Technique mini-invasive pour injection dans Rat Optic Nerve

L’objectif global de cette procédure est de fournir une approche peu invasive pour injecter des drogues ou des cellules souches dans le nerf optique d’un rat vivant. Pour ce faire, on anesthésie d’abord le rat, on le positionne sur le support de dissection et on insère une suture dans la conjonctive pour manipuler l’œil. Plus tard, la deuxième étape consiste à disséquer la crête orbitaire derrière l’œil pour exposer le nerf optique.

Ensuite, la pipette en verre est insérée dans le nerf optique et le médicament ou les cellules souches sont injectés avant la fermeture du site chirurgical et la réanimation du rat de l’anesthésie. En fin de compte, après un certain laps de temps, le rat est sacrifié, le nerf optique disséqué et les effets de l’injection chirurgicale ou de la transplantation peuvent être visualisés au microscope. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que cette approche est peu invasive, ce qui permet au rat de survivre aussi longtemps que nécessaire.

Étudiez les effets de l’injection chirurgicale ou de la transplantation. Kate Schwartz, une étudiante technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous anesthésie avec deux à 3 % de fluor.

Confirmez le niveau d’anesthésie approprié par pincement des orteils et la fréquence respiratoire. Vérifiez que le rat ne tressaille pas en réponse à un orteil. Pincer. Fixez l’animal au besoin pour éviter tout mouvement de la tête pendant la procédure.

Placez ensuite une goutte de lidocaïne sur l’œil chirurgical. Utilisez des larmes artificielles toutes les 10 minutes pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Administrer une injection préopératoire de buprénorphine à raison de 0,01 milligramme par kilogramme par voie sous-cutanée, puis toutes les six à huit heures au besoin.

Gardez l’animal au chaud avec un coussin chauffant. Mouillez la fourrure du cuir chevelu avec de l’alcool. En prenant soin d’éviter l’exposition sur les yeux.

Assurez-vous d’utiliser des outils stériles et une technique stérile pour minimiser le risque d’infections postopératoires. Ensuite, placez une suture à quatre oh dans la conjonctive latérale et attachez-la avec suffisamment de suture pour permettre une traction douce. Faites une incision d’environ un pouce dans la peau recouvrant la crête orbitaire.

À l’aide d’un scalpel de taille 10. Rétractez la peau et le fascia sous-jacent et disséquez soigneusement le fascia. Placez une suture dans la peau rétractée pour permettre l’exposition du sac orbitaire supérieur afin d’éviter un saignement excessif dans le site chirurgical.

Évitez de couper les vaisseaux sanguins pendant que vous disséquez le fascia. Avec une traction douce sur la conjonctive, tirant l’œil vers le bas et hors de l’orbite, le muscle orbitaire supérieur sera visible. Afin d’exposer le nerf optique, la graisse rétroorbitaire doit être retirée et ce muscle sectionné.

La graisse peut être jetée et ne doit pas être remplacée après l’injection. À partir de ce point, le fascia du nerf optique devrait être visible comme un faisceau du nerf optique lui-même, ainsi que des vaisseaux sanguins enveloppés dans de la dure-mère. Pour faire la dissection plus profonde, faites une petite incision dans le DRA à l’aide du scalpel ou d’une aiguille biseautée de calibre 31 pour rendre le piercing moins traumatisant, faites préparer une micro pipette en verre tiré d’un diamètre de 50 à 100 microns pour assurer la stabilité.

Montez la micropipette sur un micromanipulateur et fixez-la à une seringue en plastique de 20 cc. Tirez des billes ou des cellules souches reconstituées en 0,5 à un microlitre dans le micropipette rétrograde, ainsi que 0,5 microlitre de solution de bleu de méthyle avant et après le chargement de la pipette en verre avec du colorant. À l’aide d’une seringue d’un cc et d’une aiguille de calibre 30, abaissez la pointe de la micropipette sur le nerf optique juste au-dessus de la dure-mère entaillée.

Un mouvement minuscule mais rapide de la pointe du verre dans le nerf optique entraîne le moins de dommages tout en appliquant une pression lente et constante sur le piston. Le colorant bleu Evans doit mettre en évidence la zone du nerf optique injecté. Le colorant doit rester localisé dans le nerf optique sans s’échapper dans l’espace sous-arachnoïdien.

Suivez la deuxième bande de colorant bleu d’Evan pour déterminer quand l’injection de cellules souches est terminée. Lorsque le volume nécessaire est injecté dans le nerf optique, relâchez le piston. Maintenez la micropipette immobile dans le nerf optique pendant cinq minutes pour éviter l’éjection à haute pression lors du retrait de la micro-pipette une fois l’injection terminée.

Retirez la micropipette ainsi que tous les cotons-tiges utilisés pour fournir l’hémostase. Suturez la peau avec de la soie 3.0 et retirez la suture conjonctivale. Gardez les rats au chaud sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’ils sortent de l’anesthésie.

Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le sternal couché. Si l’animal présente des signes de douleur, notamment une léthargie excessive, une ataxie ou une respiration laborieuse, administrez une analgésie appropriée avec de la buprénorphine intramusculaire jusqu’à trois fois par jour. Après l’expérience, des rats ont été sacrifiés et perfusés avec du paraldéhyde.

Les nerfs optiques ont été soigneusement disséqués et montés pour la section du cryostat. Voici un exemple de nerf optique de trou de rat à faible puissance dans lequel le colorant bleu d’Evan a été injecté. Afin de visualiser le site, la flèche identifie l’emplacement précis de l’injection. Cette dissection a été effectuée quelques jours après l’injection, comme l’indique la diffusion restreinte du colorant le long du nerf après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurologie régénérative pour explorer de nouvelles façons de régénérer le nerf optique et potentiellement restaurer la vision perdue dans ce modèle de rat de maladie démyélinisante.