Name: Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Apprenez la cytométrie en flux pour analyser les antigènes de surface et intracellulaires dans les cellules neuronales. Cette méthode permet d'étudier les sous-populations neuronales spécifiques et leurs états fonctionnels.

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Notre programme de recherche est financé par le programme Emmy Noether de la Fondation allemande pour la recherche (DFG), subvention PR1132/3-1. La Fondation Müller-Fahnenberg de l’Université de Fribourg pour son soutien supplémentaire est vivement appréciée. Cette étude a été financée en partie par l’initiative d’excellence de la Fondation allemande pour la recherche (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Neural cellulaire récolte <ol><li> Évaluation au microscope: <ol><li> Avant d&#39;entreprendre une expérience, vérifier l&#39;état de la culture avec champ lumineux ou microscopie à contraste de phase. REMARQUE: Bien que le tissu neural primaire obtenu à partir dissections est, en principe, également ouvertes à couler analyse cytométrique 14,28, se il vous plaît noter que l&#39;accent mis par le protocole est sur ​​les cellules obtenues à partir de systèmes de cellules neurales in vitro. </li></ol></li><li> La récolte des cellules 7: <ol><li> Lavez délicatement le plat / flacon de cellules adhérentes avec Mg 2+ / Ca 2+ libre phosphate salin (PBS) à température ambiante (par exemple, 5 ml pour flacon T75, 3 ml par puits pour plaque de 6 puits, ou 10 ml boîte de 10 cm). NOTE: Le PBS utilisé dans le protocole est Mg 2+ / Ca 2+ libre. <ol><li> Pour l&#39;exemple vidéo, utiliser un flacon T75 de cellules de neuroblastome SH-SY5Y à 80% de confluence. Appliquer étapes de lavage supplémentaires dans les cas oùconsidérable débris est présent dans la coupelle. </li><li> Considérons lavages avec du sérum, Percoll, Ficoll ou 49 gradients de centrifugation 48 PBS contenant de l&#39;albumine et / ou des billes disponibles dans le commerce 50,51. L&#39;élimination de la myéline et d&#39;autres lipides ou autres impuretés est essentiel, en particulier lorsque les sources de tissus adultes primaires sont utilisés. </li></ol></li><li> Ajouter préchauffé (37 ° C) remplacement de la trypsine à un volume approprié qui recouvre toute la surface du récipient de culture de tissus. NOTE: Vous pouvez également envisager de Accutase ou d&#39;autres options de digestion enzymatique. Cette étape critique peut affecter négativement l&#39;expression de l&#39;épitope de surface (voir 7). </li><li> Incuber le plat / fiole à 37 ° C pendant 2-5 min (selon le type cellulaire) pour permettre aux cellules de se détacher. Tapoter doucement le récipient de culture de tissu ou de niveau avec une pipette sérologique pour déloger les cellules. Évitez de trop digestion (car cela peut causer la perte de cellules et la coagulation à des stades ultérieurs). </li><li> Quench le remplacement de la trypsine en ajoutant deux fois le volume de tampon d&#39;écoulement (2% de FBS dans du PBS) et recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Triturer doucement la suspension de cellules en utilisant une pipette microlitres (100 - 1 000 pi) ou une pipette sérologique de 5 ml pour préparer une suspension cellulaire unique. </li><li> Centrifuger les cellules à 220 xg pendant 5 min à 25 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant laissant le culot derrière. </li><li> Remettre en suspension le culot dans un volume approprié de tampon d&#39;écoulement, en fonction de la taille de la pastille (par exemple, pour une confluence flacon T75 de cellules SH-SY5Y le rendement typique est d&#39;au moins 10 x 10 6 cellules, dans ce cas, les cellules sont remis en suspension dans 5 ml de tampon de flux). NOTE: Si plus gros morceaux ou coagulation sont observées, filtrer à travers un 30 - 100 um mesh. </li></ol></li><li> Le comptage des cellules 52: <ol><li> Transférer une petite portion aliquote de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation et diluer à un rapport défini dans un volume de trypan bleu ou un colorant viabilité alternatif avant le transfert à un hémocytomètre automatique ou système de comptage de cellules. </li><li> Diluer la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 10 6 cellules viables / ml en ajoutant le volume approprié de tampon d&#39;écoulement ou du PBS avec 0,1% de BSA (si le traitement de l&#39;étiquetage des CFSE). NOTE: L&#39;iodure de propidium, 7 D-aminoactinomycine, annexine V et kits de dosage de viabilité corrigeables disponibles dans le commerce représentent d&#39;autres options afin d&#39;évaluer la viabilité des cellules. En outre, des dosages d&#39;apoptose en utilisant la caspase-3 fluorescence comme décrit précédemment 53 peuvent être utilisés. Canaux fluorescents seront &quot;occupés&quot; par ces réactifs qui peuvent limiter les options pour les étapes suivantes si inclus dans tous les échantillons. </li></ol></li></ol> 2. intracellulaire Dye étiquetage Utilisation CFSE (Figure 3) <ol><li> Diluer le CFSE à une concentration de stock souhaité qui peut être facilement utilisé. NOTE: Pour ces expériences, une concentration de l&#39;action de0,01 mM a été utilisé. Déterminer la concentration de travail optimal de CFSE empiriquement. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;une solution 0,01 mM de CFSE par ml de cellules (section 1.3.2, la concentration de 1 x 10 6 cellules / ml dans du PBS + BSA à 0,1%) pour une concentration finale de 0,1 uM. Brièvement vortex pour bien mélanger. REMARQUE: concentrations CFSE utilisés ici sont environ dix fois plus faible que celles couramment appliquées dans les essais de prolifération, d&#39;où la toxicité cellulaire du colorant est minime. Nous ne observons pas d&#39;effets négatifs sur la viabilité des cellules. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante avec une agitation constante (200 rpm). Protéger de la lumière. </li><li> Stopper la teinture en ajoutant 5 volumes de tampon d&#39;écoulement dans les tubes. Centrifuger à 94 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant laissant le culot derrière. Remettre en suspension les cellules avec 5 volumes de tampon d&#39;écoulement. </li><li> Centrifuger à 94 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du tampon de flux à une concentration de 1 x 10 6 cellules /<html> ml. </li><li> Ajouter un nombre égal de cellules non colorées présentant un intérêt pour la suspension de cellules colorées. Procéder à la surface protocole de coloration antigène (section 3). </li></ol><img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3. Détection de l&#39;expression différentielle de l&#39;antigène de surface de CD entre deux lignées cellulaires par l&#39;intermédiaire de cellules SH-SY5Y de neuroblastome CFSE colorant étiquetage. Sont pré-marquées avec CFSE pour identification ultérieure par rapport à des fibroblastes BJ non marqués. Co-coloration de l&#39;échantillon mélangé (panneaux de droite) avec des marqueurs de surface CD24 ou CD54 (à la fois conjugué à APC) démontre que les lignées cellulaires sont facilement distinguables à cause de la coloration CFSE (flèches = SH-SY5Y, des pointes de flèches = fibroblastes BJ). La majorité des cellules SH-SY5Y expriment CD24 mais pas CD54 (ICAM-1). En revanche, les fibroblastes BJ (CFSE-négatif) sont positives pour CD54 mais largement négatif pour CD24.Cible &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 3. coloration de surface cellulaire <ol><li> tubes d&#39;étiquetage y compris les échantillons et les contrôles critiques (voir le tableau 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tube pas. </td><td> Nom Sample </td><td> Antigen-fluorophore </td><td> Dilution </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Cellules non colorées </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Teinté Simple </td><td> CD24-APC </td><td> 01h50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Teinté Simple </td><td> TUJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Double teinté </td><td> CD24-APC </td><td> 01h50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> TUJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Teinté Simple</td><td> Secondaire seulement: Alexa fluor 488 nm </td><td> 1: 2000 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. L ist de tubes à inclure dans un flux typique cytométrie expérience. Le tableau montre un ensemble minimal de tubes d&#39;échantillon requis pour une expérience de co-coloration décrit dans cet article vidéo. Une expérience idéale doit inclure tous les contrôles nécessaires (contrôles négatifs, positifs de compensation ainsi que) pour l&#39;interprétation précise des résultats obtenus. <ol start="2"><li> Ajouter 100 pi de suspension cellulaire (de la section 2.7 ou 1.3.2) à chaque tube de 1,5 ml. NOTE: Assurez-vous un minimum de 0,1 x 10 6 cellules sont présents pour 100 ul de suspension cellulaire. </li><li> Ajouter fluorophore conjugué anticorps à l&#39;échantillon à une dilution appropriée. NOTE: Déterminer la dilution de travail pour chaque anticorps avant l&#39;expérience. Voir le tableau 2 pour une liste of antigènes de surface de neurones. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antigène </td><td> Type de cellule </td><td> Référence </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Les cellules souches neurales </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Cellules neuronales </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Les cellules souches neurales </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Les cellules gliales </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Les cellules souches neurales </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Cellules neuronales </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Les cellules souches neurales </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Les cellules souches neurales et les cellules gliales </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Cellules neuronales </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Les cellules souches de la crête neurale </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Les cellules gliales </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> précurseurs dopaminergiques </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Les cellules souches neurales (NSC) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Les cellules gliales </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Les cellules gliales </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Sélection des antigènes de surface de neurones. Ce tableau fournit une liste des épitopes de surface trouvés être exprimé par divers types de cellules neurales pour illustrer le panneau croissante des antigènes de surface utilisées pour caractériser la lignée de neurones. Notez que cette sélection est loin d&#39;être complète et que la plupart de ces marqueurs sont également exprimée par une série d&#39;autres cellules neurales et non neuronaux. Par conséquent, des combinaisons de plusieurs marqueurs seront nécessaires pour mieux définir et isoler les sous-ensembles de neurones indiqués. <ol start = &quot;4&quot;&gt; <li> Incuber pendant 30 min sur un agitateur orbital (200 tpm) dans l&#39;obscurité. </li><li> Flux lavage tampon <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon d&#39;écoulement dans les tubes. Centrifuger à 380 g pendant 4 min à 4 ° C. </li><li> Jeter le surnageant laissant le culot derrière. </li></ol></li><li> Répétez l&#39;étape de lavage. </li><li> Après le second lavage, décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du tampon de flux à un volume final de 100 ul. </li><li> Utilisation échantillon pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. Sinon, passez à la section 4 et 5. NOTE: Si les cellules doivent être triés et remis en culture post-FACS (c.-à-suspension de cellules viables sans fixation ou perméabilisation), appliquer les techniques d&#39;asepsie pendant la récolte, la coloration et étapes analytiques. </li></ol> 4. Fixation et perméabilisation 38 <ol><li> Fixation utilisant paraformaldéhyde (PFA): <ol><li> Préparer tampon de fixation contenant 2% de PFA dans du PBS. <br/&gt; NOTE: PFA est nocif pour les humains et l&#39;environnement. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié et jeter les déchets conformément à la réglementation locale. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de fixation à 100 ul de suspension cellulaire. </li><li> Incuber les tubes à température ambiante pendant 15 min sur un agitateur orbital (100 tpm) dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> PBS lavage: <ol><li> Ajouter 1 ml de PBS au tube. Centrifuger à 380 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Jeter / décanter le surnageant laissant environ 100 pi dans le tube. </li></ol></li><li> Perméabilisation avec du Tween-20: <ol><li> Préparer le tampon de perméabilisation contenant 0,7% de Tween-20 dans du PBS. </li><li> Ajouter 500 ul de tampon de perméabilisation à 100 ul de suspension cellulaire. </li><li> Incuber les tubes à température ambiante pendant 15 min sur un agitateur orbital (100 tpm) dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Laver les cellules une fois avec du PBS (comme décrit à la section 4.2) et retirer le surnageant de la tubes completely, laissant seulement derrière le culot. </li></ol> 5. Antigène coloration intracellulaire 38 (Figure 4) <ol><li> Préparation des solutions d&#39;anticorps primaires: <ol><li> Diluer les anticorps primaires dans du tampon de dilution contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin, 10% de sérum (par exemple sérum de chèvre d&#39;âne ou normal) et 0,5% de Tween-20 dans du PBS. REMARQUE: Choisissez le sérum doit être utilisé selon les espèces les anticorps secondaires ont été soulevées dans. </li><li> Vous pouvez également utiliser l&#39;étiquetage Zenon fluorescéine de l&#39;anticorps primaire selon les instructions du fabricant. <ol><li> Préparer 1 pg de l&#39;anticorps primaire dans du PBS à une dilution appropriée (volume total ≤ 20 ul). </li><li> Ajouter 5 ul de fluorescéine Zenon réactif de marquage IgG (le composant A) à la solution d&#39;anticorps. </li><li> Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 5 ul de réactif de blocage Zenon (composant B) au mélange de réaction. </li><li> Incuberle mélange pendant 5 min à température ambiante. Appliquer l&#39;anticorps à l&#39;échantillon dans les 30 min. </li></ol></li></ol></li><li> Coloration à l&#39;anticorps primaire: <ol><li> Ajouter 100 ul de la solution d&#39;anticorps primaire au culot cellulaire et triturer doucement pour mélanger. </li><li> En variante, ajouter un anticorps marqué à la fluorescéine Zenon à la suspension cellulaire à la dilution appropriée. </li><li> Incuber les tubes à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur orbital (200 tpm), à l&#39;abri de la lumière. Laver les cellules une fois avec du PBS (comme décrit à la section 4.2) et retirer le surnageant des tubes complètement, ne laissant que le culot derrière. </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps secondaire (non requis pour les anticorps marqués Zenon fluorescéine): <ol><li> Diluer les anticorps secondaires dans du PBS à une concentration appropriée. </li><li> Ajouter 100 ul de la solution d&#39;anticorps secondaire au culot cellulaire et triturer doucement pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur (200 rpm) dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Laver les échantillons deux fois avec du PBS (comme décrit à la section 4.2). </li><li> Laver une fois avec le tampon de flux (voir section 3.5). </li><li> Remettre en suspension les cellules dans environ 150 ul de tampon de flux et d&#39;analyser sur le cytomètre de flux. </li></ol><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Figure 4. Co-coloration de la surface et des protéines intracellulaires. Cytométrie en flux de données illustre une comparaison entre repose-anticorps primaire + secondaire par rapport coloration intracellulaire base-fluorescéine Zenon en combinaison avec une coloration de surface. Positivité exclusive sur l&#39;axe des y (quadrant supérieur gauche) et l&#39;axe des x (quadrant inférieur droit) montre des cellules colorées pour MAP2 et CD24, respectivement. Après co-coloration, MAP2 partagée et d&#39;expression CD24 peut être vu dans le quadrant supérieur droit (des panneaux de droite). Comparaison de l&#39;utilisation deAlexa fluor 488. (En haut; AF488) contre Zenon fluorescéine (en bas) pour les rendements MAP2-en matière d&#39;étiquetage des résultats similaires <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 6. Analyse par cytométrie en flux <ol><li> Effectuer une analyse par cytométrie en flux, immédiatement après l&#39;achèvement du protocole de coloration à l&#39;aide d&#39;un cytomètre en flux avec des filtres appropriés pour la détection de signaux. Utilisez 488 nm bleu et 640 nm laser rouge avec FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), et des filtres FL-4 (675/25) passe-bande. </li><li> Mettre en place des portes primaires basées sur la diffusion vers l&#39;avant et le côté excluant les débris et les cellules mortes. </li><li> Set portes de fluorescence pour la surface et l&#39;antigène intracellulaire ≤0.5% sur la base des échantillons non colorées et l&#39;indemnisation des chevauchement spectral utilisant des contrôles simples colorés. </li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Le protocole présenté ici est bien établie pour les cultures de cellules neurales dérivées de cellules souches humaines, mais peut être appliqué également à d&#39;autres sources de cellules neurales, y compris le tissu primaire ou des lignées de cellules neurales. En plus des sources embryonnaires, les cellules neuronales souches ou progénitrices peuvent être extraits à partir des régions neurogènes de cerveau adulte 27. En outre, la cytométrie en flux et FACS peuvent être exploitées à quantifier, analyser et...

La cytométrie en flux a été largement exploitée dans l&#39;immunologie, hématologie et en oncologie pour définir des populations de cellules via des propriétés intrinsèques de dispersion, l&#39;expression d&#39;antigènes de surface cellulaire, et d&#39;autres paramètres de fluorescence 3.1. Nos connaissances dans le sang le développement de la lignée et la maladie sont le résultat d&#39;un degré significatif de l&#39;amélioration continue de cette méthodologie après sa mise en œuvre initiale de 4,5. Sensibilisation accrue du potentiel analytique quantitative et globale de cytométrie en flux a récemment encouragé son utilisation plus répandue dans la recherche sur les cellules souches et peut permettre des progrès similaire profonde dans un délai plus court 6. Toutefois, l&#39;application de la cytométrie en flux pour analyser spécifiquement et isoler des populations de neurones a longtemps été considérée comme difficile. Contrairement aux cellules hématopoïétiques qui existent naturellement en suspension, des types de cellules neurales sont typiquement récoltées à partir de sources excessivement complexes qui peuvent comprendre des cellules gliales et divers outres cellules environnantes ainsi que d&#39;un réseau complexe de neurones de processus portant. Par conséquent, la neurobiologie a encore mis en œuvre la polyvalence de cytométrie de flux à son potentiel complet dans les routines quotidiennes de recherche. Toutefois, aussi longtemps que la suspension de cellules viables unique peut être générée (et protocoles ont été conçus et optimisés à cet effet 7), la cytométrie en flux et les cellules activé par fluorescence (FACS) peut être considéré comme un élément précieux du répertoire analytique en neurobiologie 8-11. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Figure 1. Principe de l&#39;analyse et de composants un cytomètre de flux cytométrie flux cytomètres de flux comprennent trois systèmes principaux: fluidiques, l&#39;optique et l&#39;électronique. Un écoulement laminaire de cellules en suspension (préparée à partir de tissu primaire ou en culture in vitro) est accomplie par la gaine de fluid via focalisation hydrodynamique, limitant l&#39;échantillon à son noyau central. Les éléments optiques sont constitués de lasers qui illuminent le flux de cellules et de filtres optiques qui dirigent le signal de détecteurs appropriés. Les signaux lumineux détectés sont convertis en signaux électroniques, ensuite traitées par un ordinateur et visualisées sur un moniteur pour l&#39;analyse des données et de déclenchement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Les utilisateurs de flux profit des méthodes de cytométrie d&#39;au moins une compréhension de base des fondamentaux sous-jacents, y compris les blocs de construction d&#39;un cytomètre (pour revue voir 12,13; voir aussi la figure 1). Un faisceau laser croise un flux fluide hydrodynamique concentré qui contient les cellules en suspension, qui à son tour passent par le faisceau laser dans &quot;fichier unique&quot; un après l&#39;autre. Le interceptisur une cellule (ou tout autre particule, d&#39;ailleurs) avec les résultats du laser dans la diffusion de la lumière à partir de ce point d&#39;interrogation. La lumière diffusée peut être détectée dans la direction de poursuite laser (diffusion vers l&#39;avant, associée à la taille de la particule), ainsi que perpendiculairement à sa direction (dispersion latérale; reflétant la granulosité de la particule / cellule). Ces propriétés de dispersion susmentionnés ne nécessitent pas de marquage spécifique, ce est pourquoi un échantillon non marqué (ou encore les débris cellulaires, des bulles d&#39;air, etc.) va générer un signal (événement) sur la bivariée diffusion vers l&#39;avant par rapport diagramme de dispersion latérale couramment utilisé pour déclenchement initial. En utilisant les lasers et des filtres spécifiques pour l&#39;excitation et l&#39;émission des spectres correspondant appropriées, une cellule peut être analysé pour déterminer sa positivité, le niveau d&#39;intensité, ou l&#39;absence de marqueurs fluorescents. La majorité des applications de cytométrie en flux ont porté sur la caractérisation par des antigènes de surface cellulaire. Contrairement à la LINEAG hématopoïétiquee, la lignée de neurones est resté moins largement définie selon les modèles 5 d&#39;expression de l&#39;épitope de surface. Un avantage de l&#39;exploitation des antigènes de surface est que les cellules vivantes peuvent être soumis à des paradigmes de tri cellulaire telles que FACS. En revanche, l&#39;antigène intracellulaire coloration nécessite fixation et perméabilisation étapes de médiation de l&#39;interaction épitope-anticorps, ce qui empêche les applications en aval qui nécessitent des cellules viables. Fait à noter, ces approches permettent encore de nombreux essais quantitatifs 14 ainsi que des analyses en aval pour l&#39;ARN et l&#39;expression des protéines 15. Hématologie, l&#39;immunologie et de l&#39;oncologie ont souvent utilisé plus d&#39;une douzaine de marqueurs en collaboration pour définir des sous-populations particulières 16. En outre, la cytométrie de masse CyTOF ou peuvent maintenant être utilisés pour analyser jusqu&#39;à 30 paramètres simultanément 17,18. Pour des applications de cellules souches neurales, ainsi que des cultures primaires 14,19,20 le hétérogénéité des cellules dansvitro est un phénomène commun 21-23. Les cellules qui ne représentent pas la population cible d&#39;intérêt incarnent un facteur potentiellement confusion pour la lecture expérimentale 24,25. Idéalement, les différents sous-ensembles cellulaires présentes dans une suspension de cellules hétérogène portent les profils d&#39;expression de l&#39;antigène distinctes (connus ou encore à déchiffrer), qui peuvent être utilisés pour définir ces différentes populations. La cytométrie en flux peut donc jouer un rôle crucial dans la résolution de l&#39;hétérogénéité cellulaire et, ainsi, faciliter les applications biomédicales (essais in vitro, thérapie cellulaire) et d&#39;optimiser la lecture quantitative en se concentrant sur ​​le sous-ensemble le plus pertinent 24,26. Diverses combinaisons d&#39;antigènes de surface ont été identifiés au cours des dernières années afin de permettre la quantification et l&#39;isolement de types spécifiques de cellules neurales. Cela comprend CD133 pour l&#39;enrichissement de cellules souches neurales 27, une combinaison du CD15 / CD24 / CD29 des antigènes de surface pour l&#39;isolement de NSC, differentiaTed neurone et les cellules de la crête neurale 28 ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 pour isoler des sous-ensembles de neurones et cellules gliales 25, entre autres signatures 29,30. Au-delà de neurones comprennent des marqueurs gliaux A2B5 31, 25 CD44, NG2 32 et 33 GLAST. Une publication récente a exploité le mésencéphale platelage précurseur marqueur CORIN 34,35 pour enrichir précurseurs dopaminergiques dans la maladie de Parkinson transplantation de cellules paradigmes 36. CD molécules ne sont pas seulement des marqueurs, mais fonctionnellement pertinents de médiateurs interactions cellule-cellule et de la capacité d&#39;une cellule à répondre à des signaux à partir de molécules de la matrice extracellulaire et des facteurs de croissance 37. Une stratégie de renforcer encore l&#39;arsenal des antigènes CD combinatoires pour caractériser le développement de la lignée neuronale est d&#39;utiliser des marqueurs intracellulaires connues pour cribler et définir des combinaisons d&#39;antigènes de CD pour un type cellulaire particulier d&#39;intérêt. Nous avons récemment exploité une telle approche et identifié CD49F - / CD200 des profils d&#39;expression combinatoires élevées que une nouvelle approche pour enrichir des sous-ensembles de neurones différenciés neuronale pluripotentes induites systèmes de culture de cellules souches 38. Ici, nous incluons et discutons ce dernier protocole (et des variations de ceux-ci en option), dans lequel une coloration de surface et une coloration intracellulaire peuvent être utilisés simultanément pour définir des sous-populations de cellules neurales par cytométrie de flux. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Figure 2. Schéma du options de protocole expérimental. La figure illustre une représentation schématique des principales étapes dans le protocole. Les étapes facultatives (CFSE de colorants d&#39;étiquetage ou d&#39;antigène intracellulaire) sont indiquées par des cadres gris clair. Après la récolte, il est indispensable pour évaluer la viabilité cellulaire et nombre de suspensions de cellules neurales avant la coloration de la surface cellulaire. Positifainsi que des contrôles négatifs doivent être inclus, en plus des échantillons d&#39;intérêt. Les échantillons peuvent être analysés par analyse de cytométrie en flux et / ou utilisés dans les paradigmes de triage des cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Bien que nous ayons précédemment utilisé anticorps primaire en combinaison avec un anticorps secondaire pour la coloration intracellulaire 38, nous introduisons maintenant étiquetage non covalente de l&#39;anticorps primaire par l&#39;intermédiaire de fragments Fab fluorescents (d&#39;étiquetage Zenon) comme une légère variation, ce qui réduit les étapes de manipulation de la cellule 39. En outre, comme un autre exemple de la polyvalence du protocole, nous employons un étiquetage facultatif d&#39;un sous-ensemble expérimentale par carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) avant l&#39;antigène de surface de coloration. Cette CFSE pré-étiquetage permet la comparaison directe immédiate de deux lignées cellulaires ou des conditions expérimentales (CFSE marqué vs. non marqué) dans un tube à échantillon unique, la réduction ou la variance des différences subtiles dans le temps d&#39;incubation et l&#39;enregistrement anticorps. CFSE est un colorant fluorescent mis en place qui est couramment utilisé pour le suivi de la cellule 40, dans la prolifération 41,42 43,44 expériences par code barre. Enfin, alors que des mesures réelles de tri (FACS, séparation immunomagnétique ou immunopanning) ne font pas partie de ce protocole, en principe, les procédures de récolte et d&#39;étiquetage décrites ici ne échantillons de rendement qui peuvent être soumis à la surface l&#39;antigène ou des applications intracellulaires base étiquetage-tri 15 25,28. Avec cet article, nous visons à: résumer une surface viable protocole antigène coloration 25,28, résumer un protocole pour la détection de cibles intracellulaires ainsi que la surface combinée et intracellulaire analyse de l&#39;antigène 38, présenter un CFSE étiquetage de teinture étape intracellulaire 41,45 comme un option expérimentale pour comcomparative analyse des populations de cellules neurales, et résumer les approches à l&#39;écoulement analyse cytométrique (des contrôles appropriés 13,46, ouverture de porte stratégie et la présentation des données 47).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (milieu de culture de Dulbecco modifié/E-12, mélange nutritif)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sans Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, qualifié, approuvé par l'UE, origine Amérique du Sud (FBS)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels MEM (100x)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan, 0,4 %</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA), fraction V</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Détergent Tween-20</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Esther succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE)</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Filtres à bouteille, express plus 0,22 &amp;micro;m, 250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Flacons traités pour culture cellulaire (T 25)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Flacons traités pour culture cellulaire (T 75)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques (15 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques (50 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur, en verre (150 mm)</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (0,1-10 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes serologiques, 5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes serologiques, 10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes serologiques, 25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges (0,5 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges (1,5 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges (2,0 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-CD24 humain APC</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>Dilution de travail 1:50</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-CD54 humain PE</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>Dilution de travail 1:50</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal Neuronal Class III &amp;beta;-Tubulin (Tuj1)</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>Dilution de travail 1:2 000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, anticorps secondaire anti-lapin provenant de l'âne</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>Dilution de travail 1:2 000</td></tr><tr><td>Kit de marquage Zenon&amp;reg; Fluorescein IgG de lapin</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage Neubauer améliorée</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Accuri C6</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse réfrigérée, PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital, Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée, Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique de classe II, Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Système sous vide, Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>Microscope, Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de pipette, accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>Pipette micrométrique, Pipetman neo P20N (2-20 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>Pipette micrométrique, Pipetman neo P200N (20-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Pipette micrométrique, Pipetman neo P1000N (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire antigen analyses des types cellulaires de neurones

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

La cytométrie en flux a été largement utilisée pour définir les populations cellulaires en immunologie, en hématologie et en oncologie. Nous fournissons ici une description détaillée des protocoles d’analyse cytométrique en flux du groupe d’antigènes de surface de différenciation (CD) et des antigènes intracellulaires dans les types de cellules neurales. Notre description étape par étape des procédures méthodologiques comprend : la récolte de cultures neurales in vitro, une étape facultative de marquage à l’ester de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFSE), suivie d’une coloration de l’antigène de surface avec des anticorps CD conjugués (par exemple, CD24, CD54), et la détection ultérieure de l’antigène intracave via des anticorps primaires/secondaires ou des fragments Fab marqués par fluorescence (marquage Zenon ). La vidéo montre les étapes les plus critiques. De plus, les principes de la planification expérimentale, l’inclusion de contrôles critiques et les principes fondamentaux de l’analyse cytométrique en flux (identification de la population cible et exclusion des débris, stratégie de contrôle, compensation du chevauchement spectral) sont brièvement expliqués afin de permettre aux neurobiologistes ayant des connaissances préalables limitées ou une formation spécifique en cytométrie en flux d’évaluer son utilité et de mieux exploiter cette méthodologie puissante.

Le protocole présenté ici permet d&#39;approches expérimentales polyvalent (figure 2). Dans sa version la plus courte (étapes 1, 3 et 6), il peut être considéré comme un guide pour les simples coloration des antigènes de surface. Dans sa forme la plus complexe, un certain nombre de paradigmes co-marquage avec une gamme d&#39;antigènes intracellulaires peut être poursuivi (étapes facultatives 2 et / ou 4-5). En outre, l&...

Nous fournissons une description détaillée d’un protocole d’analyse cytométrique en flux d’antigènes de surface et/ou d’antigènes intracellulaires dans les types de cellules neurales. Les aspects critiques de la planification expérimentale, les procédures méthodologiques étape par étape et les principes fondamentaux de la cytométrie en flux sont expliqués afin de permettre aux neurobiologistes d’exploiter cette technologie puissante.

Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

L’objectif général de cette procédure est d’analyser l’expression d’antigènes de surface et intracellulaires sur les cellules neurales à l’aide de la cytométrie en flux. Pour ce faire, il faut d’abord prélever des cellules neurales dans des cultures in vitro ou dans des tissus neuronaux primaires. Ensuite, une coloration intracellulaire non spécifique facultative est appliquée sur les cellules.Ensuite, les antigènes de surface souhaités sont immédiatement marqués avec un anticorps primaire, tandis que les antigènes intracellulaires souhaités sont marqués après fixation cellulaire et perméation. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus en utilisant l’analyse cytométrique en flux pour la co-expression des antigènes de surface sur des sous-populations neurales spécifiques d’intérêt, telles que définies par le marquage intracellulaire. Ce protocole montrera comment préparer des cellules neurales dérivées de cultures tissulaires pour l’interrogation d’antigènes de surface et intracellulaires avec une cytométrie en flux multicolore.Pour commencer, récoltez les cellules neurales adhérentes cultivées dans des flacons T 75 en lavant d’abord doucement les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS sans magnésium et calcium à température ambiante. Ensuite, détachez les cellules du ballon en ajoutant trois millilitres de trypsine de remplacement et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes. Éteignez la digestion enzymatique en ajoutant six millilitres de tampon d’écoulement après avoir détaché les amas cellulaires en pipetant la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois, transférez toute la suspension cellulaire dans un tube frais de 15 millilitres pour isoler les cellules.Placez le tube dans une centrifugeuse, faites tourner les cellules pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le snat en vue du marquage intracellulaire du colorant. Mettez à nouveau en suspension la pastille de cellule avec cinq millilitres de PBS plus 0,1 % BSA. Sinon, ajoutez cinq millilitres de tampon d’écoulement en conjonction avec le protocole standard de coloration au bleu de trian.Utilisez un hémocytomètre pour estimer le nombre efficace de cellules viables. Réajustez la concentration cellulaire de la suspension existante à 1 million de cellules viables par millilitre avec le même tampon que celui utilisé à l’étape précédente. Ces cellules sont maintenant prêtes pour deux options de coloration, une coloration d’anticorps antigéniques de surface ou une coloration intracellulaire fluorescente facultative avec de la carboxy-fluorescéine suivie de la coloration d’antigène de surface susmentionnée.Pour effectuer une étape de marquage intracellulaire avec le colorant ester de carboxy-fluorescéine FIN, ajoutez d’abord 10 microlitres de solution mère CFSE. Pour chaque millilitre de suspension cellulaire, placez le tube sur un agitateur à 200 tr/min et incubez le mélange pendant cinq minutes. À température ambiante, évitez le photoblanchiment en protégeant le tube de l’exposition directe à la lumière.Trempez tous les colorants non réactifs en ajoutant cinq volumes de sérum contenant un tampon d’écoulement et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, faites tourner les cellules pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à température ambiante et aspirez le surnageant pour éliminer les traces résiduelles de colorants non réactifs. Lavez la pastille cellulaire en la suspendant avec cinq volumes de tampon d’écoulement.Les cellules sont ensuite essorées une fois de plus dans une centrifugeuse à température ambiante pendant cinq minutes avant de jeter le SUP natant. Enfin, mettez en suspension la pastille cellulaire avec un tampon d’écoulement de sorte que la concentration finale de la cellule soit de 1 million de cellules viables par millilitre. Dans le cas d’une expérience multiplexée, ajouter un nombre égal de cellules d’intérêt non colorées provenant d’une condition expérimentale différente à la suspension de cellules colorées CFSC.Les cellules sont maintenant prêtes pour le marquage de l’antigène de surface avec des anticorps afin de commencer la coloration de la surface cellulaire. Transférez 100 microlitres de suspension cellulaire avec ou sans étiquettes CFSC dans un tube frais de 1,5 millilitre. Ajoutez des anticorps conjugués fluor quatre à la suspension cellulaire à une quantité préalablement déterminée par des tests de titrage d’anticorps.Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 100 tr/min et incubez le mélange pendant 30 minutes. En l’absence de lumière, diluez le mélange d’anticorps en ajoutant un millilitre de tampon d’écoulement. Pipetez doucement de haut en bas pour mélanger et faites tourner les cellules dans une micro-centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes.Aspirez le supinat pour éliminer les anticorps non liés et répétez cette centrifugeuse de lavage et cette aspiration. Étape une fois de plus. Reus suspend la pastille cellulaire dans 100 microlitres un tampon d’écoulement aux cellules préalablement colorées.Ajoutez 500 microlitres de tampon de fixation à 100 microlitres de suspension cellulaire. Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 100 tr/min et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Le formaldéhyde réticulera toutes les espèces de protéines et d’ADN qui sont à proximité les unes des autres et produira des suspensions cellulaires non viables.Diluez le mélange de fixation en ajoutant un millilitre de PBS et pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, faites tourner les cellules fixes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Aspirez le supinate de manière à ce qu’il reste 100 microlitres de liquide au-dessus de la pastille cellulaire pour perméer la membrane cellulaire en vue d’un marquage ultérieur de l’antigène intracellulaire.Ajoutez 500 microlitres de tampon de perméation à 100 microlitres de suspension cellulaire. Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 100 tr/min et incubez pendant 15 minutes dans l’obscurité. Diluez le mélange de perméation en ajoutant un millilitre de PBS, pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et faites tourner les cellules fixes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Aspirez complètement le SUP natant avant l’incubation. Préparez une substance de travail primaire pour anticorps en diluant l’anticorps dans un tampon PBS plus 0,5 % entre 20 %. Celui-ci est en outre enrichi avec 1 % de sérum d’ânesse, 10 % de sérum d’âne ou 10 % de sérum de chèvre.Ensuite, mettez en suspension la pastille de cellules perméables à la membrane avec 100 microlitres de la matière première de l’anticorps. Placez le tube sur un agitateur orbital à température ambiante à 200 tr/min et incubez pendant 30 minutes dans l’obscurité. Diluez le mélange d’anticorps primaires en ajoutant un millilitre de tampon d’écoulement.Pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et faire tourner les cellules dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Aspirez complètement le supinate pour éliminer les anticorps non liés. Ensuite, mettez le granulé en suspension avec 100 microlitres de la matière première de travail de l’anticorps secondaire.Répétez l’incubation à température ambiante protégée de la lumière pendant 30 minutes. Dans le même agitateur, diluez le mélange d’anticorps secondaires en ajoutant un millilitre de tampon d’écoulement. Répétez la même inversion du tube, le mélange, le spin down et l’élimination du surnageant pour éliminer tous les anticorps non liés.Répétez les mêmes étapes de centrifugation de lavage d’un millilitre et d’élimination du surnageant deux fois de plus, mais avec du PBS frais comme tampon de lavage. Au lieu de cela, le résultat final sera une pastille de cellules propres marquée soit avec des anticorps fluorescents ciblés extracellulaires ou intracellulaires CFSC, soit avec n’importe quelle combinaison des trois en suspension, la pastille cellulaire marquée dans 150 microlitres de tampon de flux. Transférez la suspension cellulaire dans le cytomètre en flux et commencez l’analyse avec les paramètres de filtre d’excitation et d’émission laser appropriés pour chaque étage de quatre.À l’aide des données de diffusion directe et latérale comme guide, configurez la diffusion initiale vers l’avant ou la diffusion latérale dans le logiciel d’analyse de cytométrie en flux afin d’exclure les points de données non spécifiques tels que les débris cellulaires et les cellules mortes. Ensuite, en utilisant les données brutes d’une suspension cellulaire non colorée comme contrôle négatif, configurez plusieurs portes d’intégration fluorescente qui sélectionnent les signaux d’émission positifs des marqueurs d’antigène extracellulaires et intracellulaires pour tenir compte de la fluorescence de fond du multicolore. Les effets de chevauchement spectral réajustent les portes fluorescentes à l’aide de données brutes provenant de témoins uniques colorés par anticorps.Dans une expérience de télécopie multiplexée, les marqueurs de carboxy-fluorescéine peuvent être utilisés comme signal de base qui pourrait faire la distinction entre les cellules de deux lignées différentes ou de conditions expérimentales sans l’utilisation d’un anticorps. Par exemple, dans une suspension cellulaire hétérogène, on peut immédiatement différencier les cellules neurales marquées avec CFSC des fibroblastes non marqués simplement en regardant la présence ou l’absence de fluorescence dans le canal vert. De plus, en conjonction avec le marquage CFSE Ether, on peut utiliser des anticorps fluorescents de différentes couleurs pour déterminer l’expression différentielle des antigènes de surface entre les sous-ensembles marqués au CFSE et ceux non marqués au sein d’un échantillon mixte.Par exemple, les cellules de neuroblastome SHSY cinq Y marquées avec CFSE dans le canal de fluorescence vert, ont co-exprimé des niveaux élevés d’antigène de surface CD 24, mais pas du marqueur fibroblaste CD 54. En revanche, les fibroblastes BJ CFSC négatifs sont positifs pour le CD 54 avec des niveaux plus faibles de CD 24. L’analyse des antigènes de surface neurale peut également être effectuée en conjonction avec la détection d’antigènes intracellulaires basée sur les anticorps.L’inclusion d’échantillons non colorés et de témoins monocolorés pour les antigènes de surface et les antigènes intracellulaires est essentielle comme alternative au marquage par anticorps primaires et secondaires des antigènes intracellulaires, comme la carte des marqueurs neuronaux deux illustrée ici. Le marquage fluorescent non covalent de l’anticorps primaire peut donner des résultats comparables dans l’analyse de co-expression et raccourcit le protocole. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les cellules neurales pour l’analyse cytométrique en flux de base à l’aide de diverses approches de marquage alternatives et de combinaisons de celles-ci.

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Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.

Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l&#39;enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux

Source : Becker-Kojić, Z. A., et. al., Génération sans GM de cellules neuronales dérivées du sang. J. Vis. Exp. (2021)La vidéo présente un protocole de préparation de cellules neurales dérivées de cellules sanguines périphériques reprogrammées pour la microscopie à fluorescence, mettant en évidence des types de cellules distincts et des stades de développement grâce à l’imagerie par immunofluorescence.

Microscopie par immunofluorescence de cellules neurales différenciées de cellules dérivées du sang périphérique 

Source : Hidmark, A. S., et al. Analyse des cellules immunitaires dans les nerfs sciatiques simples et le ganglion de la racine dorsale d’une seule souris à l’aide de la cytométrie en flux. J. Vis. exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Cette vidéo montre l’utilisation de la cytométrie en flux pour analyser les cellules immunitaires dans les nerfs sciatiques et les ganglions de la racine dorsale de souris. Le processus consiste à marquer les cellules immunitaires avec des anticorps marqués aux fluorophores...

Analyse des cellules immunitaires dans les tissus nerveux de souris à l’aide de la cytométrie en flux

Au cours des dernières années, des essais à base de cellules vivantes ont été utilisées avec succès pour détecter des anticorps contre les antigènes de surface et de conformation. Ici, nous décrivons une méthode utilisant un écoulement à haut débit cytométrie permettant l'analyse de grandes cohortes de patients. Détection de nouveaux anticorps permettra d'améliorer le diagnostic et le traitement des troubles du système immunitaire à médiation.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

L’objectif de ce protocole est d’utiliser la technique de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour trier des types spécifiques de cellules neurales en vue d’une analyse ultérieure de l’expression génique spécifique au type de cellule, des marqueurs épigénétiques et/ou de l’expression des protéines.

Utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence pour examiner l’expression génique spécifique d’un type de cellule dans le tissu cérébral du rat

Nous présentons une méthode de cytométrie de flux pour identifier simultanément différents types de cellules récupérées du cerveau de souris ou de la moelle épinière. Cette méthode pourrait être exploitée pour isoler ou caractériser les populations cellulaires pures dans les maladies neurodégénératives ou pour quantifier l'étendue du ciblage cellulaire sur l'administration in vivo de vecteurs viraux ou de nanoparticules.

Caractérisation cytométrique simultanée des types de cellules multiples récupérées du cerveau de la souris / moelle épinière grâce à différentes méthodes d'homogénéisation

Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.

Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Nous avons développé une méthode qui enrichit et isole les populations d’astrocytes humains à partir de tissus fraîchement congelés pour une utilisation dans les analyses moléculaires en aval.

Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Ce protocole décrit des stratégies d’identification et d’enrichissement de l’état cellulaire dans des cultures de cellules souches neurales neurales de souris adultes primaires par imagerie par autofluorescence à l’aide i) d’un microscope confocal, ii) d’un trieur de cellules activées par fluorescence pour effectuer l’imagerie d’intensité, ou iii) d’un microscope multiphotonique pour effectuer l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence.

Classification de l’état d’activation des cellules souches neurales in vitro à l’aide de l’autofluorescence

À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

Nous présentons ici deux protocoles pour quantifier l’engloutissement microglial des synapses vGLUT1-positives et des synaptosomes bruts marqués en rouge pHRodo à l’aide de la cytométrie en flux.

Quantification de l’engloutissement microglial du matériel synaptique à l’aide de la cytométrie en flux

Apprenez la cytométrie en flux pour analyser les antigènes de surface et intracellulaires dans les cellules neuronales. Cette méthode permet d'étudier les sous-populations neuronales spécifiques et leurs états fonctionnels.

Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones

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