pour A CHR et la synaptophysine augmente brusquement à la limite entre la partie synaptique et synaptique du PERS de la plaque d’extrémité du moteur. Pour de telles images, un seuil minimum isolera facilement la zone riche en A CHR ou en synaptophysine de la plaque terminale.

Comme le montre cette figure chez des souris âgées et dans certains états pathologiques, la coloration de la synaptophysine peut être moins intense. Les courbes de dispersion de l’autofluorescence révèlent une gamme considérable dans la zone riche en A CHR parmi les plaques terminales du muscle antérieur tibial de n’importe quelle souris individuelle. Néanmoins, la zone moyenne A CHR basée sur 15 à 20 images de la plaque d’extrémité du visage était similaire chez sept souris échantillons.

La fluorescence de fond de faible intensité, comme illustrée ici sur le canal Synaptophysine, révèle généralement si une tache de coloration A CHR représente une seule plaque d’extrémité ou deux plaques d’extrémité distinctes situées sur des fibres musculaires adjacentes. De plus, de nombreuses protéines synaptiques telles que le rapson, le musc et le bêta-distroglycane sont co-localisées avec un CHR au niveau de la nplate. Lors de la tentative de cette procédure, il est important que les expérimentateurs restent aveugles aux groupes de traitement et de génotype lors de l’échantillonnage et de l’analyse des images nplate.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de recueillir, d’échantillonner et d’analyser des images fluorescentes confocales de jonctions neuromusculaires. En fin de compte, les chercheurs devraient être en mesure de comparer de manière cohérente et objective différents paramètres structurels de la nplate entre différents groupes de traitement et génotypes.