Méthode d'évaluation des effets d'une gamme de longueurs d'onde et des intensités de Luminothérapie Rouge / proche infrarouge sur le stress oxydatif In Vitro

L’objectif général de la procédure suivante est d’évaluer les effets d’une gamme de longueurs d’onde et d’intensités de la thérapie par la lumière rouge proche infrarouge sur le stress oxydatif in vitro. Pour ce faire, nous avons mis au point une nouvelle méthode de diffusion de la lumière où nous pouvons manipuler la longueur d’onde et l’intensité délivrées. Nous montons une source lumineuse au xénon ou à large bande dans un boîtier sur une base métallique, puis nous plaçons une lentille de revêtement, un filtre à eau et une ouverture d’entrée devant la lumière.

L’étape suivante de la procédure consiste à guider la lumière générée par la source lumineuse à large bande à travers l’entrée, l’ouverture et le guide de lumière liquide, ainsi qu’à travers une deuxième lentille de revêtement. Ensuite, des filtres de bande passante et de densité neutre sont installés pour obtenir la longueur d’onde et l’intensité souhaitées de la lumière. Notez que les filtres permettent le passage d’une gamme étroite de longueurs d’onde appelée bande d’ondes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d’administration de la thérapie par la lumière rouge proche infrarouge, telles que les LED ou les lasers, est qu’elle permet une manipulation précise et calibrée des paramètres de longueur d’onde et d’intensité. Cela nous permet ensuite d’optimiser la distribution de la lumière pour obtenir les meilleurs résultats biologiques que l’étude actuelle administre aux cellules dissociées. En outre, il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les organotypiques, les modèles de neurotraumatismes.

Lorsque vous travaillez avec une source lumineuse à large bande lumineuse, assurez-vous de ne pas regarder directement dans la source de lumière, car cela pourrait entraîner des dommages visuels permanents. Pour préparer l’appareil de diffusion de la lumière, connectez une source lumineuse à large bande telle qu’une lampe au xénon ou au tungstène à une alimentation appropriée. Placez une lentille d’assemblage devant la source lumineuse pour produire un faisceau de lumière assemblé.

Faites passer la lumière à travers un filtre thermique liquide pour éliminer la majeure partie de la chaleur du faisceau lumineux. Placez une lentille d’assemblage devant la source lumineuse pour produire un faisceau de lumière assemblé. Faites passer la lumière à travers un filtre thermique liquide pour éliminer la majeure partie de la chaleur du faisceau lumineux.

En fonction de l’application, focalisez le faisceau assemblé sur l’extrémité d’entrée d’un guide de lumière liquide pour fournir une distribution plus flexible de la lumière. À l’autre extrémité du guide de lumière liquide, positionnez une deuxième lentille de revêtement, puis un support pour les filtres d’interférence et de densité neutre. Cette disposition doit produire un point lumineux uniformément éclairé de la bande d’onde et de l’intensité souhaitées.

La distance entre l’extrémité du guide de lumière et le plan de l’échantillon peut devoir varier en fonction de la zone à éclairer. Il est important de se rappeler que, conformément à la loi de l’inverse du carré, à mesure que la distance de l’extrémité du guide de lumière augmente, l’intensité lumineuse diminuera dans la présente étude. Cette distance est de 14 centimètres, ce qui permet de produire une section transversale de faisceau qui éclaire uniformément une zone de trois puits sur trois sur une plaque de culture tissulaire de 96 puits.

Assurez-vous que la lumière parasite de la lampe et des composants optiques associés ne peut pas atteindre d’autres échantillons, par exemple en utilisant du carton noir. Une fois l’appareil construit, allumez le refroidisseur d’eau du filtre à chaleur liquide et assurez-vous qu’il y a un échange d’eau à travers la chemise filtrante. Allumez la source d’alimentation de la lampe et attendez au moins cinq minutes la source lumineuse à large bande.

Pour stabiliser, sélectionnez un filtre d’interférence à bande étroite pour générer la bande d’ondes d’éclairage souhaitée. Mesurez la lumière produite par la lampe au niveau du plan où l’échantillon doit être positionné. Pendant le traitement.

La lumière est mesurée à l’aide d’une sonde d’irradiance calibrée reliée à un spectre approprié. Radiomètre. Utilisez des filtres à densité neutre pour ajuster l’intensité de la lumière jusqu’à ce que la sortie souhaitée soit obtenue. Dans la présente étude, l’intensité de la lumière passée par chaque filtre d’interférence est ajustée pour donner une sortie quale égale à chacune des quatre bandes d’ondes de traitement.

La méthode d’administration de la thérapie par la lumière rouge proche infrarouge décrite peut être appliquée à n’importe quel type de cellule ou système modèle in vitro. Nous montrons ici notre technique d’administration de la lumière aux cellules à l’aide de phéochromocytome ou de cellules PC 12. À titre d’exemple, des cellules de culture dans des milieux de croissance.

Dans 96, les plateaux sont recouverts de polyol lysine jusqu’à ce qu’ils soient confluents à 70 à 80 %. Préparez la concentration souhaitée de glutamate ou d’un autre facteur de stress dans un milieu de culture de pleine croissance. Ici, nous utilisons 10 millimolaires de glutamate.

Retirez le milieu des cellules et lavez-les doucement trois fois avec une solution saline tampon phosphate. Après le lavage, ajoutez un milieu contenant du glutamate à un volume total de cent microlitres par puits. Immédiatement après l’ajout de glutamate ou du facteur de stress de votre choix, exposer les cellules à un traitement par la lumière aux longueurs d’onde et aux intensités souhaitées en plaçant la plaque de culture sous l’appareil de diffusion de lumière préparé.

Assurez-vous de modifier la qualité du faisceau lumineux en utilisant les combinaisons établies de filtres à densité neutre. En fonction de la longueur d’onde administrée. Une fois le traitement à la lumière terminé, placez les cellules sur une surface plane et incubez à 37 degrés Celsius dans des conditions régulées par le dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Des doses supplémentaires de thérapie par la lumière rouge proche infrarouge peuvent également être administrées. Avant d’effectuer la dernière série de traitement à la lumière, préparez les réactifs à utiliser pour la détection des espèces réactives de l’oxygène en tant qu’indicateur de stress oxydatif. Ici, nous utilisons des régimes indiqués qui deviennent fluorescents lorsqu’ils réagissent avec une gamme d’espèces réactives, y compris le dilu, l’acétate de fluorescéine D, administrons un traitement lumineux aux cellules comme décrit à l’étape quatre, nous nous assurons que les cellules sont traitées avec les grippes et les longueurs d’onde de lumière souhaitées.

Immédiatement après le traitement à la lumière, retirez le milieu contenant du glutamate et lavez-le deux fois avec du PBS. Procéder aux tests à l’aide de colorants indicateurs qui deviennent fluorescents lorsqu’ils réagissent avec les espèces réactives conformément aux instructions du fabricant. Mesurez la fluorescence générée par les colorants indicateurs à l’aide d’un lecteur de plaques réglé sur les paramètres d’excitation et d’émission appropriés.

Utilisez la couleur du kit métrique pour quantifier la concentration en protéines dans les puits selon les instructions du fabricant. Exprimez les résultats de fluorescence par rapport à la concentration en protéines de chaque puits individuel, puis analysez les résultats à l’aide d’un logiciel statistique. Le développement de cette technique ouvre la voie aux chercheurs qui étudient les effets de plusieurs longueurs d’onde et intensités de la thérapie par la lumière rouge proche infrarouge sur le stress oxydatif.

Cette technique peut être utilisée dans un éventail de systèmes modèles, y compris des cellules dissociées ou des cultures organotypiques.