Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones

L’objectif général de cette procédure est d’analyser l’expression d’antigènes de surface et intracellulaires sur les cellules neurales à l’aide de la cytométrie en flux. Pour ce faire, il faut d’abord prélever des cellules neurales dans des cultures in vitro ou dans des tissus neuronaux primaires. Ensuite, une coloration intracellulaire non spécifique facultative est appliquée sur les cellules.

Ensuite, les antigènes de surface souhaités sont immédiatement marqués avec un anticorps primaire, tandis que les antigènes intracellulaires souhaités sont marqués après fixation cellulaire et perméation. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus en utilisant l’analyse cytométrique en flux pour la co-expression des antigènes de surface sur des sous-populations neurales spécifiques d’intérêt, telles que définies par le marquage intracellulaire. Ce protocole montrera comment préparer des cellules neurales dérivées de cultures tissulaires pour l’interrogation d’antigènes de surface et intracellulaires avec une cytométrie en flux multicolore.

Pour commencer, récoltez les cellules neurales adhérentes cultivées dans des flacons T 75 en lavant d’abord doucement les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS sans magnésium et calcium à température ambiante. Ensuite, détachez les cellules du ballon en ajoutant trois millilitres de trypsine de remplacement et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Éteignez la digestion enzymatique en ajoutant six millilitres de tampon d’écoulement après avoir détaché les amas cellulaires en pipetant la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois, transférez toute la suspension cellulaire dans un tube frais de 15 millilitres pour isoler les cellules.

Placez le tube dans une centrifugeuse, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le snat en vue du marquage intracellulaire du colorant. Mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule avec cinq millilitres de PBS plus 0,1 % BSA. Sinon, ajoutez cinq millilitres de tampon d’écoulement en conjonction avec le protocole standard de coloration au bleu de trian.

Utilisez un hémocytomètre pour estimer le nombre efficace de cellules viables. Réajustez la concentration cellulaire de la suspension existante à 1 million de cellules viables par millilitre avec le même tampon que celui utilisé à l’étape précédente. Ces cellules sont maintenant prêtes pour deux options de coloration, une coloration d’anticorps antigéniques de surface ou une coloration intracellulaire fluorescente facultative avec de la carboxy-fluorescéine suivie de la coloration d’antigène de surface susmentionnée.

Pour effectuer une étape de marquage intracellulaire avec le colorant ester de carboxy-fluorescéine FIN, ajoutez d’abord 10 microlitres de solution mère CFSE. Pour chaque millilitre de suspension cellulaire, placez le tube sur un agitateur à 200 tr/min et incubez le mélange pendant cinq minutes. À température ambiante, évitez le photoblanchiment en protégeant le tube de l’exposition directe à la lumière.

Trempez tous les colorants non réactifs en ajoutant cinq volumes de sérum contenant un tampon d’écoulement et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, faites tourner les cellules pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à température ambiante et aspirez le surnageant pour éliminer les traces résiduelles de colorants non réactifs. Lavez la pastille cellulaire en la suspendant avec cinq volumes de tampon d’écoulement.

Les cellules sont ensuite essorées une fois de plus dans une centrifugeuse à température ambiante pendant cinq minutes avant de jeter le SUP natant. Enfin, mettez en suspension la pastille cellulaire avec un tampon d’écoulement de sorte que la concentration finale de la cellule soit de 1 million de cellules viables par millilitre. Dans le cas d’une expérience multiplexée, ajouter un nombre égal de cellules d’intérêt non colorées provenant d’une condition expérimentale différente à la suspension de cellules colorées CFSC.

Les cellules sont maintenant prêtes pour le marquage de l’antigène de surface avec des anticorps afin de commencer la coloration de la surface cellulaire. Transférez 100 microlitres de suspension cellulaire avec ou sans étiquettes CFSC dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ajoutez des anticorps conjugués fluor quatre à la suspension cellulaire à une quantité préalablement déterminée par des tests de titrage d’anticorps.

Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 100 tr/min et incubez le mélange pendant 30 minutes. En l’absence de lumière, diluez le mélange d’anticorps en ajoutant un millilitre de tampon d’écoulement. Pipetez doucement de haut en bas pour mélanger et faites tourner les cellules dans une micro-centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes.

Aspirez le supinat pour éliminer les anticorps non liés et répétez cette centrifugeuse de lavage et cette aspiration. Étape une fois de plus. Reus suspend la pastille cellulaire dans 100 microlitres un tampon d’écoulement aux cellules préalablement colorées.

Ajoutez 500 microlitres de tampon de fixation à 100 microlitres de suspension cellulaire. Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 100 tr/min et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Le formaldéhyde réticulera toutes les espèces de protéines et d’ADN qui sont à proximité les unes des autres et produira des suspensions cellulaires non viables.

Diluez le mélange de fixation en ajoutant un millilitre de PBS et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, faites tourner les cellules fixes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Aspirez le supinate de manière à ce qu’il reste 100 microlitres de liquide au-dessus de la pastille cellulaire pour perméer la membrane cellulaire en vue d’un marquage ultérieur de l’antigène intracellulaire.

Ajoutez 500 microlitres de tampon de perméation à 100 microlitres de suspension cellulaire. Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 100 tr/min et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Diluez le mélange de perméation en ajoutant un millilitre de PBS, pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et faites tourner les cellules fixes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Aspirez complètement le SUP natant avant l’incubation. Préparez une substance de travail primaire pour anticorps en diluant l’anticorps dans un tampon PBS plus 0,5 % entre 20 %. Celui-ci est en outre enrichi avec 1 % de sérum d’ânesse, 10 % de sérum d’âne ou 10 % de sérum de chèvre.

Ensuite, mettez en suspension la pastille de cellules perméables à la membrane avec 100 microlitres de la matière première de l’anticorps. Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 200 tr/min et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité. Diluez le mélange d’anticorps primaires en ajoutant un millilitre de tampon d’écoulement.

Pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et faire tourner les cellules dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Aspirez complètement le supinate pour éliminer les anticorps non liés. Ensuite, mettez le granulé en suspension avec 100 microlitres de la matière première de travail de l’anticorps secondaire.

Répétez l’incubation à température ambiante protégée de la lumière pendant 30 minutes. Dans le même agitateur, diluez le mélange d’anticorps secondaires en ajoutant un millilitre de tampon d’écoulement. Répétez la même inversion du tube, le mélange, le spin down et l’élimination du surnageant pour éliminer tous les anticorps non liés.

Répétez les mêmes étapes de centrifugation de lavage d’un millilitre et d’élimination du surnageant deux fois de plus, mais avec du PBS frais comme tampon de lavage. Au lieu de cela, le résultat final sera une pastille de cellules propres marquée soit avec des anticorps fluorescents ciblés extracellulaires ou intracellulaires CFSC, soit avec n’importe quelle combinaison des trois en suspension, la pastille cellulaire marquée dans 150 microlitres de tampon de flux. Transférez la suspension cellulaire dans le cytomètre en flux et commencez l’analyse avec les paramètres de filtre d’excitation et d’émission laser appropriés pour chaque étage de quatre.

À l’aide des données de diffusion directe et latérale comme guide, configurez la diffusion initiale vers l’avant ou la diffusion latérale dans le logiciel d’analyse de cytométrie en flux afin d’exclure les points de données non spécifiques tels que les débris cellulaires et les cellules mortes. Ensuite, en utilisant les données brutes d’une suspension cellulaire non colorée comme contrôle négatif, configurez plusieurs portes d’intégration fluorescente qui sélectionnent les signaux d’émission positifs des marqueurs d’antigène extracellulaires et intracellulaires pour tenir compte de la fluorescence de fond du multicolore. Les effets de chevauchement spectral réajustent les portes fluorescentes à l’aide de données brutes provenant de témoins uniques colorés par anticorps.

Dans une expérience de télécopie multiplexée, les marqueurs de carboxy-fluorescéine peuvent être utilisés comme signal de base qui pourrait faire la distinction entre les cellules de deux lignées différentes ou de conditions expérimentales sans l’utilisation d’un anticorps. Par exemple, dans une suspension cellulaire hétérogène, on peut immédiatement différencier les cellules neurales marquées avec CFSC des fibroblastes non marqués simplement en regardant la présence ou l’absence de fluorescence dans le canal vert. De plus, en conjonction avec le marquage CFSE Ether, on peut utiliser des anticorps fluorescents de différentes couleurs pour déterminer l’expression différentielle des antigènes de surface entre les sous-ensembles marqués au CFSE et ceux non marqués au sein d’un échantillon mixte.

Par exemple, les cellules de neuroblastome SHSY cinq Y marquées avec CFSE dans le canal de fluorescence vert, ont co-exprimé des niveaux élevés d’antigène de surface CD 24, mais pas du marqueur fibroblaste CD 54. En revanche, les fibroblastes BJ CFSC négatifs sont positifs pour le CD 54 avec des niveaux plus faibles de CD 24. L’analyse des antigènes de surface neurale peut également être effectuée en conjonction avec la détection d’antigènes intracellulaires basée sur les anticorps.

L’inclusion d’échantillons non colorés et de témoins monocolorés pour les antigènes de surface et les antigènes intracellulaires est essentielle comme alternative au marquage par anticorps primaires et secondaires des antigènes intracellulaires, comme la carte des marqueurs neuronaux deux illustrée ici. Le marquage fluorescent non covalent de l’anticorps primaire peut donner des résultats comparables dans l’analyse de co-expression et raccourcit le protocole. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les cellules neurales pour l’analyse cytométrique en flux de base à l’aide de diverses approches de marquage alternatives et de combinaisons de celles-ci.