Fractionnement rapide et isolement de composants de sang total dans les échantillons obtenus à partir d'un milieu communautaire

L’objectif global de cette procédure est de fournir un protocole rationalisé qui permet un débit oculaire rapide, le traitement simultané d’échantillons de sang total. Dans un cadre non clinique, le traitement du vacutainer est effectué de manière à chevaucher pour permettre l’isolement efficace des fractions de haute qualité des cellules mononucléées du sang périphérique D-N-A-R-N-A ou du sérum PBMC et des fractions résiduelles de plasma et de globules rouges. Le traitement commence par la centrifugation du vacutainer sérique, l’élimination d’une aliquote d’un vacutainer contenant le vacutainer pour l’isolement de l’ADN, la centrifugation des tubes fiaux.

Ensuite, l’isolement de l’ADN après l’isolement de l’ADN dérivé de l’ARN dérivé du vacutainer K two EDTA peut se produire. Le sang de chaque vacutainer est passé à travers un filtre respectif et lavé avec du PBS, puis traité avec un agent stabilisant de l’ARN retournant dans le récipient contenant le vacutainer. Le plasma résiduel est aspiré et la couche mononucléaire est lavée avec du PBS.

Pendant que les tubes tournent, les globules rouges résiduels sont collectés et le sérum séparé est aliquote. Enfin, les pbmc sont conservés dans un milieu de congélation cellulaire. En fin de compte, des fractions de haute qualité de sang frais peuvent être produites dans les deux heures suivant le prélèvement et tous les échantillons prêts à être testés peuvent être disponibles dans les deux jours.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elles peuvent être effectuées simultanément dans un cadre non clinique, produisant ainsi du matériel de départ en deux jours pour une multitude d’applications en aval, y compris les analyses épigénétiques R-T-P-C-R et de cytométrie en flux de microréseaux. La démonstration de la procédure sera faite par Amy Weckl, ma directrice de laboratoire, pour commencer le traitement des échantillons de sang total. Assurez-vous que les tampons, la centrifugeuse et le bloc de chaleur ont tous été préparés.

Documentez l’heure de la livraison du vacutainer sur la feuille de suivi de l’échantillon. Après réception des échantillons, documentez l’isolement sérique. L’heure de démarrage sur le journal de bord de l’échantillon commence immédiatement le traitement en centrifugeant le vacutainer de sérum de sept millilitres avec le frein et l’accélération désactivés.

Utilisation d’un rotor à godets oscillants avec des bouchons d’aérosol pendant 20 minutes à 1300 GS quatre degrés Celsius pendant que le vacutainer sérique est en cours de centrifugation. Documentez l’heure de début de l’isolement de l’ADN dans une hotte de culture à deux cellules BSL. Retournez cinq fois les récipients de vide contenant le gel de fial et ajoutez 200 microlitres de sang total du haut de l’un des vacutainer dans chacune des deux aliquotes de 20 microlitres de protéase.

Laissez les tubes de protéase et de micro-centrifugeuse de sang dans le capot et poursuivez jusqu’à la centrifugation de l’appel contenant des récipients de vacu. Avant la centrifugation. Documentez l’heure de début de l’isolement PBMC, qui doit être dans les deux heures suivant la prise de sang.

Inversez huit à 10 fois l’appel FI contenant des récipients de vacu déjà dans les contenants étanches aux aérosols. Ensuite, centrifugez le vacutainer avec la pause et l’accélération désactivées pendant 30 minutes à 1600 Gs 22 degrés Celsius. Retournez aux échantillons d’isolement d’ADN dans le capot et ajoutez 200 microlitres de tampon al à chacun des tubes de protéase et de micro-centrifugeuse de sang.

Bouchez les tubes et retirez-les de la hotte. Ensuite, faites-les vortex pendant 15 secondes. Après le tourbillon immédiatement flash, faites tourner les échantillons.

Procédez à l’isolement de l’ADN comme décrit dans le protocole de texte ci-joint jusqu’à ce que l’ADN soit mentionné dans la colonne sur Ellucian. Regroupement de l’ADN des deux colonnes par participant pour un rendement total de 800 microlitres par participant. Documentez l’heure de début de l’isolement de l’ARN leucocytaire.

Percez le septum en caoutchouc du vacutainer K two EDTA avec une pointe de transfert. Conservez la gaine et le capuchon à vis pour une utilisation ultérieure après l’assemblage du système de tubes K two EDTA. À l’aide de l’extrémité d’une spatule métallique, dégonflez l’aiguille en toute sécurité et insérez-la dans un tube de prélèvement sanguin vide de 10 millilitres sous vide.

Inversez l’ensemble du tube récepteur du filtre vacutainer K two EDTA pour terminer la configuration Après la filtration et le lavage A PBS, prélevez trois millilitres de l’agent stabilisant de l’ARN à l’aide d’une nouvelle seringue de 10 millilitres. Rincez le filtre en vous assurant que l’agent stabilisant de l’ARN reste attaché. Détachez ensuite la seringue du filtre sans rétracter le piston.

Scellez l’entrée et la sortie du filtre avec la gaine et le capuchon à vis retenus de la pointe de transfert et laissez le filtre saturé d’agent stabilisant de l’ARN. Conservez le filtre à moins 80 degrés Celsius pendant au moins deux heures jusqu’à ce que le temps le permette pour terminer l’isolation RA. Une fois que le vacutainer est ramené dans le capot BSL deux, retirez le bouchon et utilisez une pipette sérologique pour prélever 1,5 millilitres de la couche supérieure de plasma sans vous approcher de la couche mononucléaire.

Transférez le plasma des deux vacutainers dans un flacon cryogénique de cinq millilitres. Enregistrez ensuite le volume collecté. Transférez le plasma restant et la couche mononucléaire à l’aide d’une pipette sérologique dans un tube conique de 15 millilitres.

Ajoutez ensuite suffisamment de XPBS préalablement préparé pour porter le volume total dans le tube conique jusqu’à 15 millilitres. Fermez le tube et retournez-le cinq fois. Ensuite, centrifugez le tube avec la pause et l’accélération désactivées pendant 15 minutes à 300 GS 22 degrés Celsius.

Retournez dans le flacon contenant des récipients de vide dans la hotte et récupérez les globules rouges ou les globules rouges. Utilisez une pipette de cinq pouces et trois quarts de pouce pour faire tourbillonner et détacher l’extérieur de la couche de gel de feu et retirez-la. À l’aide d’une pipette sérologique, recueillir les globules rouges et les transférer dans un flacon cryogénique de cinq millilitres.

Enregistrez ensuite le volume. Ensuite, transférez les flacons de plasma et de cryogénisation des globules rouges dans un récipient de congélation à taux contrôlé et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Après 24 heures, transférez les échantillons dans une boîte cryogénique et ramenez-les à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Lorsque la centrifugation est terminée, retournez le tube conique dans la hotte et aspirez le liquide, laissant 500 microlitres de PBS sans perturber le granulé. Ajoutez un XPBS pour porter le volume à 10 millilitres et remettez le granulé en suspension. Fermez doucement le tube et retournez-le cinq fois.

Ensuite, centrifugez l’échantillon avec le frein et l’accélération désactivée pendant 10 minutes à 300 GS 22 degrés Celsius. Après la centrifugation, aliquote la couche supérieure de sérum du vacutainer dans des flacons cryogéniques de deux millilitres et documentez le volume. Utilisez quatre flacons cryogéniques et aliquote 200 microlitres dans le flacon cryogénique.

Un 1000 microlitres dans un flacon cryogénique deux. Divisez ensuite le volume restant dans des flacons cryogéniques trois et quatre. Transférez les flacons cryogéniques dans une boîte cryogénique et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Et documentez l’heure de démarrage du congélateur. Poursuivez avec l’isolation PBMC. En ramenant les échantillons dans la hotte après la centrifugation, aspirez autant de surnageant que possible sans perturber la pastille.

Nous suspendons le granulé dans 2,5 millilitres de PBMC. Moyen. Ajouter 2,5 millilitres de PBMC, en congelant le deuxième milieu contenant du DMSO et du RPMI.

Moyennez à la solution cellulaire préalablement préparée, et tourbillonnez doucement l’échantillon. Ensuite, aliquote 10 microlitres de la solution cellulaire dans un micro tube à centrifuger. Ajoutez 10 microlitres de colorant bleu à 0,4 % dans le tube de micro-centrifugeuse et mélangez la solution en pipetant plusieurs fois.

Ensuite, pipetez 10 microlitres du mélange dans une chambre de comptage de cellules. Faites glisser et placez la lame dans le compteur de la cellule dans les trois minutes suivant le mélange. Zoomez et concentrez-vous sur les cellules.

Sélectionnez ensuite compter les cellules pour obtenir A-P-B-M-C Count. Si le nombre de PBMC viable est supérieur à 3 millions de cellules par millilitre, aliquote l’échantillon dans un maximum de cinq flacons cryogéniques à une concentration d’au moins 3 millions de cellules par millilitre. Chacun documente le nombre de cellules par flacon cryogénique sur le registre des échantillons.

Voir le protocole texte ci-joint pour savoir comment procéder si le nombre PBMC viable est inférieur à 3 millions de cellules par millilitre. Enfin, transférez les flacons cryogéniques dans un récipient de congélation à taux contrôlé et placez-les à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Après 24 heures, transférez les flacons cryogéniques dans une boîte cryogénique et placez la boîte dans la phase vapeur d’un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.

Consignez l’heure de démarrage du congélateur sur le registre des échantillons. Les méthodes d’isolement et de traitement du filtre de l’ARN leucocytaire ont donné cette image de gel résultant de l’électrophorèse capillaire. Deux bandes distinctes ont été produites avec une dégradation minimale représentant l’ATT s et l’ARN ribosomique 28 s.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il est essentiel de tenir des registres précis. Nous vous recommandons de développer une base de données pour stocker toutes les informations sur le flacon cryogénique, y compris le volume, la concentration, la qualité, le code-barres et le lieu de stockage dès le départ. Et d’autres recommandations sur l’organisation des échantillons peuvent être trouvées dans le protocole textuel.