Règlement des éléments nutritifs par l'alimentation continue pour l'expansion à grande échelle de cellules de mammifères en Spheroids

L’objectif global de ce processus est de cultiver un grand nombre de cellules dans des conditions nutritionnelles contrôlées. Utilisation d’équipements conventionnels trouvés dans un laboratoire de culture cellulaire. Les algorithmes associés permettent le contrôle et la manipulation des nutriments dans des plages expérimentales.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour les applications de culture cellulaire à grande échelle. Comme les thérapies cellulaires humaines. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la culture de cellules à grande échelle avec une distribution uniforme des nutriments et des gaz.

Cela permet des densités cellulaires plus élevées que les cultures cellulaires statiques ou nourries en vrac, augmente le rendement et réduit la perte de cellules. Cela peut être fait avec des équipements que l’on trouve couramment dans la plupart des laboratoires de culture cellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode peut être utile aux nouveaux chercheurs, car ces techniques utilisées peuvent être difficiles à maîtriser, en raison du grand nombre d’étapes qui doivent être préformées dans un ordre spécifique dans des conditions stériles.

Collectez les cinq composants primaires nécessaires au système d’alimentation. Un réservoir moyen, une pompe péristaltique, un bioréacteur agité, un réservoir de déchets et un ensemble d’échantillonnage de tubes conçus sur mesure. Établissez le réservoir moyen à l’aide d’une bouteille en verre d’un litre.

Le réservoir à déchets à l’aide d’une bouteille en verre de deux litres. Le bioréacteur agité à l’aide d’un réacteur en verre d’un volume de 250 ml. Utilisez une pompe péristaltique numérique ou une pompe similaire avec une tête de pompe à huit canaux pour contrôler l’échange de fluide.

Assemblez le réservoir et les couvercles du bioréacteur modifié à partir de plastique dur et autoclave. Avec des orifices de passage de tuyaux en acier inoxydable pour assurer la ventilation à travers des filtres stériles et permettre le transfert de fluide entre les réservoirs et les bioréacteurs. Fixez un tube d’évacuation fabriqué à partir de tubes d’aération en verre poreux au couvercle du bioréacteur à suspension agitée modifiée.

Assemblez des ensembles de tubulures de perfusion autoclavables à partir de connecteurs de tubulure en polyfluorure de vinylidène et de tubulures de pompe péristaltique durables. La longueur de la section dépend de la distance entre les différents composants. Assemblez la conduite d’alimentation à l’aide de deux diamètres de tube.

Utilisez L/S 14 pour le tube primaire qui couvrira la distance entre le bioréacteur et le réservoir de milieu. Insérez une longueur de tube L/S 13 au milieu de la longueur du tube pour la section de pompe, à l’aide des adaptateurs PVDF appropriés. Utilisez des adaptateurs de tubes barbelés en PVDF standard pour joindre deux morceaux de tube L/S 14 de chaque côté du tube de la section de pompe plus courte.

Assemblez la section de tuyauterie pour l’évacuation des déchets à l’aide d’un tube L/S 16 de plus grand diamètre et insérez une courte section de tube L/S 14 au milieu pour la section de pompage. Cela se fait de la même manière que l’assemblage de la ligne d’alimentation à l’aide d’adaptateurs à tuyaux cannelés en PVDF. Assemblez le dernier composant de l’ensemble de tubes en construisant l’ensemble à partir de trois longueurs de tubes courts L/S 14.

Reliés ensemble par un connecteur HVDF de type T et deux petits colliers de serrage sur deux des longueurs de tube. Connectez l’ensemble d’échantillon au connecteur d’échantillon en acier inoxydable fixé sur le couvercle du bioréacteur. Après la stérilisation, un filtre à gaz stérile sera fixé pour l’évacuation du gaz à l’une des longueurs serrées.

L’autre est utilisé pour la connexion à une seringue de prélèvement stérile. Autoclave l’ensemble d’échantillonnage pendant qu’il est connecté au bioréacteur, avant de commencer l’expérience, comme décrit dans le protocole textuel. Utilisez cet ensemble pour collecter des échantillons stériles du bioréacteur au besoin, sans perturber le processus d’alimentation en continu.

Fixez les évents stériles aux endroits appropriés sur les couvercles de la fiole tournante, du récipient moyen, des récipients à déchets et des orifices d’échantillonnage. Cultivez et récoltez les cellules comme décrit dans le protocole textuel. Laissez les cellules incuber à température ambiante dans de la trypsine pendant deux à trois minutes dans une enceinte de biosécurité, puis recueillez-les dans un tube conique.

Un petit échantillon cellulaire est ensuite prélevé et coloré au bleu trypan. Comptez la densité cellulaire à l’aide d’un microscope et d’un hémocytomètre standard avec coloration au bleu de trypan, comme décrit dans le protocole textuel. Ajouter le nombre total souhaité de cellules dans des bioréacteurs stériles en suspension agitée pour chaque condition.

Ajoutez le milieu dans le bioréacteur en suspension agitée à l’aide d’une pipette pour atteindre le volume total de culture souhaité. Déplacez le bioréacteur à suspension agitée avec des cellules vers une plaque d’agitation à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire. Cultivez des cellules dans les bioréacteurs sans les nourrir pendant trois jours à 37 degrés Celsius, avec 5 % de dioxyde de carbone, 100 % d’humidité relative et un taux d’agitation de 70 tr/min pour permettre la formation de sphéroïdes.

Après la formation du sphéroïde, retirez le bioréacteur en suspension agitée de l’incubateur. Assembler les composants du système d’alimentation en continu dans une enceinte de sécurité biologique. Remplissez d’abord un réservoir de milieu frais avec le milieu de culture souhaité, puis connectez-le d’un côté de la conduite d’alimentation.

Assurez-vous également que le réservoir de milieu frais est correctement ventilé avec un filtre stérile. Un filtre stérile doit être remplacé sur l’orifice d’entrée du bioréacteur pour filtrer le milieu avant qu’il n’entre dans le bioréacteur. Raccordez la conduite d’évacuation au réservoir de déchets moyen et assurez-vous que le réservoir de déchets est correctement ventilé avec un filtre stérile.

Placez le bioréacteur à suspension agitée sur la plaque d’agitation à l’intérieur de l’incubateur en utilisant les mêmes paramètres de culture que pour la formation de sphéroïdes. Placez le réservoir de fluide frais dans un mini-réfrigérateur à proximité. Assurez-vous que les conduites d’alimentation peuvent sortir du réfrigérateur sans empêcher les portes de se fermer.

Il est également essentiel que les conduites d’alimentation ne soient pas pincées par les portes du réfrigérateur ou de l’incubateur. Le réservoir de déchets peut être placé sur la paillasse à l’extérieur de l’incubateur à un endroit pratique. Passez les extrémités restantes du tube dans l’incubateur et connectez la conduite d’alimentation au filtre sur l’orifice d’entrée du bioréacteur.

Connectez ensuite la conduite de vidange à l’orifice du tube de sortie. Ensuite, placez la section de pompe des conduites d’alimentation et de déchets dans la tête de pompe, en assurant la bonne orientation afin que les conduites d’alimentation pompent le fluide du réservoir de fluide frais dans le bioréacteur à suspension agitée, et les conduites de déchets pompent le milieu du bioréacteur et vers le réservoir de déchets de milieu. Calculez la vitesse d’avance à l’aide de l’équation de vitesse d’avance ajustée comme décrit dans le protocole texte.

Utilisez l’échantillon le plus récent avec des informations sur le nombre de cellules, ainsi que la prédiction du taux de croissance et les mesures de glucose moyennes pour estimer le taux d’alimentation nécessaire pour maintenir la concentration de glucose souhaitée dans la culture. Réglez la vitesse de la pompe en fonction de la vitesse d’avance calculée. Répétez le calcul de la vitesse d’avance et ajustez la vitesse de la pompe pour chaque point d’échantillonnage.

Des mesures de glucose en milieu moyen sont présentées à partir de cultures de sphéroïdes d’insulinomes Beta-TC6 utilisant des bioréacteurs en suspension agités statiques et des méthodes de culture de bioréacteurs en suspension agitée alimentées en continu. Alimentation avec un milieu standard à haute teneur en glucose. L’alimentation continue est capable d’éliminer les fluctuations de glucose, mais les niveaux moyens de glucose dans le milieu changent radicalement pendant la période de culture et sont bien au-dessus de la plage physiologique.

L’alimentation ajustée est capable d’éliminer les fluctuations, ainsi que de maintenir les concentrations de glucose près des niveaux physiologiques pendant toute la durée de la période de culture. Ici, la croissance cellulaire signalée comme une variation du pli du nombre de cellules au cours de la période de culture de 21 jours est comparée pour les bioréacteurs en suspension agités avec des changements réguliers de milieu, les cultures de bioréacteurs en suspension agitée à vitesse d’alimentation constante et les cultures de bioréacteurs en suspension agitée à taux d’alimentation ajusté. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que des conditions variables, peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que les besoins en nutriments pour de nouvelles lignées cellulaires ou des résultats expérimentaux spécifiques.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer les besoins métaboliques dans les cellules d’humains atteints de cancer ou d’autres troubles. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler un système de culture cellulaire de profusion pour mieux contrôler les conditions de culture et maximiser les rendements cellulaires. N’oubliez pas que travailler avec des cellules humaines peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la protection contre les agents pathogènes transmissibles par le sang doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.