High Throughput Caractérisation des cellules souches adultes d'ingénierie pour la livraison des facteurs thérapeutiques pour les stratégies neuroprotectrices

L’objectif global de cette procédure est de caractériser rapidement les cellules souches génétiquement modifiées à l’aide d’un système de criblage à haut contenu ou HCS. Pour ce faire, il faut d’abord concevoir et préparer des expériences pour une plaque de 96 puits, puis plaquer les différentes populations de cellules souches modifiées. Ensuite, le système de criblage à haut contenu est préparé pour l’imagerie de cellules vivantes, puis l’imagerie en accéléré est lancée pour la période souhaitée.

Ensuite, une fois l’imagerie en accéléré terminée, la plaque de culture est préparée pour les procédures de coloration cellulaire telles que l’iodure de propidium, la coloration pour la mort cellulaire ou l’immunomarquage au KI 67 pour caractériser la prolifération cellulaire. Enfin, la plaque à 96 puits est rechargée dans le système de criblage à haut contenu pour l’imagerie par fluorescence et l’acquisition d’images. En fin de compte, le logiciel d’analyse d’images est utilisé pour effectuer l’analyse des données afin de déterminer différents paramètres de croissance cellulaire.

Cette méthodologie peut aider à résoudre des problèmes clés dans le domaine de la biologie des cellules souches, tels que l’identification et la caractérisation des facteurs qui stimulent la différenciation des cellules souches. Les implications de cette technique s’étendent aux stratégies thérapeutiques cellulaires en raison de l’importance de caractériser les types de cellules avant qu’ils ne soient utilisés in vivo. Cette méthode peut donner un aperçu du comportement cellulaire et peut être appliquée à pratiquement n’importe quel autre type de cellule qui se développe bien en culture.

De plus, ces approches peuvent potentiellement être utilisées sur des organismes entiers tels que les larves de poisson-zèbre. Pour commencer, créez une carte, comme illustré ici, de la plaque à 96 puits décrivant les différents substrats et types de cellules à examiner sous une hotte de culture stérile. Préparez un poste de travail avec différents substrats et une plaque à 96 puits.

Ajoutez 100 microlitres de solution de substrat à chacun, bien selon la carte. Ensuite, utilisez une bande de perfil pour sceller le couvercle et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant la nuit après avoir isolé les cellules souches mésenchymateuses de souris et les avoir infectées avec des vecteurs lentiviraux conformément au protocole de texte, retirez les solutions de substrat de la plaque à 96 puits et utilisez environ 200 microlitres de PBS stérile pour laver les puits deux fois. Une fois le rinçage final terminé, à 200 microlitres de milieu de culture cellulaire et équilibrez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Entre-temps, dans des conditions stériles, récoltez les CSM en recueillant d’abord le milieu de croissance, maintenant appelé milieu conditionné, du ballon dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite huit millilitres de PBS stérile dans le ballon et remuez doucement avant d’aspirer le tampon. Pour détacher les cellules du ballon, ajoutez un millilitre de solution de trypsine à 0,05 % et d’EDTA à 0,01 %. Lorsque les cellules se sont détachées, ajoutez huit millilitres du milieu conditionné avant de recueillir la suspension cellulaire et de replaquer les cellules à environ 300 cellules par puits.

Selon le protocole textuel, incubez la plaque pendant deux heures pour permettre aux CSM de se fixer au substrat pendant que les cellules sont en incubation. Démarrez le système HCS et attendez deux heures qu’il s’équilibre. Réglez le contrôleur environnemental à 37 degrés Celsius et allumez avec précaution la bouteille de gaz mixte contenant 5 % de dioxyde de carbone dans l’air vers le système HCS, une chambre environnementale qui fournit une source d’air constante.

Ensuite, après la période d’incubation de deux heures, retirez la plaque à 96 puits de l’incubateur et placez-la directement dans la chambre environnementale du système HCS. Après avoir laissé la plaque s’équilibrer pendant 30 minutes, démarrez le logiciel pour configurer les paramètres de la plaque. Une fois les paramètres d’imagerie configurés, conformément au protocole texte, utilisez l’autofocus laser pour faire la mise au point sur le fond du puits et prenez des images de test à partir de plusieurs sites et de plusieurs puits pour trouver un plan focal optimisé.

Une fois la mise au point établie, commencez à capturer des images toutes les cinq minutes pendant 48 heures pour les 60 puits. À la fin de l’expérience, retirer la plaque à 96 puits du système HCS dans des conditions stériles, prélever des échantillons de milieu conditionné de chaque puits et les transférer sur une nouvelle plaque à 96 puits. Ces échantillons peuvent ensuite être utilisés pour un ELIZA afin d’effectuer un test de prolifération cellulaire KI 67.

Utilisez un tampon de phosphate de 0,1 molaire pour rincer les cultures cellulaires pendant une minute. Après avoir répété le lavage, utilisez du paraformaldéhyde à 4 % ou du PFA à température ambiante pendant 20 minutes pour fixer les cultures après fixation. Retirez le PFA et utilisez du PBS pour rincer les puits trois fois pendant sept minutes chacune.

Après avoir bloqué les cellules selon le protocole de texte, appliquez 100 microlitres de solution d’anticorps primaires à chacune. Couvrez bien l’assiette et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir lavé les cellules trois fois pendant sept minutes.

Pour chaque lavage, appliquez un anticorps secondaire. Placez les cellules dans l’obscurité et incubez à température ambiante pendant 90 minutes après trois autres lavages. Couvrez la plaque et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.

Pour effectuer une imagerie automatisée, chargez la plaque immunomarquée dans le système HCS et laissez la plaque s’équilibrer pendant 20 minutes. Ouvrez le logiciel d’acquisition et d’analyse d’images du système HCS. Choisissez les paramètres d’acquisition de l’objectif 10 x à l’aide de la courbure de la caméra à un et d’un réglage de gain de deux.

Utilisez la fonction d’exposition automatique pour trouver le plan Z dans lequel se trouvent les cellules et calculer le décalage pour chaque longueur d’onde d’intérêt pour l’analyse illustrée ici. Capture d’images pour DAP EGFP et S3. Choisissez le niveau d’intensité maximal auquel les puits de contrôle négatifs n’affichent aucun signal pour l’acquisition d’image. Utilisez les mêmes paramètres de seuil pour les puits positifs.

Enfin, capturez des images et enregistrez-les dans une base de données avant d’effectuer l’analyse des images. Selon le protocole textuel, comme indiqué ici, cinq populations différentes de sous-types de CSM ont été plaquées dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits précodées avec différents substrats dans cette figure, anti KI 67, qui identifie les cellules en prolifération, et le DAPI a été utilisé pour évaluer si les différents substrats influençaient la prolifération des différentes populations de CSM modifiées, comme illustré ici, bien qu’il y ait eu des variations dans les pourcentages de CSM proliférantes, tous les substrats ont soutenu une prolifération cellulaire considérable pour chaque sous-type de CSM. Ce graphique montre que le pourcentage de cellules avec une coloration à l’iodure de propidium ou PI, qui identifie les cellules mortes dans une population, est faible sur tous les substrats examinés Les cellules traitées avec 70 % d’éthanol, qui tue la plupart des cellules, ont présenté un taux élevé de marquage PI et servent de contrôle positif pour étudier le comportement des CSM sur différents substrats.

La migration cellulaire sur une période de 29 heures a été analysée à l’aide de la microscopie numérique time-lapse. Le chemin de migration de la cellule un et de la cellule deux est marqué respectivement par les lignes verte et bleue. Comme le montre ici, tous les sous-types de CSM ont montré le taux de migration le plus rapide sur la matrice extracellulaire, les surfaces revêtues et le plus lent sur les surfaces en polystyrène non revêtues.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de planifier et de concevoir soigneusement l’expérience pour un format de plaque multipuits, tel qu’une plaque à 96 puits Après cette procédure. D’autres méthodes comme Eliza S peuvent être réalisées sur des milieux de condition afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la production et la sécrétion de facteurs thérapeutiques par les cellules souches modifiées après son développement. Les procédures de criblage à haut contenu ont ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la biologie des cellules souches et de la découverte de médicaments pour explorer des systèmes biologiques complexes à haut débit.