Génération de vecteurs plasmidiques exprimant des protéines de marquage Flag En vertu du règlement de l'allongement Human Factor-1α promoteur Utilisation Assemblée Gibson

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’approche d’assemblage de Gibson pour créer de grandes constructions d’ADN complexes qui combinent des segments courts et longs provenant de plusieurs sources d’ADN différentes. Tout d’abord, concevez par calcul la séquence nucléotidique complète des plasmides, puis concevez des ensembles d’amorces qui se chevauchent. Ensuite, les matrices d’ADN pour la réaction d’assemblage sont amplifiées par PCR.

Ensuite, une purification des produits PCR est effectuée. La dernière étape est l’assemblage, la réaction, la transformation des plasmides résultants et la vérification des clones de plasmides. En fin de compte, la réaction d’assemblage de Gibson est utilisée pour développer dans des plasmides parallèles qui contiennent des versions marquées au drapeau du type sauvage et des protéines mutantes CSTF 64 sous la régulation transcriptionnelle du facteur d’élongation humain un promoteur alpha.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le Corning d’ADN traditionnel, est qu’elle peut créer en parallèle, de conception similaire, de type sauvage et des plasmides mutants sans étapes de Corning séquentielles. Concevez une séquence nucléotidique continue pour représenter le plasmide final. Énumérez maintenant les plasmides et les fragments d’ADN réels qui seront utilisés comme modèles dans la PCR, commandez les fragments d’ADN qui ne sont pas facilement disponibles, tels que différentes combinaisons de marqueurs et de promoteurs sous forme de fragments d’ADN double brin synthétiques simples ou multiples.

Ensuite, divisez la séquence nucléotidique continue de la construction finale en fragments d’ADN adaptés à la PCR. Vérifiez que les fragments correspondent aux plasmides disponibles et aux fragments d’ADN synthétique. Évitez les fragments d’ADN inférieurs à 200 nucléotides.

Ensuite, pour accéder à l’outil de génération d’amorces, sélectionnez le menu des préférences dans la fenêtre contextuelle de modification des paramètres d’assemblage Gibson. Sélectionnez l’onglet Modifier le prés, puis le menu de construction pour insérer les fragments d’ADN divisés dans l’outil de génération d’amorces de manière séquentielle, de l’extrémité cinq premières à l’extrémité trois premières. Ouvrez la fenêtre d’entrée de vecteur ou d’insertion de fragment, collez le premier fragment d’ADN représentant les cinq extrémités premières de l’ADN du vecteur au format A rapide et nommez ce fragment d’ADN.

Choisissez la méthode appropriée pour obtenir le fragment d’ADN. Cliquez ensuite sur l’onglet continuer. S’il est nécessaire d’ajouter des nucléotides supplémentaires ou des sites de restriction à la jonction de la construction finale, ouvrez l’ajout et insérez le fragment dans la fenêtre d’assemblage dans les zones d’espacement de l’amorce avant ou arrière.

Entrez les nucléotides supplémentaires ou les sites de restriction à un seul des fragments d’ADN. Cliquez ensuite sur l’onglet terminé. Répétez l’opération pour tous les fragments jusqu’à ce que la construction soit terminée.

Sélectionnez le menu Affichage des amorces et passez en revue les séquences d’amorces. Répétez également l’opération pour toutes les constructions, les vecteurs, les squelettes et les inserts ou pour les fragments d’ADN différents. Diluez les amorces de PCR à 10 micromolaires dans de l’eau ou un tampon.

Diluez ensuite tous les modèles d’ADN et les ADN synthétiques simple brin pour les PCR à un nanogramme par microlitre dans l’eau. Assemblez les réactions de PCR à température ambiante en combinant 2,5 microlitres de 10 micromolaires de chaque amorce. Un microlitre de la matrice d’un nanogramme par microlitre fragment d’ADN 25 microlitres de chaud.

Commencez la relecture de l’ADN polymérase et de 19 microlitres d’eau. Mélangez le tube en effleurant doucement et récupérez les gouttelettes de liquide par une brève centrifugation. Amplifier simultanément dans des tubes séparés, les fragments d’ADN de taille similaire selon les recommandations pour l’ADN polymérase utilisée.

Effectuez 25 à 28 cycles de PCR ou déterminez le nombre de cycles qui produisent un rendement suffisant en ADN. Résoudre cinq microlitres de PCR à l’aide de l’électrophorèse sur gel AROS standard. Vérifiez qu’une seule bande d’ADN représentant le produit de PCR est visible.

Déterminez la taille et la quantité relative des fragments d’ADN à l’aide des étalons de poids moléculaire de l’ADN si nécessaire, répétez la PCR pour obtenir une quantité suffisante de fragments d’ADN. Transférez les PCR prédigérées avec DPN un dans des tubes de 1,5 millilitre et ajoutez 81 microlitres de perles magnétiques de purification de l’ADN dans chaque tube. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes.

Placez les tubes sur le collecteur magnétique pendant deux minutes. Maintenant, jetez le liquide clair. Laver deux fois avec 200 microlitres d’éthanol à 80 % pendant 30 secondes.

Ensuite, remettez en suspension les billes séchées dans 10 microlitres de chlorhydrate de tris millimolaires pH 8,0 Après deux minutes, tournez brièvement puis positionnez les tubes sur le collecteur magnétique pendant deux minutes. Retirez 8,5 à 10 microlitres de la solution claire et placez-la dans un nouveau tube pré-étiqueté. Déterminer la concentration des fragments d’ADN par spectroscopie UV.

Utilisez au moins 100 nanogrammes de fragment d’ADN représentant le squelette du vecteur ou le fragment d’ADN portant le marqueur sélectif. Calculez le triple de l’excès molaire pour les fragments d’ADN qui seront utilisés comme inserts. Mélangez les quantités calculées de fragments d’ADN dans un tube PCR.

Ajustez ensuite le volume à 10 microlitres. Ajoutez 10 microlitres du mélange maître d’assemblage Gibson. Incuber la réaction à 50 degrés Celsius dans un thermocycleur PCR.

Procédez à la transformation de l’assemblage du produit incompétent e coli, ou congelez les produits à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire. Suivez la procédure de transformation qui accompagne les cellules chimiques ou électrocompétentes. Utilisez généralement deux microlitres de la réaction d’assemblage par réaction de transformation.

Enfin, confirmez le succès du clonage de l’ADN par séquençage de l’ADN à l’aide d’amorces spécifiques ou standard. Analysez les données de séquençage pour en vérifier la précision. Cette expérience a été conçue pour cloner la protéine 64 du facteur de stimulation de clivage et également la mutante CSTF 64.

Les protéines ont fusionné à une étiquette à trois drapeaux x sous la régulation expressionnelle du promoteur alpha HE F1. Nous n’disposions pas d’un plasmide contenant HE F1 alpha suivi d’une étiquette à trois drapeaux. Cependant, les plasmides suivants étaient disponibles.

PC DNA 3.1 M siffle HF un plasmide alpha contenant et plasmides CSTF 64 de souris. La séquence entière de la construction a été assemblée à l’aide des applications d’édition de nucléotides et de texte. Par la suite, la séquence a été divisée en quatre morceaux pratiques correspondant aux ADN plasmidiques disponibles.

Les quatre fragments d’ADN pour les réactions d’assemblage ont été amplifiés par PCR. Les plasmides résultants de clones individuels ont été amplifiés et analysés par digestion enzymatique de restriction pour un assemblage correct dans le vecteur d’ADN pc. Une fois maîtrisé la technique d’assemblage, y compris la conception du plasmide et de l’ADN primaire, la vérification ultérieure de la PCR et de la communication peut être effectuée dans les cinq jours, à l’exclusion du temps de synthèse et d’administration de l’ADN primaire et synthétique.