Name: Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 배우세요 배아 마우스 달팽이 explant 배양 및 전기천공을 이용한 유전자 전달 방법. 이 기술은 청각 기관 발생과 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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이 프로토콜에 대한 의견을 제시해 주신 Bradley Schulte 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R00(5R00DC010220)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트는 Grant C06RR014516의 지원을 받아 개조된 실험실 공간에서 수행되었습니다.

참고 : 살아있는 동물을 사용하는 모든 프로토콜을 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 공식적으로 실험 동물의 관리 및 사용 방법을 승인 따라야합니다. 모든 해부은 층류 클린 벤치에 무균 기술을 사용하여 수행되어야한다. 장갑과 마스크를 원하는 경우,이 절차를 수행하는 동안 착용해야합니다. 배아 마우스 내부 귀 1. 해부 <ol><li> 코르티 이식편 문화의 기관에 대한 설정 : <ol><li> 약 30 분 동안 UV 광을 켜서 층류 조직 배양 후드를 소독하고 사용 전에 70 %의 에탄올로 표면을 소독. 또한, 미세 해부 도구와 오토 클레이브를 통해 배아 해부 또는 사용하기 전에 적어도 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글하여 실 가드 코팅 요리를 포함한 모든 해부기구를 소독. 깨끗한 층류 클레아에서 자연 건조 요리와 악기를 70 % 에탄올을 붓고 허용N 벤치 사용 전에. </li><li> 준비 멸균 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) / (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) HEPES 배 HBSS 및 0.5 %의 10 %를 첨가하여 약 7.2로 pH를 조정하고 필터 멸균함으로써 (HEPES) 혼합물 4 ° C에서 최종 솔루션 및 저장. 더 나은 절차 전반에 걸쳐 조직을 유지하기 위해 냉장 HBSS / HEPES 솔루션의 모든 해부를 수행합니다. </li><li> 멸균 15 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 기저막 매트릭스의 300 μL 분취 멸균 (39 ° C) 냉간 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 5 mL를 추가하여 기저막 매트릭스 코트 유리 바닥 접시. 내용을 텍싱하여 혼합하고 접시의 중앙에 잘 존재하는 전체 문화를 덮도록 각각의 배양 접시의 중앙에 기저막 매트릭스 DMEM 혼합물의 150 μl를 추가합니다. 사용하기 전에 적어도 45 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 요리와 저장소를 커버. </li><li> 일에 HBSS를 차게 4-5 ml에 붓고살균 폴리스티렌 페트리 접시를 REE 후드 폐쇄 둡니다. </li><li> DMEM 9 ㎖, N2 보충제 100 ㎕, 10g / ㎖ 시프 FBS 및 1 ㎖를 첨가하여 15 ㎖의 멸균 된 폴리 프로필렌 튜브에서 배양 배지를 준비한다. </li></ol></li><li> 배아의 분리 : 참고 : 배아 마우스에서 인공 와우 절편을 배양이 절차에서는 수확 내이가 배아 일 (E)에서 수정 후 하루 13 시간 뼈 E1 (9)으로 간주된다. 프로토콜은 또한 E12 E18로부터 시작하여 마우스 배아 내이 함께 사용될 수있다. <ol><li> CO 2 시간 초과 - 임신 한 마우스를 안락사와 자궁 경부 전위 또는 적절한 승인 프로토콜에 의해 동물을 희생. 조직 배양 무균 룸을 유지하는 거리 층류 유동 조직 배양 후드에서 euthanization을 수행. </li><li> 이 위로 향하게 복부와 종이 타월에 안락사 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 복부를 소독. </li><li> 피부를 잡아 복강을 엽니 다다른 손을 사용하여 가위로 중간 선을 따라 곡선 한 손으로 집게와 컷 표피와 근육으로. 양쪽에 두 개의 수직 컷을 확인하고 집게로 양측 자궁 뿔을 들어 올려 조심스럽게 자궁을 끌어와 결합 조직을 이용하여 위 아래에서 분리. </li><li> 층류 흐름 클린 벤치에 냉장 해부 솔루션 (HBSS / HEPES 혼합물) 및 전송을 포함하는 페트리 접시에 배아 체인을 놓습니다. </li><li> 태반에서 조심스럽게 배아를 제거하고 해부 솔루션을 포함하는 멸균 페트리 접시 중 하나에 배치합니다. 이 솔루션은 피 묻은 켜지면 새로운 배양 접시로 이동합니다. 참고 :이 시점에서, 배아 Theiler의 준비 가이드를 사용하여 개최 할 수있다. </li><li> 깨끗한 집게 나 가위로 목 부위에 집어 배아 목을 벨 및 냉장 해부 솔루션을 포함하는 새로운 배양 접시에 머리를 배치합니다. </li></ol></li><li> 내이의 해부 : <ol><li> 장소 오차가운 해부를 포함하는 멸균 실 가드 접시에 북동 배아 머리 </li><li> 솔루션입니다. ~ 1.6 배의 배율로 해부 현미경 작업, 눈 영역 (도 1a)에 또는 주위 가까이 Minutien 핀을 배치하여 배아 헤드를 고정시킨다. </li><li> 멸균 포셉 두 쌍을 사용하여 조심스럽게 피부를 제거하고 중간 선 (그림 1B)를 따라 등쪽에 두개골을 엽니 다. 두개강 및 시간 뼈에 위치한 내이가이 단계 (그림 1C, D)에서 확인할 수 있습니다에서 뇌를 제거합니다. 일반적으로 내측 귓전 존재 혈관의 라이닝은,이 단계 (도 1d)에서 내이를 식별하기위한 랜드 마크로서 사용될 수있다. </li><li> 조직 아래에있는 집게를 배치하고 차가운 해부 솔루션을 포함하는 새 접시에 두개골 및 전송의 기지에서 내이 (內耳)를 분리하여 시간적 뼈 안쪽 귀를 해부하다 (그림 1E, F). </li></ol></li></ol> 코르티 이식편 문화의 장기의 2 세대 주 :이 개발 단계에서 연골 조직되어 쉽게 집게를 사용하여 절개 될 수있다. <ol><li> 동양 복부 측면은 (그림 2A)을 위로 향하게 조심스럽게 내이 (그림 2B)의 전정 부분을 통해 Minutien 핀의 날카로운 끝을 삽입하여 내부 귀를 안정화되도록 내이. </li><li> 사용하여 초 미세 집게는 달팽이관 (그림 2C)에서 연골을 제거 조심스럽게 원창 근처 집게의 한쪽 끝을 사용하여 절개를하여 상부 연골을 오픈. 참고 :이 위에있는 연골이 때때로 아래에 긁어 기본 인공 와우 덕트에서 연골을 해제 폐쇄 집게를 사용하는 것이 도움이되는 경우에 인공 와우 덕트와 융합 될 때 집게가 연골에 너무 깊이 삽입되지 않도록하는 것이 중요하다 에스연골의 urface. 이런 개발 단계에서, 달팽이관 나선 길이 차례 만 사분의 삼이다. </li><li> 다음으로,베이스 또는 매우 정점에 하나, 인공 와우 덕트의 선호 지역에 집게를 배치하여 감각 상피를 노출, 부드럽게 달팽이관 (그림 2D)의 지붕을 잡아 당겨. 참고 : 달팽이관의 지붕은 분석을 방해 감각 상피 마스크 수를 완전히 제거해야합니다. 참고 :이 감각 상피가 찢어 쉽기 때문에이 절차는 조심스럽게 수행해야합니다. </li><li> 인공 와우 이식편의 기초가 균일하게 평면이되도록 마지막 단계로, 신중하게 노출 된 감각 상피에서 기본 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 집게를 사용 내이의 전정 부분에서 해부 달팽이관을 분리합니다. 이 단계 전이나 2.4 (도 2E) 후에 수행 될 수있다. </li><li> 지하 membra으로 해부하는 인공 와우 감각 상피로 이동네브라스카 매트릭스 코팅 문화가 아니라 1.5 mm 멸균 치우는 삽 (그림 2 층)를 사용. </li><li> 동양은 상피 세포의 내강 표면에 인공 절편이 위를 향하도록 조심스럽게 조직을 평평하고 부드럽게 접시에 추가하여 신선한 배양액 150 μL로 교체하는 기저막 매트릭스 DMEM 솔루션을 대기음. 케어는 각 절편이 코팅 된 유리 커버 슬립에 잘 부착 및 배양 배지에 떠 있지 않도록주의해야한다. 인공 절편 손상을 방지하기 위해 유리 웰에 부착하는 동안 포셉의 팁까지 지적되어 있는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 시간의 원하는 기간, 체외에서 일반적으로 3-6일 (DIV) 5 % CO 2와 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 멸균 150mm 배양 접시와 장소에 배양 접시를 전송합니다. 1 DIV 후, 인공 절편이 배양 접시에 잘 부착되었는지 확인하기 위해 해부 현미경으로 문화를 검사합니다. </li><li> 의 후시간의 원하는 길이에 대한 시험 관내에서 cubation는, 문화는 면역 조직 화학 염색에 대한 처리됩니다. 참고 : 절편 문화가 일반적으로 개발 단계, P0에 해당 6 DIV 동안 배양한다. 체외에서 배양 후, 문화가 면역 조직 화학 등 다운 스트림 응용 프로그램 (그림 3B)에 대해 처리 할 수있는, RT-PCR, 현장 하이브리드 및 / 또는 웨스턴 블롯에. </li></ol> 3. 일렉트로 매개 유전자 전달 <ol><li> 전기에 대한 설정 : <ol><li> 고압 증기 멸균 또는 약 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글에 의해 하나의 100mm를 실 가드 코팅 유리 접시를 소독하고 사용하기 전에 클린 벤치에서 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> 적절한 붙여서 또는 미디 준비 키트를 사용하여 선택의 발현 벡터에서 DNA를 준비합니다. 이 프로토콜에서 사용 된 발현 벡터 및 pIRES2-Atoh1.EGFP pCLIG-NeuroD1.EGFP이다. DNA의 최종 농도는 균 DNA가 적어도 1 ㎍ / μL되어야 /의 RNA 분해 효소가없는 물을. </li></ol></li><li> 배아 인공 외식에 DNA를 Electroporating : <ol><li> 신선한 100mm의 실 가드 코팅 접시에 플라스미드 DNA 용액 10 μl를 추가하고 DNA 용액에 (단계 2.5에서 얻은) 완벽 해부 인공 절편을 전송합니다. </li><li> 이 접시의면에 수직이다 있도록이 위를 향하도록 상피 세포의 내강 표면으로, 약간 달팽이관을 기울입니다. </li><li> 감각 상피과 달팽이관의 기지에 인접 긍정적 인 패들 (양극)으로 부정적인 패들 (음극)과 달팽이관의 양쪽에 전극 패를 놓습니다. 주 : DNA는 음으로 대전되기 때문에,이 정극과 감각 상피에 인접한 프로브의 캐소드 단부를 배치하여 음극으로부터 마이그레이션; DNA는 주로 감각 상피의 표면을 통해 이동합니다. </li><li> electroporator를 사용하여, 24 MV의 9-10 펄스를 제공, t에 발 페달 스위치를 30 밀리 초 펄스 지속 시간그는 electroporator 다음 일렉트릭 달팽이관에 따뜻한 문화 매체의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 반복하여 모든 인공 와우 외식과 관심의 모든 유전자의 DNA에 대한 3.2.1-4 단계 및 (단계 2.7) 도금의 기저막 매트릭스 코팅 접시에 일렉트릭 cochleae을 전송합니다. 다음 면역 세포 화학 처리됩니다 시간의 원하는 길이가 37 ° C, 5 % CO 2 가습 인큐베이터 문화 모든 일렉트릭 cochleae. 참고 : CD1 마우스 (약 8 ~ 12 새끼)의 전체 쓰레기에서 달팽이관은 고립 microdissected, 일렉트로 및 &lt;4 시간에서 도금 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 분석 달팽이 이식편 문화의 참고 : 문화는 일반적으로 개발 단계, P0에 해당 6 DIV 동안 배양한다. 체외에서 배양 후, 문화는 고정되어 면역 세포 화학 처리. <ol><li> Inc.의 원하는 길이 후ubation, 배지를 제거하고 신속 인산염 완충 식염수 (PBS)에 인공 이식편을 헹구고, 실온에서 15 분 동안 (PBS에서 제조) 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양한다. </li><li> 15 분 동안 세 번 추가 PBS에 의해 정착을 씻고 PBS에 헹군다. </li><li> 10 % 염소 혈청을 함유하는 PBS-T로 차단되기 전에 30 분 동안 PBS-T (PBS + 0.5 % 트윈)을 사용 Permeabilize 하시려면. </li><li> 4 ℃에서 하룻밤 1 % 염소 혈청 PBS-T에서 일차 항체를 포함하는 일차 항체 용액에 품어. </li><li> 적절한 알렉사 - 복합 이차 항체를 추가하기 전에 PBS-T 15 분을 각각 사용하여 실온에서 달팽이관을 세 번 씻으십시오. </li><li> 인공 절편 유리 커버 슬립에 배양이기 때문에 그것은 접시에서 커버 슬립을 분리하고 슬라이드에 장착하여 개별적으로 처리 할 수​​ 있습니다. 이것은 실온에서 적어도 1 시간 동안 용매 OS30에서 배양 접시를 담글함으로써 달성 될 수있다. 멸균 면도날을 사용하여 D에서 커버 슬립을 분리흉내과 슬라이드에 탑재하고 형광 현미경으로 시각화. </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

를 포함하여 마우스 내이의 멤브레인 미로 내의 모든 세포 감각, nonsensory과 나선 신경절 신경 세포가 모든 E8 10-14 주위에, 외배엽의 후뇌에 인접 otocyst placodally 유래에서 파생됩니다. E11에서 otocyst의 복부 영역은 달팽이관 덕트를 형성하기 위해 확장 및 개발이 계속되고,되어 달팽이관 내의 상피 세포에서뿐만 아니라 otocyst의 다른 영역들의 그룹은이어서 야기 할 것이다 prosensory 패치로 지정된 mechanosensory 유모 세포와 nonsensory 지원하는 세포의 다른 유형. 현상 달팽이관 내부 머리 셀의 하나의 행 및 외측 모세포 3 열의는 E15.5 주위 및 E17에 의해 식별 될 수 있고, 패터닝 내측 유모 세포, 기둥 세포 외 모발 세포 세 행의 행이 하나 본질적으로 완료 . 인공 덕트를 통해 제 E17 DIF 모두를 성장하기 시작 E11에서 걸쳐 시간 주기로ferent 세포의 운명 결정과 패터닝 모세포 및지지 세포의 정상적인 보완과 함께 눈에...

코르티의 포유류 기관은 두 가지 유형의 기계감각 유모 세포와 최소 네 가지 유형의 비감각 지원 세포를 포함한 특수 세포 유형의 모자이크로 구성되어 있어 증식, 운명 사양, 분화 및 패턴화와 같은 정상적인 세포 과정을 연구하는 데 이상적인 모델 시스템입니다. 또한 이러한 다양한 세포 유형의 정상적인 발달은 정상적인 청력 기능에 필수적입니다. 따라서 분자와 세포 모두에서 이들의 발달을 조절하는 요인을 이해하는 것이 중요합니다. 그러나 쥐 달팽이관의 크기가 작고 접근하기 어렵다는 점은 유전자 발현 연구에 특별한 도전이 되고 있습니다. 더욱이, 대부분의 세포 운명 명세화와 패턴화 사건은 배아 기간 동안 발생하며 대부분 출생 전에 완료됩니다. 따라서 배아 기간 동안 신호 전달 이벤트를 식별하고 특성화하는 것은 달팽이관 형태 형성의 분자적 기초에 대한 통찰력을 얻는 데 필수적입니다. 
여기에서는 배아 쥐 내이에서 온전한 달팽이관을 체외에서 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 기술을 사용하는 이유는 배양된 달팽이관이 분자 및 형태학적 특성을 유지하여 잠재적인 후보 유전자를 조사하고 달팽이관 형태 형성과 관련된 메커니즘을 탐색하는 데 유용한 모델을 제공한다는 것입니다. 유전자 발현 연구에 형질전환 마우스를 사용할 수 있지만, 특정 유전자 기능을 모니터링하기 위해서는 체외 시스템이 필요한 경우가 많습니다. 또한, 형질전환 마우스 배아에서 달팽이관 배양을 확립할 수 있으므로 다양한 용해성 인자 및 길항제에 대한 체외 발달 및 반응을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 13일째(E13)의 배아가 사용되지만, E12 또는 E14부터 출생 후 초기 내이까지의 배양도 유사한 결과를 제공할 수 있습니다. 
우리는 또한 구형파 전기천공법을 사용하여 배양된 배아 달팽이관 이식에서 유전자 전달 기술을 제시합니다. 달팽이관 이식을 분리한 후, 전기천공법을 사용하여 달팽이관 내 개별 세포에서 관심 유전자의 DNA 플라스미드를 발현할 수 있습니다. 이 기술은 세포 표현형의 기저에 있는 분자 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 형질전환 마우스를 활용하는 연구에 대한 보완적인 접근 방식으로 사용됩니다. 이 유전자 전달 방법을 사용하여 배아 달팽이관 내의 다양한 상피 세포 유형을 형질 주입하여 단일 세포 수준에서 기능 상실 및 이득 분석을 가능하게 합니다. 또한, 전기생리학적 연구는 달팽이관 이식 배양에서 수행될 수 있다8. 이 시험관 내 electroporation 방법은 상대적으로 간단하고 간단하며 조직에 대한 최소한의 손상과 결합되어 이 기술의 급속한 확장이 이루어졌습니다.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형된 매체</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin hydrochloride</td><td>Cellgro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>유리 접시 60 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23062-6015/23064-6015</td><td></td></tr><tr><td>유리 접시 100 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10015/23062-10015</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>펄스 발생기</td><td>Protech International Inc</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 배양 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 매트릭스</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>배양 접시, 60 x 15 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OS-30</td><td>Dow Corning</td><td>4021768</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 6</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6791</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 7a</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>TuJ1</td><td>시그마</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 explants의 문화 유전자 전송

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

코르티의 쥐 기관 내에 위치한 청각 유모 세포는 소리 정보를 감지하여 중추 신경계에 전달합니다. 기계감각 유모 세포는 한 줄의 내부 유모 세포와 달팽이관의 기저부에서 정점 축을 따라 확장되는 세 줄의 바깥쪽 유모 세포로 정렬되어 있습니다. 여기에 설명된 외식관 배양 기술은 배아 마우스 내이에서 인공와우 외식을 분리하고 유지하는 효율적인 방법을 제공합니다. 또한, 달팽이관 이식 배양 내에서 감각 유모 세포와 비감각 지원 세포의 형태 및 분자 특성은 생체 내에서 관찰된 것과 유사하며 고유한 세포 환경 내에서 연구할 수 있습니다. 인공와우 이식은 세포 사양 및 패터닝에 관여하는 분자 및 유전 경로의 식별 및 특성화를 위한 중요한 실험 도구 역할을 할 수 있습니다. 형질전환 마우스 모델이 유전자 발현 연구에 효과적인 접근 방식을 제공하지만, 상당한 수의 마우스 돌연변이가 배아 발달 중에 죽어 발달 표현형의 분석 및 해석을 방해합니다. 출생 전에 죽은 돌연변이 쥐의 코르티 기관을 배양하여 체외 발달 및 다양한 요인에 대한 반응을 분석할 수 있습니다. 또한, 특정 유전자를 하향 조절 또는 과발현하고, 잠재적인 내인성 기능을 분석하고, 특정 유전자 산물이 포유류 달팽이관 발달에 영향을 미치기 위해 필요하거나 충분한지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있는 배아 달팽이관 이식을 생체 외에서 전기천공하는 기술에 대해 설명합니다1-8.

본 연구에서는 배아 내이에서 와우를 분리하고 미세 절제하여 감각 상피를 노출시키는 방법을 설명합니다. 절제된 와우는 손상되지 않은 와우관 형태로 플레이트에 도말하여 배양할 수 있으며(그림 3), 면역조직화학 염색을 통해 분석할 수 있습니다. 이렇게 배양된 와우 외식편은 다양한 수용성 인자와 약물이 와우 발달에 미치는 영향을 조사하는 유용한 분석법을 제공합니다. 와우 외식편을 절제한 후, 전기천공법을 사용하여 관심 유전자를 이소성으로 발현시키고, 이것이 와우 형태 형성 과정에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 E13 내이에서 유래된 배양 와우 외식편에 basic helix-loop-helix (bHLH) 전사 인자인 Atoh1을 강제 발현시키면 이소성 유모 세포가 형성됨을 보여줍니다. 이와 대조적으로, GER 내의 전감각 세포 및 비감각 상피 세포에 또 다른 bHLH 전사 인자인 NeuroD1을 강제 발현시키면 이소성 신경세포가 형성됩니다.
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우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다. 또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

이 절차의 목표는 마우스 배아, 달팽이관 외(exvivo)를 배양하고 전기 조작하는 것입니다. 형태 형성 분화 및 성장 현상을 포함하여 달팽이관 발달의 다양한 측면을 연구하기 위해 먼저 13일 배아 마우스 배아에서 머리를 채취하여 이를 수행합니다. 다음으로, 뇌를 제거하여 내이를 노출시키고 두개골 기저부에서 분리하여 발달 중인 측두골로부터 분리시킵니다.그런 다음 위에 있는 연골을 제거하고 달팽이관을 열어 달팽이관의 감각 상피를 얻습니다. 마지막 단계는 최대 일주일 동안 전기천공법을 사용하거나 사용하지 않고 절개된 달팽이관을 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 임플란트는 라이브 셀 이미징 또는 고정 면역 염색을 위해 분석될 수 있으며 컨포칼 이미징, 마우스 배아의 배양에 의해 분석될 수 있습니다.Cochlear explan은 증식, 황산염 사양, 발달 중인 달팽이관의 극성과 같은 기관 형성의 다양한 측면과 이러한 이벤트가 성장 및 분화에 어떻게 기여하는지 연구할 수 있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 따라서 이 기술을 사용하면 약리학적 조작을 수행하고 생체 외 유전자 기능을 모니터링할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 전기천공법을 통한 유전자 전달과 결합되어 관심 유전자의 발현을 변경하고 단일 세포 수준에서 그 기능을 모니터링할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 E 13 마우스 배아 머리를 냉간 해부 용액이 들어 있는 멸균 소가 접시에 넣습니다. 해부 현미경으로 눈 부위 주위에 미세한 핀을 배치하여 배아 머리를 고정시킵니다. 그런 다음 두 쌍의 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 피부를 제거하고 정중선을 따라 등쪽의 두개골을 엽니다.그런 다음 두개강에서 뇌를 제거합니다. 측두골 내에 위치한 내이는 주변 혈관 내벽을 통해 확인할 수 있습니다. 다음으로, 조직 아래에 집게를 놓고 두개골 기저부에서 내이를 분리하여 측두골에서 내이를 해부합니다.그 후, 절개된 내이를 차가운 해부 용액이 담긴 새 접시에 옮깁니다. 이제 복부 쪽이 위를 향하도록 내이의 방향을 잡습니다. 전정부를 통해 미누친 핀의 날카로운 끝을 부드럽게 삽입하여 내이를 안정시킵니다.매우 미세한 집게를 사용하여 타원형 창 근처를 절개하여 위에 있는 연골을 잘라냅니다. 위에 있는 연골은 때때로 달팽이관과 융합되므로 겸자가 연골에 너무 깊숙이 삽입되지 않도록 하십시오. 그런 다음 달팽이관에서 연골을 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 겸자를 달팽이관의 기저부 또는 정점에 놓고 달팽이관 지붕을 부드럽게 당겨 감각 상피를 노출시킵니다. 마지막 단계로, 노출된 감각 상피에서 기저부의 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 달팽이관 돌출부의 기저부가 평평해지도록 합니다. 그런 다음 절개된 달팽이관을 내이의 전정 부분에서 분리하십시오.여분의 조직을 제거하기 위해 추가 세척이 필요한 경우 1.5mm 멸균 스쿠퍼를 사용하여 절개된 달팽이관 감각 상피를 기저막 매트릭스 코팅된 배양 웰로 옮기고 이 단계에서 이를 수행할 수 있습니다. 그런 다음 상피의 내강 표면이 위를 향하도록 달팽이관 계획의 방향을 지정합니다. 기저막 매트릭스 DMEM 용액을 흡입하여 조직을 조심스럽게 평평하게 만들고 150마이크로리터의 신선한 배양 배지를 접시에 부드럽게 추가합니다.각 x explan a가 코팅된 유리 커버 슬립에 잘 부착되고 배양 매체에 떠다니지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 마이크로 절개된 달팽이관을 멸균된 150mm 배양 접시에 부드럽게 옮기고 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 3-6DIV.1D IV 후 해부 현미경으로 배양물을 검사하여 달팽이관 엑스플랜이 배양 접시에 잘 부착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 전기천공을 위해 설정하기 위한 면역조직화학을 위해 처리하기 전에 원하는 기간 동안 in vivo에서 배양액을 계속 배양합니다. 먼저 100mm 시가 코팅 유리 접시 하나를 고압멸균하거나 70% 에탄올에 약 20분 동안 담가 살균합니다.그런 다음 사용하기 전에 깨끗한 벤치에서 자연 건조하십시오. 이제 적절한 maxi 또는 MIDI 준비 키트를 사용하여 선택한 발현 벡터에서 DNA를 준비합니다. 이 프로토콜에 사용되는 발현 벡터는 H one expression construct 및 neuro D one expression construct입니다.그리고 DNA의 최종 농도는 멸균 DNA RNA에서 마이크로리터당 최소 1마이크로그램이어야 하며, DNA를 enic 달팽이관 설명문으로 전기 작동시키기 위한 자유수여야 합니다. 100mm 시가 코팅된 신선한 접시에 10마이크로리터의 혈장 DNA 용액을 추가합니다. 그런 다음 완전히 절개된 달팽이관 엑스플랜을 상피의 내강 표면이 위를 향하도록 하여 DNA 용액으로 옮깁니다.달팽이관을 접시의 평면에 수직이 되도록 약간 기울입니다. 다음으로, 음극 패들을 감각 상피 쪽으로 배치하고 양극 패들을 전기기를 사용하여 달팽이관 바닥 옆에 놓습니다. 24mV, 30밀리초 펄스 지속 시간의 9-10개 펄스를 제공합니다.그런 다음 100마이크로리터의 따뜻한 배양 배지를 전기 정격 달팽이관에 추가합니다. 모든 달팽이관 계획과 모든 관심 유전자의 DNA에 대해 절차를 반복한 후 전기 등급의 달팽이관을 도금을 위해 기저막 매트릭스 코팅 접시로 옮깁니다. 그런 다음 모든 전기 등급 달팽이관을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 원하는 기간 동안 배양한 다음 면역 세포 화학을 위해 처리합니다.이 이미지는 TH one, EEG FP 또는 neuro D one EGFP 리포터로 전기천공된 야생형 CD one 마우스 펍의 배아 13일차 인공와우를 보여줍니다. 그들은 유모 세포 특이적 마커, anti myo seven A 또는 뉴런 마커 2 대 1로 빨간색으로 표시된 면역 표지되었습니다. EGFP 발현으로 시각화할 수 있는 전기 등급 세포는 더 큰 상피 융기, 더 작은 상피 융기 및 감각 상피 세포 전체에서 볼 수 있습니다.5개의 DIV가 수지상 돌기로 신경 표현형을 획득한 후 neuro D one이 형질주입된 달팽이관 상피 세포를 형성했으며, 이들 대부분은 2개의 1 또는 T oh H 1에 대해 양성이었습니다. 형질주입된 세포는 myo seven에 대해 양성이었습니다. 표현 일단 숙달되면이 기술은 8-10 팝의 인텔 리터에 대해 3-4 시간 안에 완료 할 수 있습니다.이를 통해 해부 배양, 전기천공법 및 엑스플랜 도금을 위한 충분한 시간을 확보할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한...

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

우리는 배양된 세포를 초기 마우스 배아의 정의된 부위에 이식하여 생체 내 잠재력을 결정하는 방법을 보여줍니다. 또한 알려진 직경의 유리 모세혈관을 사용하는 최적화된 전기천공법(electroporation method)을 도입하여 배아의 몇 개의 세포에 외인성 DNA를 정확하게 전달할 수 있습니다.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

배우세요 배아 마우스 달팽이 explant 배양 및 전기천공을 이용한 유전자 전달 방법. 이 기술은 청각 기관 발생과 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

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