Name: La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Découvrez la quantification des paramètres synaptiques à la jonction neuromusculaire par microscopie confocale. Cette méthode permet d'évaluer objectivement la taille, la fragmentation et la densité protéique postsynaptique dans des modèles de pathologies neuromusculaires.

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Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale [570930]. L’imagerie a été réalisée dans l’installation de microscopie avancée de l’Institut Bosch. Les anciens membres du laboratoire, dont les travaux sont cités, sont remerciés pour leur contribution au développement de ces méthodes.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
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<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
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<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les protocoles décrits ici nous ont permis de mesurer de manière fiable et quantifier les changements dans les propriétés de la NMJ toute une gamme de conditions, notamment le vieillissement et les maladies états normaux. Les méthodes décrites pour en Face images NMJ permettront aux chercheurs de comparer le domaine des spécialisations pré- et post-synaptiques et la région synaptique de chevauchement / alignement. Pour comparer l&#39;intensité relative des protéines pré- et post-synaptiques le deuxième protocole, qui ut...

La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse de relais essentiel qui médie la communication entre le système nerveux et le muscle squelettique. Il est nécessaire pour tout mouvement volontaire. La microscopie à fluorescence a longtemps été utilisé pour étudier les effets des transgènes sur la souris NMJ 1-3 ou de comparer les effets de l&#39;âge, l&#39;alimentation, l&#39;exercice et la maladie sur NMJs de rongeurs 4-11. Ces études nous ont beaucoup appris sur la physiologie et la physiopathologie de la NMJ, mais les divers paramètres déclarés (par exemple, la zone AChR, zone flasque, longueur du périmètre, indices de fragmentation) font qu&#39;il est souvent difficile de comparer les résultats de ces études. Il ya une attente de plus en plus pour les chercheurs précliniques pour pouvoir démontrer la reproductibilité, en particulier dans les études avec des modèles de rongeurs de la maladie 12. Les protocoles décrits ici ont été affinées par une série d&#39;études qui a enquêté ch développement, physiologique et physiopathologiqueAnges à l&#39;NMJ. Ces études nécessitent la mesure de la zone de spécialisations synaptiques à la plaque motrice de la souris et de la densité relative de l&#39;emballage de protéines synaptiques dans les spécialisations post-synaptiques 13-15. L&#39;utilité de ces méthodes est illustrée par des études récentes dans un modèle de souris de l&#39;anti-MuSK myasthénie. Injections quotidiennes d&#39;IgG de myasthénie anti-MuSK positif gravis patients dans des souris adultes causés à devenir faible dans les deux semaines 16. Confocale images maximale de projection de sections musculaires qui ont été doublement marquée pour la synaptophysine (en nerveuses terminaux) et post-synaptiques AChR révélé un déclin progressif dans le domaine de AChR coloration que le principal changement. Surtout le taux de déclin était suffisante pour expliquer les baisses comparables dans l&#39;amplitude des potentiels synaptiques, l&#39;échec de la transmission synaptique et une faiblesse musculaire 17,18. Qualitativement résultats similaires ont été rapportés par d&#39;autres groupes de recherche10,19. Les mêmes méthodes de mesure NMJ ont depuis été utilisés pour évaluer l&#39;impact de trois médicaments pour le traitement anti-MuSK myasthénie grave dans ce modèle de souris 20,21. Vieillissement sédentaire peut conduire à la perte de connexions neuromusculaires. Les protocoles décrits ici ont révélé une baisse liée à l&#39;âge dans le domaine de terminaison nerveuse synaptophysine à plaques motrices que les souris progressent dans la vieillesse. Les mêmes méthodes ont révélé que l&#39;exercice volontaire pourrait largement éviter la réduction de nerf présynaptique zone de la borne 22, en accord avec les travaux antérieurs par d&#39;autres groupes 4. Perte de connexions neuromusculaires se produit également dans le modèle de la souris SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique 9,23. Les études mentionnées ci-dessus démontrent que une variété de conditions de santé peut conduire à des réductions dans le domaine de spécialisation soit pré- ou post-synaptiques au NMJ. Cela peut entraîner dans l&#39;amusement synaptique altéréection ou peut annoncer une perte complète de la connexion neuromusculaire. Trois protocoles sont décrits qui permettent la quantification de la superficie et de la densité de spécialisations synaptiques. Le but du premier protocole est de fournir une mesure pratique et reproductible des zones de pré et post-synaptiques spécialisations et leur alignement au NMJs mammifères, en utilisant la microscopie de fluorescence. Images bidimensionnelles projection confocale maximales et analyse d&#39;image avec les NIH ImageJ est utilisé pour détecter des changements dans le domaine de la coloration (synaptophysine des vésicules synaptiques), AChR post-synaptiques et de la zone de chevauchement synaptique. Paramètres d&#39;imagerie confocale (gain et décalage de niveau) sont optimisés pour chaque NMJ de façon à maximiser l&#39;information visuelle utilisée pour discerner le domaine de spécialisation synaptique. Insuffisance neuromusculaire peut également résulter de changements dans la densité post-synaptique du CCRS et / ou d&#39;autres protéines synaptiques. Le deuxième protocole peut être appliqué à détecter les changements dans la densité relative de ces protéines postsynaptiquesque le musc, rapsyne, dystroglycane, phosphorylée kinase Src et phosphorylée AChR 18,21. Dans la myasthénie grave, une densité réduite de AChR dans la membrane post-synaptique est la cause immédiate de l&#39;insuffisance synaptique et une faiblesse musculaire. Le troisième protocole décrit une méthode Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour évaluer les changements dans la proximité de AChR adjacentes dans des membranes post-synaptiques 14,15. Cette méthode détecte transfert d&#39;énergie entre AChR voisins marqués par fluorescence-α-bungarotoxine (BGT). FRET se produit uniquement lorsque les sondes fluorescentes donneur et accepteur sont à moins de 10 nm de l&#39;autre. Cela peut révéler (microscopiques) des changements dans l&#39;étanchéité de AChR emballage qui peuvent être directement liés à l&#39;amplitude des potentiels synaptiques. Ces trois protocoles, raffinés au cours de la dernière décennie, fournissent des mesures complémentaires d&#39;intégrité NMJ d&#39;une manière cohérente et reproductible. Utilisation de protocoles normalisés unend paramètres devraient faciliter la comparaison des effets des gènes et des interventions environnementales sur le NMJ mammifères.

<table><tbody><tr><td>Microscope confocal à balayage</td><td>Leica</td><td>DM 2000 avec&nbsp ; Système TCS SP2</td><td>La plupart des microscopes confocaux à balayage doivent convenir.&nbsp ;</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotoxine (red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>Utilisé pour l’étiquetage AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha ;-bungarotoxin (far-red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>Fluorescence rouge lointaine : à peine visible à travers l’oculaire</td></tr><tr><td>anti-synaptophysin chez le lapin</td><td>Life technologies</td><td>18-0130</td> Différents <td>lots d’anticorps primaires diffèrent par leur dilution de travail efficace</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>Anticorps monoclonal conjugué à FITC</td></tr><tr><td>FITC-donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td> La <td>qualité des anticorps secondaires polyclonaux peut varier selon la source et le lot</td></tr><tr><td>Température de coupe optimale (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Matrice d’enrobage de cryostat pour la congélation des muscles</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Milieu de montage qui ralentit le photoblanchiment des fluorophores</td></tr></tbody></table>

la jonction neuromusculaire: synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans synaptic protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La jonction neuromusculaire (JNM) est le grand, le relais synapse cholinergique par lequel les neurones moteurs de mammifères contrôlent contraction des muscles volontaires. Les changements structurels au NMJ peuvent entraîner l&#39;échec de la neurotransmission, résultant dans la faiblesse, l&#39;atrophie et même la mort de la fibre musculaire. De nombreuses études ont étudié comment les modifications génétiques ou de maladies peuvent modifier la structure de la jonction neuromusculaire de la souris. Malheureusement, il peut être difficile de comparer directement les résultats de ces études parce qu&#39;ils travaillent souvent différents paramètres et les méthodes analytiques. Trois protocoles sont décrits ici. La première utilise la projection d&#39;intensité maximale images confocales pour mesurer la surface des récepteurs de l&#39;acétylcholine (RACh) riche domaines membranaires post-synaptiques à la plaque d&#39;extrémité et la surface de la vésicule synaptique coloration dans la terminaison nerveuse présynaptique sus-jacente. Le deuxième protocole compare les intensités relatives des immunocoloration des protéines synaptiques dans la membrane post-synaptique. La troisième protocole utilise Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour détecter les changements dans l&#39;emballage d&#39;AChR post-synaptiques à la plaque d&#39;extrémité. Les protocoles ont été développé et affiné au cours d&#39;une série d&#39;études. Les facteurs qui influencent la qualité et la cohérence des résultats sont discutés et données normatives sont fournis pour NMJs chez les jeunes souris adultes en bonne santé.

Mesure de Synaptic zone au NMJ Toute estimation de la zone repose sur le dessin d'une frontière à définir l'étendue de spécialisations synaptiques. Chez les jeunes adultes en bonne santé muscles images NMJ devraient afficher limites bien définies à la fois pour AChR et synaptophysine coloration (figure 2A et B). L'intensité de fluorescence à la fois pour la synaptophysine AChR et augmente brusquement à la limite entre la partie péri-synaptiq...

La jonction neuromusculaire (JNM) est altérée dans diverses affections qui peuvent parfois aboutir à une insuffisance synaptique. Ce rapport décrit des méthodes basées sur le microscope à fluorescence pour quantifier de tels changements structurels.

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

L’objectif global de cette procédure est de quantifier objectivement les paramètres synaptiques, y compris la taille des synaptes, la fragmentation et la densité relative des protéines dans la membrane post-synaptique. Pour ce faire, il faut d’abord disséquer le muscle d’intérêt des animaux de laboratoire. Ensuite, le muscle disséqué est cryosectionné, et les sections sont immuno-colorantes pour la microscopie à fluorescence.Ensuite, sur phos, des images des jonctions neuromusculaires des différents groupes de traitement sont échantillonnées objectivement, et l’intensité relative de la coloration pour les spécialisations synaptiques est quantifiée. En définitive, des mesures quantitatives reproductibles des effets d’un traitement ou d’une modification génétique sur l’organisation structurale de la jonction neuromusculaire sont obtenues par microscopie confocale. Eh bien, cette méthode fournit des protocoles objectifs standardisés utilisant la microscopie confocale pour évaluer les changements dans la structure de la jonction neuromusculaire dans des modèles murins de troubles tels que la myasthénie grave et la maladie du motoneurone.En général, les personnes qui tentent cette méthode peuvent la trouver difficile car l’échantillonnage du NPLS sur le microscope confocal de manière impartiale et objective nécessite une planification. Après échantillonnage, l’analyse du NPLS doit être effectuée de manière cohérente et reproductible, où la variabilité d’un animal à l’autre entre les paramètres nplate peut rendre cela difficile. Après avoir isolé la cryosection et la coloration immunofluorescente, les jonctions neuromusculaires de souris ou njs, selon le protocole de texte, aveuglent les lames en étiquetant chacune d’entre elles avec un nombre aléatoire qui reste connu uniquement d’un deuxième chercheur jusqu’à ce que la quantification des paramètres NMJ soit terminée. Placez une lame sur la platine du microscope et utilisez un ensemble de filtres TRIT C pour la visualiser sous un éclairage à grand champ.Déplacez-vous progressivement à travers les champs de gauche à droite et en arrière jusqu’à ce qu’une plaque d’extrémité apparaisse sur le champ avec le sténopé confocal réglé sur une unité d’air de 1,0, et en utilisant une faible puissance laser, optimisez les niveaux de gain et de décalage pour trit C rouge BGT sur la plaque d’extrémité à imager. Ensuite, à l’aide du laser de 488 nanomètres, optimisez la fluorescence C, qui représente la synaptophysine, puis collectez une pile Z de la plaque d’extrémité avec un intervalle de 0,7 micron entre chaque tranche optique. Enregistrez les images avec un nom de fichier qui inclut la date de la session d’imagerie, le nom de code de la diapositive et le numéro de la plaque d’extrémité.Répétez la procédure d’échantillonnage et d’imagerie qui vient d’être démontrée jusqu’à ce que 20 plaques d’extrémité soient prélevées sur la lame ou l’échantillon. Répétez ensuite le processus pour les lames codées restantes sous les mêmes paramètres confocaux. Prenez quelques images de la diapositive de contrôle.Utilisez le freeware image J pour ouvrir un Zack et dans un canal fluorescent, préparer une image de projection maximale. Enregistrez les projections sous forme de fichiers TIF avec le nom du fichier, y compris la date de session de l’image, le code de l’échantillon, le numéro de la plaque d’extrémité et le canal fluorescent. Utilisez maintenant l’image J pour ouvrir la projection Z.Sélectionnez le récepteur de l’acétylcholine ou un canal d’image CHR et sélectionnez le type d’image huit bits pour convertir l’image colorée RVB 24 bits en une image en niveaux de gris de huit bits à l’écran avec l’outil polygone. Dans le canal de coloration BGT rouge, tracez un contour approximatif autour de la plaque d’extrémité d’intérêt, à l’exclusion de toute coloration qui ne provient pas de la plaque d’extrémité d’intérêt. Sélectionnez Seuil de réglage de l’image pour appliquer un seuil d’intensité minimum à l’image.Ajustez le niveau de seuil pour isoler les parties colorées A CHR tout en excluant le signal de fond environnant en tant que sous-seuil. Ouvrez ensuite une deuxième fenêtre avec l’image originale en tons pleins pour comparaison. Pour confirmer les paramètres de seuil avec le contour du polygone toujours présent, sélectionnez analyser, analyser les particules dans le menu contextuel.Spécifiez la plage de tailles en nombre de pixels de 50 à l’infini, ce qui élimine la sélection de minuscules artefacts résultant du bruit électrique. Dans le multiplicateur de photos, cliquez sur analyser les particules pour générer une fenêtre avec une liste de zones discrètes au-dessus du seuil et leurs valeurs d’intensité de fluorescence numérotées telles qu’elles apparaissent dans l’image binaire. Copiez ces données dans une feuille de calcul étiquetée pour mesurer la surface totale de la plaque d’extrémité.Dans le polygone, sélectionnez Analyser la mesure, copiez et collez les données des zones et des intensités A CHR dans une feuille de calcul avec des colonnes étiquetées. Passez au canal synaptophysine. Préparez une image de projection maximale.Sélectionnez une zone d’intérêt et définissez le seuil d’intensité minimum tel que démontré ci-dessus. Pour mesurer la zone de chevauchement, procédez comme suit. Ouvrez le fichier d’origine contenant les images des deux couches et sélectionnez les piles d’images.Empilez les images pour le diviser en deux images distinctes. À l’aide du plugin de colocalisation de l’image J, sélectionnez la colocalisation du plugin et saisissez les valeurs de seuil précédemment enregistrées pour le CHR A et les canaux nerveux dans la boîte de requête du canal respectif. Le résultat est une image superposée en pixels blancs.Convertissez l’image de chevauchement nouvellement créée en un format d’échelle de gris et appliquez un seuil à la valeur maximale, qui ne sélectionnera que les pixels blancs correspondant à la zone de chevauchement des deux canaux précédents. Enregistrez dans la feuille de calcul la valeur de surface résultante de la colocalisation, qui représente la zone de chevauchement en pixels, préparez une feuille de calcul de données. L’échantillonnage signifie calculer et tracer les écarts-types et les erreurs-types sous forme d’histogrammes ou de nuages de points.Tracez et plaquez les zones CHR sous forme de nuages de points ou d’histogrammes de fréquence pour déterminer si les données sont normalement distribuées avant les tests statistiques. Après avoir préparé la coloration immunofluorescente et l’imagerie des sections transversales de fibres musculaires comme indiqué dans le protocole texte, ouvrez un fichier image original et pendant que vous visualisez le canal A CHR, sélectionnez piles d’images empilées aux images pour diviser les canaux, sélectionnez le type d’image huit bits pour convertir le format d’échelle de gris huit bits à l’écran. Faites-le pour les deux canaux de fluorescence.Sélectionner les images empilées d’images à empiler et ouvrir une nouvelle pile à partir de deux images de huit bits précédemment séparées, ce qui permet de basculer entre les deux canaux de fluorescence dans la fenêtre unique avec l’outil polygone. Tracez une ligne serrée autour de la limite de la coloration A CHR, sélectionnez Analyser la mesure pour mesurer l’intensité moyenne de A CHR dans la zone fermée. Copiez cette valeur dans une feuille de calcul étiquetée tout en conservant le contour du polygone.Passez au deuxième canal de fluorescence et sélectionnez Analyser la mesure. Cela donnera la coloration moyenne de la protéine d’intérêt dans la zone synaptique définie par une coloration CHR. Choisissez une zone à l’écart des taches visibles de la plaque d’extrémité.Sélectionnez ensuite Analyser la mesure pour mesurer l’intensité moyenne de la fluorescence de fond. Répétez la mesure pour les autres canaux de fluorescence et copiez les valeurs de fond dans la feuille de calcul des valeurs de fluorescence. Soustrayez les valeurs de fond moyennes des valeurs de la plaque d’extrémité pour obtenir les intensités corrigées pour A CHR et la protéine d’intérêt à chaque plaque d’extrémité.Enfin, divisez les valeurs d’intensité nplate corrigées pour la protéine d’intérêt par l’intensité de fluorescence BGT corrigée pour obtenir les rapports d’intensité de fluorescence comme indiqué ici. L’intensité de fluorescence pour A CHR et la synaptophysine augmente brusquement à la limite entre la partie synaptique et synaptique du PERS de la plaque d’extrémité du moteur. Pour de telles images, un seuil minimum isolera facilement la zone riche en A CHR ou en synaptophysine de la plaque terminale.Comme le montre cette figure chez des souris âgées et dans certains états pathologiques, la coloration de la synaptophysine peut être moins intense. Les courbes de dispersion de l’autofluorescence révèlent une gamme considérable dans la zone riche en A CHR parmi les plaques terminales du muscle antérieur tibial de n’importe quelle souris individuelle. Néanmoins, la zone moyenne A CHR basée sur 15 à 20 images de la plaque d’extrémité du visage était similaire chez sept souris échantillons.La fluorescence de fond de faible intensité, comme illustrée ici sur le canal Synaptophysine, révèle généralement si une tache de coloration A CHR représente une seule plaque d’extrémité ou deux plaques d’extrémité distinctes situées sur des fibres musculaires adjacentes. De plus, de nombreuses protéines synaptiques telles que le rapson, le musc et le bêta-distroglycane sont co-localisées avec un CHR au niveau de la nplate. Lors de la tentative de cette procédure, il est important que les expérimentateurs restent aveugles aux groupes de traitement et de génotype lors de l’échantillonnage et de l’analyse des images nplate.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de recueillir, d’échantillonner et d’analyser des images fluorescentes confocales de jonctions neuromusculaires. En fin de compte, les chercheurs devraient être en mesure de comparer de manière cohérente et objective différents paramètres structurels de la nplate entre différents groupes de traitement et génotypes.

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La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale (Vidéo) | JoVE Journal

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

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