Culture de souris embryonnaires cochléaires explants et Gene Transfer par électroporation

Le but de cette procédure est de cultiver et d’électro-opérer l’embryon de souris, la cochlée exvivo. Afin d’étudier divers aspects du développement cochléaire, y compris la différenciation de la morphogenèse et les événements de croissance, cela est accompli en obtenant d’abord la tête d’un embryon embryonnaire de souris au jour 13. Ensuite, exposez les oreilles internes en retirant le cerveau et isolez-les de l’os temporal en développement en les détachant de la base du crâne.

Retirez ensuite le cartilage sus-jacent et ouvrez le canal cochléaire pour obtenir l’épithélium sensoriel de la cochlée. La dernière étape consiste à cultiver la cochlée disséquée avec ou sans électroporation pendant une semaine maximum. En fin de compte, les implants peuvent être analysés pour l’imagerie de cellules vivantes ou l’immunocoloration fixe et analysés par imagerie confocale, la culture d’embryons de souris.

L’explan cochléaire fournit un excellent système pour étudier divers aspects de l’organogenèse, tels que la prolifération, la spécification du sulfate et la polarité dans la cochlée en développement et comment ces événements contribuent à la croissance et à la différenciation. Cette technique permet donc d’effectuer des manipulations pharmacologiques et de surveiller les fonctions des gènes ex vivo. Ainsi, cette technique, associée au transfert de gènes par électroporation, a permis de modifier l’expression du gène d’intérêt et de surveiller sa fonction au niveau d’une seule cellule.

Pour commencer cette procédure, placez une tête d’embryon de souris E 13 dans une boîte de sogar stérile contenant une solution de dissection froide. À l’aide d’un microscope à dissection, immobiliser la tête de l’embryon en plaçant des épingles minutieuses autour de la région de l’œil. Ensuite, à l’aide de deux paires de pinces stériles, retirez soigneusement la peau et ouvrez le crâne sur le côté dorsal le long de la ligne médiane.

Après cela, retirez le cerveau de la cavité crânienne. Les oreilles internes situées dans les os temporaux peuvent être identifiées à partir de la muqueuse du vaisseau sanguin qui les entoure. Ensuite, disséquez l’oreille interne de l’os temporal en plaçant la pince sous le tissu et en isolant l’oreille interne de la base du crâne.

Ensuite, transférez les oreilles internes disséquées dans un nouveau plat contenant une solution de dissection froide. Orientez maintenant l’oreille interne de manière à ce que la face ventrale soit tournée vers le haut. Stabilisez l’oreille interne en insérant doucement l’extrémité pointue des broches du minucin à travers la partie vestibulaire.

À l’aide d’une pince ultra-fine, ouvrez le cartilage sus-jacent en faisant une incision près de la fenêtre ovale. Assurez-vous que la pince n’est pas insérée trop profondément dans le cartilage, car le cartilage sus-jacent est parfois fusionné avec le canal cochléaire. Ensuite, retirez soigneusement le cartilage de la cochlée.

Ensuite, exposez l’épithélium sensoriel en plaçant la pince à la base ou à l’apex du canal cochléaire et tirez doucement le toit de la cochlée vers l’extérieur. Comme dernière étape, retirez soigneusement le tissu conjonctif sous-jacent de l’épithélium sensoriel exposé afin que la base de l’explan cochléaire soit plate. Après cela, isolez la cochlée disséquée de la partie vestibulaire de l’oreille interne.

Transférez l’épithélium sensoriel cochléaire disséqué dans la matrice de la membrane basale Bien enrobé de culture à l’aide d’une pelle stérile de 1,5 millimètre si un nettoyage supplémentaire est nécessaire pour éliminer les tissus supplémentaires, cela peut être effectué au cours de cette étape. Orientez ensuite l’explan cochléaire avec la surface luminale de l’épithélium vers le haut. Aspirez la solution DMEM de matrice de membrane basale pour aplatir soigneusement le tissu et ajoutez doucement 150 microlitres de milieu de culture frais dans le plat.

Assurez-vous que chaque x explan a adhère bien à la lamelle de couverture en verre revêtu et ne flotte pas dans le milieu de culture. Ensuite, transférez doucement la cochlée micro disséquée dans une boîte de culture stérile de 150 millimètres et placez-la dans un incubateur de culture tissulaire. A 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour trois à six DIV.

Après 1D IV.Examinez la culture sous un microscope à dissection pour vous assurer que l’explan cochléaire adhère bien à la boîte de culture. Continuez ensuite à incuber la culture in vivo pendant la période de temps souhaitée avant de la traiter pour l’immunohistochimie afin de la préparer à l’électroporation. Stérilisez d’abord un plat en verre recouvert d’un cigare de 100 millimètres par autoclave ou trempage dans de l’éthanol à 70 % pendant environ 20 minutes.

Ensuite, laissez-le sécher à l’air libre sur un banc propre avant de l’utiliser. Préparez maintenant l’ADN à partir d’un vecteur d’expression de votre choix à l’aide d’un maxi ou d’un kit de préparation MIDI approprié. Les vecteurs d’expression utilisés dans ce protocole sont une construction d’expression H et une construction d’expression neuro D.

Et la concentration finale d’ADN doit être d’au moins un microgramme par microlitre dans l’ADN stérile ARN libre d’eau pour électro-opérer l’ADN dans l’explication cochléaire énique. Ajoutez 10 microlitres de solution d’ADN plasma dans un plat frais recouvert d’un cigare de 100 millimètres. Transférez ensuite un explan cochléaire entièrement disséqué dans la solution d’ADN avec la surface luminale de l’épithélium vers le haut.

Inclinez légèrement la cochlée de manière à ce qu’elle soit perpendiculaire au plan de la parabole. Placez ensuite la palette d’électrode négative vers l’épithélium sensoriel et la palette d’électrode positive à côté de la base de la cochlée à l’aide de l’électrostatateur. Délivrez neuf à 10 impulsions d’une durée d’impulsion de 24 millivolts et 30 millisecondes.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu de culture chaud à la cochlée électro-classée. Répétez les procédures pour tout l’explan cochléaire et pour l’ADN de tous les gènes d’intérêt avant de transférer la cochlée électro dans la boîte recouverte de matrice de membrane basale pour le placage. Ensuite, cultivez toutes les cochlées électro-notées dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius 5 % de dioxyde de carbone pendant la période de temps souhaitée, qui sera ensuite traité pour l’immuno-chimie.

Ces images montrent les implants cochléaires embryonnaires du jour 13 des pubs de souris CD de type sauvage, qui sont électroporés avec un TH, un EEG FP ou un neuro D un EGFP Reporter. Ils ont été immunomarqués avec un marqueur spécifique des cellules ciliées, un anti-myo sept A ou un marqueur neuronal deux à un en rouge. Les cellules électronominales, qui peuvent être visualisées par l’expression de l’EGFP, sont observées dans toute la crête épithéliale supérieure, la crête épithéliale inférieure et les cellules épithéliales sensorielles.

Les cellules épithéliales cochléaires transfectées neuro D one après cinq DIV ont acquis le phénotype neuronal avec des processus dendritiques, dont la plupart étaient positifs pour deux ou un T oh H un. Les cellules transfectées étaient positives pour myo sept. Une expression Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures pour l’intelle de huit à 10 pops.

Cela laissera amplement le temps nécessaire à la culture de dissection, à l’électroporation et au placage de l’explan.