Name: Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de lovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Apprenez à évaluer les propriétés des cellules souches dans le carcinome ovarien humain en utilisant des dosages de sphères mono et multicellulaires. Cette méthode permet d'identifier les populations de cellules souches cancéreuses avec précision.

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Cette étude a été financée par une subvention de la Baden-Württemberg Stiftung (Programme II sur les cellules souches adultes) attribuée à C.L. Nous remercions la Dre Martina Konantz pour sa contribution critique et son examen du manuscrit. Nous remercions Emmanuel Traunecker et Toni Krebs de l’Hôpital universitaire de Bâle (DBM) pour leur aide dans le tri FACS.

1. Génération des droits de cellules de carcinome de l&#39;ovaire de OVCAR-3 transduites de manière stable avec lentivirus contenant le rapporteur Construct région régulatrice SOX2 <ol><li> Générer des particules lentiviraux par transfection de la lignée cellulaire HEK 293T-emballage avec une construction de rapporteur de reconnaître une région de régulation de la manière décrite SOX2 10,21. REMARQUE: La construction de rapporteur contient en outre un domaine de déstabilisation du système ProteoTuner bouclier avant de la protéine de fluorescence tdTomato. Shield1 se lie au domaine de déstabilisation empêchant ainsi le protéasome de dégrader la protéine de fluorescence 22. </li><li> Transduire des cellules OVCAR-3 avec des particules lentivirales sur une période de temps de 24 heures. Par la suite, retirer le surnageant viral et laver les cellules avec une solution saline tamponnée phosphate (PBS) et mises en culture dans du milieu complet (RPMI complété avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine). </li><li> 48 h plus tard, 10 ng / ml puromycine a été ajouté aux cultures et maintenue pendant 5 jours pour permettre la sélection de cellules transduites correctement. </li></ol> 2. Préparation de la cellule de tri et de Placage <ol><li> Ajouter Shield1 au 1: 1000 dilution 24 heures avant le tri de cellules. Utilisation transduites de manière stable des cellules OVCAR-3 sans traitement Shield1 comme témoins négatifs (Figure 1). Aspirer le milieu de flacon, laver les cellules avec PBS 1x et Trypsiniser cellules avec 0,05% de trypsine-EDTA pendant 3 min. </li><li> Arrêtez la trypsine en utilisant un milieu complet (voir ci-dessus), compter le nombre de cellules, les cellules de centrifugation à 300 xg à température ambiante (15-25 ° C) pendant 5 min. </li><li> Décanter le surnageant et remettre les cellules soigneusement 0,5 à 1 ml de PBS stérile. </li><li> Utilisez 40 um filtre de bouchon de crépine de cellules pour obtenir une suspension à cellule unique. </li><li> Ajuster le nombre de cellules de 5 millions de cellules par ml. </li><li> Préparer faible fixation des plaques à 96 puits ultra avec 100 ul de milieu sphères (MEGM supplémenté avec des facteurs de croissance, les cytokines, et les suppléments,B-27, l&#39;héparine de sodium; ou DMEM / F12 supplémenté en facteurs de croissance, cytokines, et des suppléments, B-27, l&#39;héparine de sodium avec ou sans addition de 1% de méthylcellulose, voir également le tableau 1). Ajouter éventuellement des antibiotiques dans le milieu à une concentration de 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine afin de minimiser le risque de contamination possible. </li><li> Trier DP + et les cellules RFP- préparés dans des plaques à 96 puits à partir de ci-dessus, une cellule par puits (single sphères de dosage à base de cellules) et 100 cellules par puits de dosage (multi sphères à base de cellules), respectivement. Effectuer tri sur disponible dans le commerce trieur de cellules (voir Matériaux) en utilisant le mode unique de cellules, Trier configuration: 100 μ buse, la pression de la gaine 20 psi, et le masque de rendement 0, masque pureté 32, masque de phase 16. </li><li> Évaluer l&#39;efficacité de placage en marquant au microscope puits contenant des cellules (pour le dosage à base de cellules unique) et en comptant le nombre de cellules dans des puits individuels (pour le dosage à base de cellules multiples; Figure 2 </strong&gt;). </li><li> Incuber les cellules dans des conditions normales dans les sphères moyennes (pour la composition voir l&#39;étape 2.6) à 37 ° C et 5% de CO 2. Supplément quotidien bFGF (20 ng / ml) et de l&#39;EGF (20 ng / ml). </li><li> Après une semaine, compter le nombre de nouvelles sphères tumorales en utilisant un microscope standard avec un grossissement de 10X ou 4X et un microscope à fluorescence pour détecter le signal de fluorescence à partir du système rapporteur intégré. Comptez sphères avec un diamètre supérieur à 100 um comme «grands» des sphères et des sphères d&#39;un diamètre de 50 à 100 um comme &quot;petits&quot; domaines (Figure 3). Assurez-vous que vous comptez sphères réelles et non cellulaires grappes. NOTE: Dans les essais à base de cellules simples formation sphère est plus facile de marquer au microscope après 10 (contre 7) jours de culture. </li><li> Calculer la proportion de cellules de la sphère formation en DP + et les cellules respectivement RFP- dans des dosages à base de cellules simples (une plaque de 96 puits pour chaque expérience individuelle) ou plusieurs cellules-basphères sed essais (un puits pour chaque expérience individuelle) présentés par Shaw et al. 16 REMARQUE: Proportion de cellules formant sphère (en%) = (nombre de sphères) / (nombre de cellules ensemencées) x 100 </li></ol> 3. Le passage en série des Sphères <ol><li> Placez le contenu de chaque puits dans un tube et centrifuger stérile appropriée à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Pour plusieurs sphères dosages à base de cellules, rassembler les sphères d&#39;un puits. Laver le bien 3-5 fois avec du PBS et centrifuger 2 min plus. Pour sphères simples tests à base de cellules, recueillir des sphères individuelles. En raison du faible nombre de cellules, utilisez tubes de 1,5 ml pour centrifugation et lavage étapes. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de 0,05% de trypsine-EDTA. </li><li> Afin d&#39;obtenir une séparation optimale des cellules, incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 5 min dans un agitateur doux. Optimiser trypsinisation temps pour votre lignée cellulaire à taux de mort cellulaire inférieure: si aucune grandesphères est trituré visible doucement à l&#39;aide d&#39;une pipette de 100 pi. En cas de grosses sphères sont toujours présents, incuber avec de la trypsine autre 3 min, puis passez à l&#39;étape de trituration. En cas de simple tests cellulaires veillez à optimiser le temps pour le rendement cellulaire optimal de cellules vivantes au cours de l&#39;étape de traitement à la trypsine. </li><li> Pour inactiver la trypsine, ajouter 500 pi de milieu complet et centrifuger à 300 g pendant 10 min, dans le cas de dosages cellulaires simples, centrifuger pendant 2 min supplémentaires. </li><li> Éliminer les cellules surnageant et remettre soigneusement dans le milieu des sphères. </li><li> Utiliser un filtre de plafonnement des tamis cellulaire de 40 um pour obtenir une suspension monocellulaire. </li><li> Dans le cas de l&#39;utilisation DP + et les cellules RFP- dans des dosages cellulaires bassed multiples, évaluer le pourcentage de cellules présentant une fluorescence dans chaque puits après remise en suspension par analyse cytomètre de flux. </li><li> Pour les essais de réensemencement série de cellules individuelles, semences 1 cellule par puits dans une nouvelle plaque de fixation basse ultra 96 ​​puits préparés comme détaillé ci-dessus. D&#39;une sphère individuelle, ensemencer environ 20 puits individuels. Pour les essais de réensemencement de multiples sphères primaires à base de cellules, les cellules obtenues à partir de graines et une des sphères primaires dans une nouvelle plaque à 96 puits et compter le nombre de cellules par microscopie lendemain. </li><li> Évaluer la proportion de cellules de la sphère formant dans les sphères secondaires essais utilisant la formule décrite à l&#39;étape 2.11. </li></ol> 4. Analyse des résultats <ol><li> Analyser les résultats des expériences réalisées en triple indépendants et utiliser le test t de Student recto-verso pour analyser les valeurs normalement distribués et autrement Mann-Whitney-Tests pour l&#39;analyse statistique. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Sphères cultures sont une méthode largement utilisée pour analyser le potentiel de cellules souches du cancer et enrichir en cellules souches-comme dans un large éventail de cellules tumorales humaines 15,25,26. Dans ces conditions de culture, les cellules cancéreuses qui ne ont pas la capacité d&#39;auto-renouvellement se attend à différencier et, éventuellement, subir une mort cellulaire. Bien qu&#39;ils puissent former initialement des agrégats de cellules ou même des sphères de tumeurs primaires dans des ...

Il est de plus en plus évident que les carcinomes ovariens sont composés de mélanges hétérogènes de cellules et hébergent ce que l’on appelle des « cellules souches cancéreuses » (CSC) responsables de l’initiation, du maintien et de la rechute de la maladie après les thérapies cytotoxiques conventionnelles1-3. Par conséquent, le développement de stratégies moléculaires ciblant les CSC ovariens est un objectif important et promet d’améliorer le traitement des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire.
Une condition préalable à la compréhension des caractéristiques moléculaires des CSC est leur isolement fiable des non-CSC. Cependant, l’identification des CSC ovariens semble difficile. Bien que l’expression de CD133 et l’activité de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH)4,5 aient été signalées pour marquer les CSC ovariens, certaines données indiquent que ces marqueurs sont instables6. De manière constante, dans le cancer de l’ovaire, à l’exception par exemple du carcinome du sein7, l’expression d’ALDH1 s’associe à un résultat favorable8 et l’expression du marqueur de cellules souches proposé variant CD44 n’a pas de valeur pronostique9. Plus récemment, nous avons montré que l’expression de la protéine SOX2 des cellules souches embryonnaires confère une souche aux cellules de carcinome ovarien10 et qu’une expression élevée de SOX2 s’associe à des carcinomes de l’ovaire et du sein cliniquement agressifs11,12. Par conséquent, dans ce rapport, nous utilisons une construction de rapporteur lentiviral contenant une protéine de fluorescence rouge (RFP) dont l’expression est contrôlée par une région régulatrice de SOX2, comme méthode pour isoler les CSC ovariens présumés.
Par définition, les CSC peuvent à la fois s’auto-renouveler et se différencier, donnant naissance à tous les types de cellules tumorales. Les populations présumées de CSC doivent être analysées dans des tests fonctionnels effectués in vivo. Pour des raisons évidentes, dans les cellules humaines, ces tests fonctionnels se limitent aux tests de xénogreffe, comprenant principalement la transplantation de cellules tumorales humaines chez des souris immunodéprimées10,13.
Une méthode alternative in vitro a été proposée par Brent Reynolds et Sam Weiss, qui ont été les premiers à présenter le test dit de la neurosphère comme un test de substitution évaluant le potentiel souche dans les cellules neurales14. Dontu et ses collègues ont ensuite confirmé l’utilisation de ce test pour l’évaluation du potentiel des cellules souches dans les cellules mammaires15,16. Ici, des cellules mammaires humaines ont été plaquées en différents nombres dans un milieu sans sérum complété par du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF), du B-27 et de l’héparine et cultivées dans des conditions non adhérentes pendant sept à dix jours avant que la formation de la sphère ne soit évaluée par microscopie. En suivant ce protocole avec quelques ajustements dans le nombre de cellules, le milieu de croissance et les suppléments, plusieurs groupes ont exploré le potentiel des cellules souches in vitro de plusieurs types de cancer tels que les tumeurs du sein17, du cerveau18, du pancréas19 et du côlon20. Dans le carcinome ovarien, nous avons récemment rapporté la faisabilité de l’essai des sphères et comparé ses résultats à ceux recueillis dans des modèles de xénogreffes murines in vivo 10. Nous avons constaté que la surexpression de la protéine SOX2 de la cellule souche améliorait à la fois la formation de sphères in vitro et la tumorigénicité in vivo des cellules de carcinome de l’ovaire humain10. Cependant, la fréquence des cellules initiatrices de sphères était plus élevée que la fréquence des cellules initiatrices de tumeurs mesurées in vivo10, ce qui suggère que soit le test de la sphère peut conduire à des résultats faussement positifs pour des raisons techniques, soit, alternativement, le test in vivo peut être inefficace et entraîner des résultats faussement négatifs.
Dans ce rapport, nous analysons plus en détail les dosages de sphères ovariennes multicellulaires, passons en revue les différents protocoles disponibles dans la littérature et les comparons à un test basé sur une seule cellule. Nous montrons que le test basé sur une seule cellule fournit des résultats plus précis et reproductibles que les tests basés sur plusieurs cellules, qui peuvent être fortement influencés par la densité des cellules en placage, à moins que la méthylcellulose ne soit ajoutée aux cultures pour immobiliser les cellules. Cependant, également dans les essais basés sur des cellules uniques, le potentiel d’initiation de la sphère in vitro est observé à une fréquence plus élevée que le potentiel d’initiation de la tumeur in vivo.

<table><tbody><tr><td>Plaque de fixation basse</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade ; Kit</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade ; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade ; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>concentration finale : 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>concentration finale : 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>concentration finale : 1X</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (poudre)</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Cell trieur</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III trieur de cellules Analyseur</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Cytomètre en flux BD</td><td></td><td>Accuri c6</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire carcinome utilisant multi et simples à base de cellules sphères dosages

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Des années de recherche indiquent que les cancers de l’ovaire hébergent un mélange hétérogène de cellules comprenant une sous-population de cellules dites « souches cancéreuses » (CSC) responsables de l’initiation, de l’entretien et de la rechute de la tumeur après les chimiothérapies conventionnelles. L’identification des CSC ovariens est donc un objectif important. Une méthode couramment utilisée pour évaluer le potentiel de CSC in vitro est le test des sphères dans lequel les cellules sont plaquées dans des conditions de culture non adhérentes dans un milieu sans sérum complété par des facteurs de croissance et la formation des sphères est notée après quelques jours. Ici, nous passons en revue les protocoles actuellement disponibles pour les tests de cancer de l’ovaire humain et effectuons une analyse côte à côte entre les tests multicellulaires couramment utilisés et un système plus précis basé sur le placage de cellules uniques. Nos résultats indiquent que les essais de sphères multicellulaires et unicellulaires peuvent être utilisés pour étudier la formation de sphères in vitro. Les tests basés sur des cellules uniques, plus laborieux et plus coûteux, sont plus adaptés à l’évaluation fonctionnelle de cellules individuelles et conduisent à des résultats globaux plus précis, tandis que les tests basés sur plusieurs cellules peuvent être fortement influencés par la densité des cellules en plaques et nécessitent des expériences de titrage en amont. La supplémentation en méthylcellulose des essais multicellulaires peut être utilisée efficacement pour réduire les artefacts mécaniques.

Dans les sphères des analyses classiques, près de 40% des DP + OVCAR-3 cellules contre 20% des cellules RFP- a donné lieu à une sphère de tumeur individuelle dans le dosage des sphères primaire (figure 4A). En outre, les sphères formées par DP + cellules sont plus grandes en taille que ceux qui sont formés par des cellules RFP-. Lorsque plaqués dans des essais à base de cellules simples, les cellules de la DP + également formés plusieurs sphères que les cellules RFP-, confir...

Les dosages de sphères in vitro sont couramment utilisés pour identifier les cellules souches cancéreuses. Ici, nous comparons les dosages à sphère unique et à plusieurs cellules. Les tests basés sur des cellules uniques plus laborieux ou la supplémentation en méthylcellulose donnent des résultats plus précis, tandis que les tests multicellulaires effectués en milieu liquide peuvent être fortement influencés par la densité cellulaire.

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer les propriétés des cellules souches des cellules de carcinome de l’ovaire humain à l’aide de tests de sphères multicellulaires et uniques. Ceci est accompli en sélectionnant d’abord les cellules SOX deux rapporteurs RFP lentivirus Transduits par le traitement Pur Mycin dans la deuxième étape, les cellules RFP positives et RFP négatives sont isolées et plaquées par les faits en tant que colonies unicellulaires ou multicellulaires par puits. Ensuite, la formation de la sphère primaire est analysée au microscope, puis les cultures de la sphère primaire sont dissociées et replaquées pour l’analyse de la formation de la sphère secondaire.En fin de compte, ces tests de sphère sont utilisés pour calculer la proportion de cellules souches présumées du cancer de l’ovaire qui présentent une capacité de formation de sphère. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches cancéreuses, telles que quelles sont les populations potentielles de cellules souches cancéreuses et quelle est la fréquence dans l’ensemble du sac tumoral. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’identification des cellules souches du cancer de l’ovaire, elle peut également être appliquée pour isoler les cellules souches cancéreuses d’autres entités tumorales solides telles que le carcinome du sein.24 heures après la transduction de cellules de carcinome ovarien humain avec des particules lentivirales, retirez le surnageant viral et lavez les cellules en culture PBS. Les cellules en milieu complet pendant 48 heures. Ensuite, changez de milieu et ajoutez 10 microgrammes par millilitre de mycine piro après cinq jours.Traitez les cultures avec un bouclier à une dilution de un à 1000 le lendemain. Lavez les cellules dans du PBS, puis détachez-les avec 0,05 % de tripsdans de l’EDTA. Après trois minutes, arrêtez la réaction avec un milieu complet.Comptez les cellules et centrifugez-les pendant cinq minutes à 300 fois G et à température ambiante. Remettez soigneusement les cellules en suspension dans 0,5 à un millilitre de PBS stérile, puis filtrez la suspension cellulaire résultante à travers un filtre de 40 micromètres. Ajustez les cellules à une dilution de cinq fois 10 à six cellules par millilitre, puis ajoutez 100 microlitres de sphères moyennes à chaque puits d’une plaque à 96 puits à très faible fixation pour un test de sphère basé sur une seule cellule.Utilisez le mode cellule unique pour trier une cellule dans chaque puits de la plaque. Ensuite, marquez au microscope les cellules pour évaluer l’efficacité du placage. Incuber les cellules dans des sphères fraîches, à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2 avec une supplémentation quotidienne en facteur de croissance des fibroblastes de base et en facteur de croissance épidermique.Après une semaine, déterminer le nombre de sphères tumorales émergentes par microscopie optique et la présence du signal fluorescent du système rapporteur intégré par microscopie fluorescente. Comptez les sphères d’un diamètre supérieur à 100 micromètres comme de grandes sphères et les sphères d’un diamètre de 50 à 100 micromètres comme de petites sphères. En prenant soin de compter les sphères réelles et non les amas de cellules.Calculez ensuite la proportion de sphères formant des cellules RFP positives ou négatives RFP selon la formule de passage. Les sphères commencent par transférer le contenu de chaque puits dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre. Ensuite, rincez bien chaque fois trois à cinq fois avec du PBS pour être sûr de collecter toutes les sphères et faites tourner les cellules pendant 10 minutes à 300 fois G et à température ambiante.Après la centrifugation, retirez le silet et suspendez les granulés dans 200 microlitres de 0,05 % de voyages en EDTA à 37 degrés Celsius dans un agitateur doux pendant cinq minutes. Si aucune grosse sphère n’est visible après cinq minutes, tritrâtrez doucement la solution cellulaire avec une pointe de pipette de 100 microlitres et ajoutez 500 microlitres de milieu complet pour inactiver la trypsine. Les cellules de centrifugation remettent les granulés en suspension avec précaution dans des sphères de milieu et drainent la suspension cellulaire résultante à travers un filtre de 40 micromètres comme nous venons de le noter.Enfin, pour le replacage en série des cellules uniques, ensemencez des cellules uniques d’une sphère primaire dans 100 microlitres de sphères, milieu par puits dans une nouvelle plaque à 96 puits à très faible attache. Utilisez ensuite la même formule que pour le dosage des sphères primaires afin d’évaluer la proportion de cellules formant des sphères dans les sphères secondaires. Tests dans des domaines multicellulaires : près de 40 % des cellules de carcinome ovarien humain positives RFP, contre seulement 20 % des cellules négatives RFP, ont donné naissance à une sphère tumorale individuelle dans les sphères primaires.Étonnamment, un plus grand nombre de sphères est compté à partir d’un nombre plus faible de cellules plaquées dans des milieux à base de MGEM et de D-M-E-M-F 12, ce qui démontre que les modalités de placage ont fortement biaisé les résultats de ce test. En revanche, lorsque les cellules sont immobilisées par l’ajout de 1 % de méthylcellulose, l’efficacité de la formation de la sphère est principalement indépendante de la densité cellulaire dans les cultures de sphères multicellulaires. Environ 35 % des cellules des sphères positives RFP perdent leur signal fluorescent rouge après sept jours de culture, ce qui suggère que ces cellules ont subi une différenciation tandis que plus de 65 % des cellules conservent un signal RFP suggérant une capacité d’auto-renouvellement.En revanche, les cellules de sphères générées à partir de cellules initialement négatives à la RFP restent négatives à la RFP, ce qui indique qu’elles ne peuvent pas rétablir le potentiel des cellules souches dans ces conditions. La microscopie à fluorescence réalisée sur des sphères générées à partir de cellules uniques confirme ces données, démontrant que les sphères uniques dérivées de cellules positives RFP contiennent à la fois des cellules RFP positives et des cellules RFP négatives. Alors que les sphères dérivées de cellules négatives RFP conservent leur absence de signal rouge Suite à cette procédure.D’autres mesures telles que les anticorps, la coloration ou l’analyse de l’expression génique via quantit PCR peuvent être effectuées pour caractériser davantage les cellules à forte capacité de formation. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que des tests de transplantation in vivo chez des souris immunodéprimées doivent être effectués pour valider les propriétés des cellules souches tumorales des cellules initiatrices de la sphère.

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