Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l'ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer les propriétés des cellules souches des cellules de carcinome de l’ovaire humain à l’aide de tests de sphères multicellulaires et uniques. Ceci est accompli en sélectionnant d’abord les cellules SOX deux rapporteurs RFP lentivirus Transduits par le traitement Pur Mycin dans la deuxième étape, les cellules RFP positives et RFP négatives sont isolées et plaquées par les faits en tant que colonies unicellulaires ou multicellulaires par puits. Ensuite, la formation de la sphère primaire est analysée au microscope, puis les cultures de la sphère primaire sont dissociées et replaquées pour l’analyse de la formation de la sphère secondaire.

En fin de compte, ces tests de sphère sont utilisés pour calculer la proportion de cellules souches présumées du cancer de l’ovaire qui présentent une capacité de formation de sphère. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cellules souches cancéreuses, telles que quelles sont les populations potentielles de cellules souches cancéreuses et quelle est la fréquence dans l’ensemble du sac tumoral. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’identification des cellules souches du cancer de l’ovaire, elle peut également être appliquée pour isoler les cellules souches cancéreuses d’autres entités tumorales solides telles que le carcinome du sein.

24 heures après la transduction de cellules de carcinome ovarien humain avec des particules lentivirales, retirez le surnageant viral et lavez les cellules en culture PBS. Les cellules en milieu complet pendant 48 heures. Ensuite, changez de milieu et ajoutez 10 microgrammes par millilitre de mycine piro après cinq jours.

Traitez les cultures avec un bouclier à une dilution de un à 1000 le lendemain. Lavez les cellules dans du PBS, puis détachez-les avec 0,05 % de tripsdans de l’EDTA. Après trois minutes, arrêtez la réaction avec un milieu complet.

Comptez les cellules et centrifugez-les pendant cinq minutes à 300 fois G et à température ambiante. Remettez soigneusement les cellules en suspension dans 0,5 à un millilitre de PBS stérile, puis filtrez la suspension cellulaire résultante à travers un filtre de 40 micromètres. Ajustez les cellules à une dilution de cinq fois 10 à six cellules par millilitre, puis ajoutez 100 microlitres de sphères moyennes à chaque puits d’une plaque à 96 puits à très faible fixation pour un test de sphère basé sur une seule cellule.

Utilisez le mode cellule unique pour trier une cellule dans chaque puits de la plaque. Ensuite, marquez au microscope les cellules pour évaluer l’efficacité du placage. Incuber les cellules dans des sphères fraîches, à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO2 avec une supplémentation quotidienne en facteur de croissance des fibroblastes de base et en facteur de croissance épidermique.

Après une semaine, déterminer le nombre de sphères tumorales émergentes par microscopie optique et la présence du signal fluorescent du système rapporteur intégré par microscopie fluorescente. Comptez les sphères d’un diamètre supérieur à 100 micromètres comme de grandes sphères et les sphères d’un diamètre de 50 à 100 micromètres comme de petites sphères. En prenant soin de compter les sphères réelles et non les amas de cellules.

Calculez ensuite la proportion de sphères formant des cellules RFP positives ou négatives RFP selon la formule de passage. Les sphères commencent par transférer le contenu de chaque puits dans des microtubes à centrifuger individuels de 1,5 millilitre. Ensuite, rincez bien chaque fois trois à cinq fois avec du PBS pour être sûr de collecter toutes les sphères et faites tourner les cellules pendant 10 minutes à 300 fois G et à température ambiante.

Après la centrifugation, retirez le silet et suspendez les granulés dans 200 microlitres de 0,05 % de voyages en EDTA à 37 degrés Celsius dans un agitateur doux pendant cinq minutes. Si aucune grosse sphère n’est visible après cinq minutes, tritrâtrez doucement la solution cellulaire avec une pointe de pipette de 100 microlitres et ajoutez 500 microlitres de milieu complet pour inactiver la trypsine. Les cellules de centrifugation remettent les granulés en suspension avec précaution dans des sphères de milieu et drainent la suspension cellulaire résultante à travers un filtre de 40 micromètres comme nous venons de le noter.

Enfin, pour le replacage en série des cellules uniques, ensemencez des cellules uniques d’une sphère primaire dans 100 microlitres de sphères, milieu par puits dans une nouvelle plaque à 96 puits à très faible attache. Utilisez ensuite la même formule que pour le dosage des sphères primaires afin d’évaluer la proportion de cellules formant des sphères dans les sphères secondaires. Tests dans des domaines multicellulaires : près de 40 % des cellules de carcinome ovarien humain positives RFP, contre seulement 20 % des cellules négatives RFP, ont donné naissance à une sphère tumorale individuelle dans les sphères primaires.

Étonnamment, un plus grand nombre de sphères est compté à partir d’un nombre plus faible de cellules plaquées dans des milieux à base de MGEM et de D-M-E-M-F 12, ce qui démontre que les modalités de placage ont fortement biaisé les résultats de ce test. En revanche, lorsque les cellules sont immobilisées par l’ajout de 1 % de méthylcellulose, l’efficacité de la formation de la sphère est principalement indépendante de la densité cellulaire dans les cultures de sphères multicellulaires. Environ 35 % des cellules des sphères positives RFP perdent leur signal fluorescent rouge après sept jours de culture, ce qui suggère que ces cellules ont subi une différenciation tandis que plus de 65 % des cellules conservent un signal RFP suggérant une capacité d’auto-renouvellement.

En revanche, les cellules de sphères générées à partir de cellules initialement négatives à la RFP restent négatives à la RFP, ce qui indique qu’elles ne peuvent pas rétablir le potentiel des cellules souches dans ces conditions. La microscopie à fluorescence réalisée sur des sphères générées à partir de cellules uniques confirme ces données, démontrant que les sphères uniques dérivées de cellules positives RFP contiennent à la fois des cellules RFP positives et des cellules RFP négatives. Alors que les sphères dérivées de cellules négatives RFP conservent leur absence de signal rouge Suite à cette procédure.

D’autres mesures telles que les anticorps, la coloration ou l’analyse de l’expression génique via quantit PCR peuvent être effectuées pour caractériser davantage les cellules à forte capacité de formation. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que des tests de transplantation in vivo chez des souris immunodéprimées doivent être effectués pour valider les propriétés des cellules souches tumorales des cellules initiatrices de la sphère.