Name: Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Découvrez l'intubation intratrachéale médiation (IMIT) pour l'étude des maladies respiratoires chez la souris. Cette méthode non invasive permet une distribution précise et reproductible d'inoculums bactériens directement aux poumons.

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Les auteurs sont reconnaissants du soutien des plateformes du Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller et Jennifer Kraenzle) et de la microbiologie (Daniel Cramer et Julie Sotsky). Ce travail a été soutenu par un financement des NIH (HHSN272201000033I à M.B.L et J.M.W.).

NOTE: Toutes les procédures décrites ici ont été examiné et approuvé par l&#39;Université de Louisville Comité institutionnel de biosécurité (protocole N ° 13 à 056) et institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (protocole # 13-064). 1. Préparation du colorant <ol><li> Diluer à 0,1% (p / v) de bleu de Coomassie dans du PBS et stériliser par filtration à l&#39;aide d&#39;un filtre à seringue de 0,45 uM. </li></ol> 2. Préparation de la culture de Pseudomonas aeruginosa <ol><li> 15 heures avant l&#39;instillation, inoculer 3 ml de bouillon de culture avec une seule colonie bactérienne. </li><li> Cultiver la culture 15 heures à 37 ° C sur un agitateur (200 rpm). </li><li> Centrifugeuse 1 ml de culture dans un tube de 1,5 ml à centrifuger 12 000 g pendant 30 sec. </li><li> Retirez le support et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS. </li><li> Diluer une partie aliquote de la suspension de pâte bactérienne 1:10 dans du PBS et mesurer la DO 600 de la suspension bactérienne diluée pour déterminer laconcentration bactérienne. </li><li> Diluer la suspension bactérienne dans du PBS à la concentration souhaitée de l&#39;inoculum bactérien, en utilisant un volume de 50 ul de livraison pour l&#39;inoculation IMIT. </li></ol> 3. IMIT instillation <ol><li> Placer un groupe de souris dans la chambre d&#39;induction d&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane et anesthésier en utilisant un 2 - mélange isoflurane / oxygène de 3%. </li><li> A l&#39;apparition initiale de la sédation, la nuque la souris, la souris maintien en position verticale, et d&#39;administrer 10 ul d&#39;une solution de lidocaïne à 2% en aiguille de gavage à l&#39;arrière de la gorge et permettre à la solution de drainer vers le bas à l&#39;épiglotte. Retour de la souris à la chambre de l&#39;anesthésie. <ol><li> Prévoir un minimum de 5 min pour permettre la lidocaïne à prendre pleinement effet comme un anesthésique local. </li></ol></li><li> Lorsque les souris ont atteint le niveau désiré de sédation (taux de ~ 60 bpm à respirer), réduire l&#39;isoflurane à 2% pour maintenir la sédation. </li><li> colorant de précharge ou inoculum bactérien dans 250 pi étanche aux gazseringue ajustement de précision avec une longue aiguille émoussée 22 G. <ol><li> Première dresser 150 pi de l&#39;air, mesurée par le piston en téflon de la seringue. Ensuite, dessinez en hausse de 50 ul d&#39;inoculum en avançant le piston en téflon de la barre des 150 pi à la marque de 200 pi sur le corps de la seringue. NOTE: Lorsque l&#39;échantillon est éjecté dans une souris intubé, la suspension de 50 pi sera livré en premier, suivi par un pl coussin d&#39;air 150 qui distribuera l&#39;inoculum dans l&#39;ensemble du poumon. </li></ol></li><li> Retirer une souris de la chambre de l&#39;induction et de jeter sur le dos sur une plate-forme d&#39;intubation. Fixer la souris pour la plate-forme en accrochant ses incisives avec un joint torique attaché à bande Velcro, et la fixation du velcro à la plate-forme. Levez la souris pour une pente de 45 °. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un coton micro applicateur, retirer la langue avec un mouvement de roulement, en utilisant la main dominante. </li><li> Avec la main non dominante, utiliser un ajustement otoscope fonctionnant avec un spéculum d&#39;intubation à la fois maintain langue rétraction et de visualiser la glotte. </li><li> Avec la main dominante, utiliser un fil de guidage enfilée à travers un G cathéter 20 à intuber la souris, d&#39;un coin du cathéter jusqu&#39;à une profondeur de 10 mm dans la trachée de souris (cathéter est en forme d&#39;un manchon en silicone avec 10 mm de cathéter exposé). Retirez le otoscope / spéculum. </li><li> Assurez-vous que la souris a été correctement intubé en fixant le cathéter avec la main non dominante tout en attachant une longueur brièvement connecté Luer de 1/16 &quot;tube transparent contenant un colorant. NOTE: Le colorant sera rapidement migrer et venir en réponse à la respiration. </li><li> Ne pas procéder à des étapes ultérieures si la confirmation de l&#39;intubation n&#39;a pas été établie à ce stade. Si l&#39;intubation a tenté a échoué, réinitialiser le fil de cathéter et le guide pour une tentative supplémentaire d&#39;intubation. REMARQUE: Il est déconseillé de tenter plus de deux intubations d&#39;une souris dans une seule session sans causer un traumatisme à la souris. </li><li> Continuer àfixer le cathéter avec la main non dominante tout en insérant la seringue de précision / aiguille émoussée contenant le liquide coussin suspension / air. </li><li> Verser le liquide / air directement dans les poumons dans un seul mouvement fluide et retirer immédiatement l&#39;aiguille / cathéter de la souris. </li><li> Retour de la souris dans une cage et permettre la récupération de l&#39;anesthésie. </li></ol> 4. Caractérisation des IMT livraison <ol><li> Après IMIT instillation, euthanasier la souris en CO 2 asphyxie à un post-inoculation de temps approprié. </li><li> Fixer la souris euthanasiés sur une planche de dissection et faire tremper la poitrine et l&#39;abdomen avec EtOH à 70% en utilisant un vaporisateur. </li><li> Si l&#39;évaluation de la distribution d&#39;un agent de formation d&#39;image à travers le poumon, retirer les poumons de l&#39;animal en utilisant une technique stérile et afficher les poumons comme approprié pour l&#39;imagerie. REMARQUE:. Poumons peuvent être préparés pour les techniques de coloration histologique supplémentaires grâce à la fixation ou la cryoconservation approprié &lt;/ Li&gt; <li> Si l&#39;évaluation de la charge bactérienne du tissu pulmonaire infecté, retirez les poumons de l&#39;animal en utilisant une technique stérile. La place poumons dans un stérile, préalablement pesé 1 sac de prélèvement des oz. Peser et noter le poids de l&#39;échantillon sac + poumons. <ol><li> Ajouter 1 ml de PBS stérile 1x pour chaque échantillon sac + tissus. Refermer le sac de l&#39;échantillon. </li><li> Homogénéiser les tissus par les douces ondulations une pipette de 25 ml sérologique sur l&#39;échantillon + sac tissu. </li><li> Générer des dilutions en série de l&#39;homogénat de poumon dans du PBS stérile et plaque sur plaque de gélose (LB, ou le cas échéant à des espèces bactériennes étudiées): <ol><li> Réaliser une dilution en série six fois en un demi-fond plaque de 96 puits par Pipettes multicanaux puis la plaque échantillons en triple par multicanaux sur la plaque de gélose. </li></ol></li><li> Incuber les plaques de gélose pendant une nuit à 37 ° C et dénombrer les unités formant des colonies le jour suivant. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+function+of+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

IMIT instillation offre des améliorations importantes aux modèles de maladies respiratoires existantes dans la capacité d&#39;inculquer reproductible réactifs directement dans les poumons. Il est une approche rapide qui est idéalement situé pour une équipe de deux chercheurs, l&#39;un des qui gère la logistique de l&#39;anesthésie et de mise en cage, et l&#39;autre qui exécute la technique de la GI-TI. De grandes études peuvent être réalisées à l&#39;aide IMIT avec un engagement de temps moyen de 2 - 3 min par souris. Parce que l&#39;approche fait usage de l&#39;isoflurane comme anesthésique, les souris récupérer rapidement de l&#39;anesthésie, la réduction du temps de garde des animaux de surveillance grâce à la récupération. L&#39;aspect le plus difficile techniquement de la méthode de la GI-TI est la première étape de l&#39;intubation souris. Les personnes qui apprennent à effectuer IMIT sont en mesure de se concentrer sur cette première étape de la pose du cathéter et veiller à ce que l&#39;intubation a été réalisé grâce à la confirmation visuelle de mouvement de colorant. L&#39;avantage de cette approche est que poumon-specIFIC instillation est garantie grâce à l&#39;utilisation de la confirmation de l&#39;intubation, ce qui augmente la confiance à la fois du nouveau chercheur ainsi que l&#39;expert de tenter d&#39;intuber un animal difficile. Les éléments clés de l&#39;optimisation de la probabilité d&#39;une intubation sont: i) la réalisation d&#39;un sédation profonde pour laisser le temps de travail suffisant, ii) le placement correct de la spéculum dans la bouche pour permettre une bonne visualisation de l&#39;épiglotte, iii) le placement de bonne profondeur de la spéculum de sorte que la langue reste en retrait tout au long de la procédure, et iv) l&#39;utilisation de la plate-forme basculante pour soutenir les mains du chercheur ainsi que la procédure se déroule détendu et avec une approche stable. Une des limites de la procédure de IMIT est liée à la fréquence des événements IMIT d&#39;instillation. À cause du traumatisme potentiel associé à une intubation raté, il est déconseillé de plus de deux tentatives d&#39;intubation être effectuées en une seule séance (jusqu&#39;à deux accidents). IMITa un excellent potentiel dans sa capacité à être utilisé pour fournir des traitements dans les poumons de souris, les schémas thérapeutiques mais qui font usage de livraison très fréquent de réactif dans les poumons peuvent ne pas convenir pour la GI-TI. Il est possible que la GI-TI pourrait être utilisé tous les jours pour fournir des réactifs dans un poumon de souris sans causer de traumatisme important, mais que lorsqu&#39;ils sont réalisés par un chercheur hautement qualifié, comme la majorité des traumatismes liés à l&#39;intubation est pensé pour être associé à un événement d&#39;intubation manquer . Cette IMIT haute fréquence doit être discuté avec les vétérinaires locaux et IACUC. Une limitation potentielle supplémentaire de la GI-TI est la taille de la souris qui est intubé. La procédure de IMIT décrit ci-dessus a été développé en utilisant des souris d&#39;environ 17 à 22 g, où un cathéter de 20 G a été trouvé être d&#39;une taille adaptée à la trachée de souris dans cette gamme de tailles. Grandes cathéters ont été utilisés avec succès chez la souris âgées; le développement initial de la GI-TI made utilisation d&#39;un cathéter 18 G dans souris BALB / c qui sont&gt; 20 g. Il est important, si les tailles de cathéters de remplacement sont utilisées, les aiguilles doivent être franches qui proviennent adapter à la lumière du cathéter et sont coupés à une longueur qui étend seulement 1 mm au-delà de l&#39;extrémité du cathéter. Intubation de souris plus petites que 17 g peut être possible mais pas recommandé en raison de l&#39;expertise requise, et nécessitait l&#39;utilisation de cathéters plus petits et spéculums sont que décrit ci-dessus. Nous avons utilisé IMIT pour la livraison de plusieurs agents pathogènes des voies respiratoires, en plus de P. aeruginosa, y compris B. pseudomallei 9 et 10 Klebsiella pneumoniae. Le modèle de la GI-TI a fait d&#39;importants progrès pour nos études de B. maladies respiratoires pseudomallei, après avoir identifié que l&#39;inoculation intranasale entraîne, une morbidité URT-connexe début de souris plutôt que le critère de la maladie systémique observée dans la maladie humaine 9. B. pseudomallei est un Tier 1 Select l&#39;agent de l&#39;impact de la biodéfense, et que ces modèles de maladies respiratoires, sont en cours d&#39;élaboration pour l&#39;exposition aux aérosols qui modèles liés à la biodéfense un itinéraire potentiel d&#39;entrée pour les agents pathogènes en armes. Parce que les modèles courants d&#39;aérosol entraîner une infection à la fois l&#39;URT et TLR, les mêmes potentiels phénotypes de morbidité début nous avons identifié pour le modèle intranasale de B. maladies respiratoires pseudomallei peut demander au modèle d&#39;aérosol. Une adaptation future du modèle de la GI-TI pourrait être une administration par aérosol intubation médiation (IMAD), dans laquelle des souris sont intubé pour livraison cible d&#39;aérosol dans les poumons seulement. Ventilateurs mécaniques sont actuellement disponibles pour maintenir l&#39;anesthésie isoflurane, qui pourrait être adapté pour fournir un, plutôt que sur la base liquide, défi de l&#39;agent pathogène en aérosol. IMIT a été développé initialement comme une approche pour optimiser la distribution des bactéries dans les poumons, mais a aussi une application pour la fourniture d&#39;autres réactifs dans les poumons de souris. Comme disjuré ci-dessus, l&#39;administration intranasale de composés chez des souris se traduit par une faible efficacité, livraison très variable des réactifs dans l&#39;organe cible du poumon. L&#39;administration intranasale de positons tomographie par émission (PET) réactifs d&#39;imagerie dans les poumons de souris a donné une livraison efficacité de 40% 11, alors que nous avons démontré que la GI-TI offre une excellente alternative à d&#39;autres la livraison du poumon approches avec son&gt; 98% d&#39;efficacité de la livraison et de la distribution multilobaire. Cette amélioration de la délivrance ciblée dans le poumon a le potentiel d&#39;augmenter la reproductibilité de la libération de produits thérapeutiques pour le traitement de maladies pulmonaires. IMIT pourrait de même offrir des avantages aux études de: i) l&#39;impact des irritants pulmonaires environnement, ii) cancer du poumon études phénotypiques, iii) siRNA spécifiques poumon knock-down.

Les souris ont été utilisés pour modéliser les nombreuses manifestations pathologiques chez l&#39;homme, comprenant une multitude de maladies respiratoires. Des modèles de maladies de substitution sont souvent incapables de récapituler tous les aspects d&#39;une maladie modélisé, typiquement en raison des différences physiologiques importantes ou immunitaires dans les deux modèles d&#39;accueil. Ainsi, le but d&#39;améliorer les systèmes de modèle est de développer des approches qui permettent à des substituts reflètent plus étroitement un processus de maladie ou réponse de l&#39;hôte comme on l&#39;observe dans le système hôte d&#39;origine. Il existe plusieurs différences physiologiques importantes entre les souris et les humains dans le mécanisme par lequel ils inspirer l&#39;air. Parmi ces différences sont des différences significatives ratiométriques de taille entre l&#39;URT et LRT. Il a été estimé que les souris possèdent&gt; 100 fois la RUT surface par rapport à l&#39;être humain, contre normalisée totale de 1,2 capacité pulmonaire. Ainsi, les cornets nasaux de la souris permettent plus vaste filtrage de l&#39;air inspiré à faciliter une plus grande vitesse de breathing, qui peut avoir un impact significatif sur les études de pneumonie en cas d&#39;infection de la cavité nasale joue un rôle important dans la progression de la maladie. Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris pour étudier les maladies respiratoires de l&#39;homme-comme. La plus courante de ces approches est l&#39;inoculation intranasale, dans lequel une suspension liquide est appliquée à une ou aux deux narines de souris. Bien que relativement simple, mises en garde telles que le volume d&#39;instillation et le type d&#39;anesthésie utilisé peut influer sur le rendement de l&#39;instillation dans la LRT par inoculation intranasale 3-5. Plus précisément, Miller et al. ont montré que l&#39;instillation intranasale de Francisella tularensis des volumes de moins de 50 pi n&#39;a pas abouti à l&#39;instillation des bactéries dans le TLR 6. Ils ont observé en outre mieux instillation de TLR lors de l&#39;utilisation de l&#39;isoflurane inhalé par opposition à injection de kétamine / xylazine pour l&#39;anesthésie. Cependant, notre expérience avec Yersinia pestis inoculation intranasale indique inoculation plus cohérente peut être réalisé en utilisant la kétamine / xylazine par rapport à l&#39;isoflurane (MBL, données non publiées). Ces différences pourraient être attribuées à des agents pathogènes ou utilisé à des variations dans les procédures de laboratoire, mais surtout mettre en évidence la variabilité potentielle de cette technique. En outre, les poumons récoltés peu de temps après l&#39;instillation intranasale montrent qu&#39;un pourcentage relativement faible de l&#39;inoculum bactérien initial atteint le poumon (dans le cas de Y. pestis, seulement 10% ont été récupérés 1 heure après l&#39;instillation 7), ce qui suggère qu&#39;un grand nombre de bactéries pourraient être retenus dans le TRS (ou avalé dans le tractus gastro-intestinal). Dans certains modèles de maladies, ce dépôt important de bactéries sur la muqueuse de l&#39;URT peut confondre notre compréhension de la progression de la maladie si l&#39;organisme est capable de coloniser la cavité nasale murin d&#39;une manière incompatible avec la maladie humaine. Par exemple, en utilisant in vivo &lt;/ Em&gt; imagerie, il a été observé que pseudomallei, qui ne colonise pas l&#39;URT humaine, provoque une infection opportuniste écrasante de la cavité nasale de souris lors de la livraison par la méthode d&#39;instillation intranasale 8. D&#39;autres procédés pour inculquer des bactéries dans les poumons de souris ont également été utilisés dans la recherche des maladies infectieuses. Cependant, par rapport à l&#39;instillation intranasale ces méthodes ont tendance à exiger plus de compétences techniques et / ou des équipements coûteux sans pour autant éliminer le risque d&#39;infection initiation à plusieurs sites (par exemple, aérosol [URT et TLR]; transorale [tube digestif et TLR]; et intra-trachéale chirurgicale [LRT et sang]). Compte tenu des complications potentielles qui pourraient être associés à des sites secondaires de l&#39;infection, nous avons cherché à développer une approche intra-trachéale qui contourne l&#39;URT et offre pathogène directement dans les poumons de souris anesthésiées, mais limite également inoculat involontaireions dans le sang ou du tube digestif. À cette fin, intratrachéale (GI-TI) instillation d&#39;intubation médiation a été conçu comme une procédure non chirurgicale qui garantit LRT instillation d&#39;inoculum en incluant une étape intermédiaire pour vérifier le placement de cathéter approprié avant l&#39;instillation. Cette méthode est décrite à l&#39;aide de colorant instillation de démontrer visuellement large répartition de l&#39;inoculum dans tout le poumon, et P. aeruginosa instillation de mettre en évidence la livraison très efficace (&gt; 98% de l&#39;inoculum) de cette méthode pour le poumon. Surtout, alors que développé à l&#39;origine pour la livraison bactérienne, IMIT propose également un outil efficace pour: i) l&#39;instillation de diverses molécules à l&#39;étude d&#39;autres modèles de maladies respiratoires, ii) la prestation thérapeutique spécifique du poumon, et iii) des études de la fonction pulmonaire de base, y compris ciblé délivrance d&#39;ARNi dans les poumons.

<table><tbody><tr><td>Rongeur, Tilting WorkStand</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>La base doit être détachée lorsque vous travaillez dans une tête d’otoscope de fonctionnement BSC</td></tr><tr><td></td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoscope 3.5 V Li Battery</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Specula short, Autoclavable</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Boucles d’incisives</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur en coton à pointe fine</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp ;</td><td>Utilisé pour la rétraction de la langue</td></tr><tr><td>Cathéter IV, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>En option : monter un manchon en silicone avec une surface de cathéter exposée de 10 mm</td></tr><tr><td>Seringue étanche aux gaz, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Utilisé pour l’administration d’inoculum liquide par aiguille émoussée IMIT</td></tr><tr><td>, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Couper à la longueur pour dépasser de 1 mm du cathéter 20 G</td></tr><tr><td>Fil de guidage (fil à fibre optique, 0,5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Coupe à 6 » de longueur : utilisé comme fil-guide pour l’intubation</td></tr><tr><td>Seringue à tuberculine, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Assembler avec du fil à fibre optique comme fil de guidage</td></tr><tr><td>Bleu brillant R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tube Tygon, 1/16"</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Luer mâle 1/16 » barbillon</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Luer femelle 1/16 » barbillon</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaïne, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH lidocaïne en solution à 2 % (p/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Sac d’échantillon, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond en U 96 puits,</td><td>Greiner</td><td>stérile 650161</td><td></td></tr></tbody></table>

intubation médiation intratrachéale (gi-ti) instillation: un système de distribution non invasive, lung-spécifique

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Études sur les maladies respiratoires impliquent généralement l&#39;utilisation de modèles murins que les systèmes de substitution. Cependant, il existe des différences physiologiques importantes entre la souris et l&#39;appareil respiratoire humain, en particulier dans leurs voies respiratoires supérieures (URT). Dans certains modèles, ces différences dans la cavité nasale de souris peuvent avoir un impact significatif sur la progression de la maladie et de la présentation dans les voies respiratoires inférieures (LRT) lors de l&#39;utilisation des techniques d&#39;instillation intranasale, limitant potentiellement l&#39;utilité du modèle de souris pour étudier ces maladies. Pour ces raisons, il serait avantageux de développer une technique d&#39;inculquer bactéries directement dans les poumons de souris pour étudier la maladie de TLR en l&#39;absence d&#39;implication de l&#39;URT. Nous avons appelé cette technique spécifique intratrachéale de livraison intubation médiation (GI-TI) instillation du poumon. Cette technique non invasive réduit au minimum le potentiel pour instillation dans la circulation sanguine, ce qui peut se produire au cours de trad plus invasivechirurgicales approches onal intratrachéales d&#39;infection, et limite la possibilité de livraison digestif accessoire de l&#39;appareil. IMIT est un processus en deux étapes dans lequel les souris sont d&#39;abord intubés, avec une étape intermédiaire pour assurer le placement correct du cathéter dans la trachée, suivis par l&#39;insertion d&#39;une aiguille émoussée dans le cathéter de médiation livraison directe de bactéries dans les poumons. Cette approche facilite une efficacité de livraison&gt; 98% dans les poumons avec une excellente distribution de réactif dans l&#39;ensemble du poumon. Ainsi, IMIT représente une nouvelle approche pour étudier les maladies de TLR et administration de produits thérapeutiques directement dans les poumons, l&#39;amélioration de la capacité d&#39;utiliser la souris comme substituts pour étudier les maladies respiratoires chez les humains. En outre, la précision et la reproductibilité de ce système de livraison rend également prête à des normes de pratique de laboratoire (BPL) bons, ainsi que la livraison d&#39;une large gamme de réactifs qui doivent être livrés à haute efficacité pour les poumons.

Pour visualiser la distribution de matériel instillé par la méthode de la GI-TI, 50 pi de 0,1% colorant bleu de Coomassie Brilliant a été instillé dans les poumons d&#39;une souris anesthésiée. La souris a été immédiatement euthanasié et les poumons ont été prélevés par autopsie stérile. La figure 1 montre que le colorant a été remis à tous les lobes du poumon. Pour déterminer la quantité de bactéries remis aux poumons par la méthode de la GI-TI, trois groupes de souris (n = 3) ont été instillées avec trois concentrations différentes de P. aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7, et 1,21 x 10 6 unités formant des colonies [CFU] par 50 pi). Immédiatement après l&#39;instillation IMIT, les souris ont été euthanasiées, les poumons retirés, et le nombre de bactéries ont été énumérés et comparés à des inoculums (figure 2). Livraison de l&#39;inoculum est très efficace par cette méthode, avec&gt; 98% de l&#39;inoculum récupéré à partir des poumons de instilléles animaux. En outre, IMIT instillation était hautement reproductible quelle que soit la concentration de l&#39;inoculum (R2 = 0,9951). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Figure 1: IMIT instillation distribue inoculum à travers les poumons Les poumons de souris instillées avec 50 ul de 0,1% de Coomassie colorant bleu Bleu de spectacle distribués dans tous les lobes.. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Figure 2:. IMIT instillation de bactéries dans les poumons des souris ont été instillées avec P. aeruginosa et le nombre de bactéries inculquées dans les poumons (log 10 UFC - récupéré) ont été comparées à l&#39;inoculum estimée (log 10 UFC - livré). Chaque cercle représente la CFU / poumon d&#39;une souris individuelle (n = 3 pour chaquedose bactérienne).

L&#39;intubation trachéale à médiation (IMIT) instillation de réactifs est une excellente méthode non invasive pour l&#39;étude de la maladie respiratoire, ainsi qu&#39;un procédé pour inculquer réactifs thérapeutiques directement dans le poumon. Il est une méthode rapide et hautement reproductible qui est approprié pour des essais précliniques.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des bactéries de manière non invasive directement dans les poumons des souris. Pour ce faire, il suffit de charger d’abord un coussin d’air de 150 microlitres dans une seringue étanche au gaz, puis de 50 microlitres de la suspension bactérienne préparée. Dans la deuxième étape, une souris anesthésiée est intubée à l’aide d’un cathéter de calibre 20 à l’aide d’un fil-guide pour faciliter la mise en place.Ensuite, après avoir confirmé le succès de l’intubation à l’aide d’un simple débitmètre, l’inoculum bactérien est administré par le cathéter directement dans le poumon à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 22. En fin de compte, l’inoculation intratrachéale médiée par intubation ou l’inoculation omission peut être utilisée pour étudier les maladies des voies respiratoires inférieures chez la souris, évitant ainsi l’implication concomitante des voies respiratoires supérieures. Le principal avantage de l’imit par rapport aux méthodes d’inoculation internasale est que cette technique permet une administration précise et reproductible d’un inoculum directement dans les poumons.Parce que l’IIT est une technique non chirurgicale, elle réduit également le risque de complications associées aux procédures chirurgicales intratrachéales. Bien que cette méthode puisse fournir un mécanisme fiable pour délivrer des bactéries dans les poumons afin d’étudier la pathogenèse, l’IMA peut également être appliquée à l’administration d’autres réactifs, tels que les composés environnementaux pour étudier les lésions pulmonaires, l’administration ciblée de traitements pour le traitement et l’administration de sondes d’imagerie ou l’ARNS pour étudier la biologie pulmonaire de base. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à passer l’étape d’intubation, car celle-ci nécessite un positionnement minutieux de l’animal et l’autoscope pour l’insertion du fil-guide.La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car la mise en place initiale du fil-guide dans la trachée est conceptuellement difficile à décrire aux nouveaux chercheurs. 15 heures avant l’installation, inoculez trois millilitres de culture de bouillon avec une seule colonie bactérienne et cultivez la culture à 37 degrés Celsius et un agitateur à 200 tr/min. Après 15 heures, faites tourner un millilitre de cellules dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre et suspendez à nouveau le palais dans un millilitre de PBS.Ensuite, mesurez une dilution de un à 10 de la suspension bactérienne à une DO de 600 pour déterminer la concentration bactérienne. Diluez ensuite les cellules bactériennes dans le PBS à la concentration souhaitée de bactéries par 50 microlitres d’inoculum. Pour l’installation de l’IIT, les souris sont préparées pour l’IIT en administrant une solution de lidocaïne à 2 % à une souris légèrement anesthésiée par des souris à l’aiguille de gavage.Un retour à l’anesthésie pendant que la lidocaïne fait effet. Maintenant, aspirez 150 microlitres d’air dans une seringue de résurgence de type gaz de 250 microlitres, équipée d’une longue aiguille émoussée de calibre 22. Ensuite, faites passer le piston en téflon de la marque de 150 microlitres à la marque de 200 microlitres sur le corps de la seringue pour aspirer 50 microlitres de l’inoculum bactérien lorsque la seringue est chargée.LA, une souris sous sédation en décubitus dorsal sur une plate-forme d’intubation sécurisant l’animal par les incisives sur un sans anneau attaché à une bande velcro reliée à la plate-forme. Soulevez la souris à une inclinaison de 45 degrés, puis utilisez un applicateur en micro coton pour rétracter la langue avec un mouvement de roulement avec la main dominante. Ensuite, avec la main non dominante, utilisez un otoscope opératoire ajusté avec un spéculaire d’intubation pour maintenir la rétraction de la langue et visualiser l’épiglotte.Ensuite, en tenant un fil de guidage enfilé dans un cathéter de calibre 20 dans la main dominante, intubez la souris à une profondeur de 10 millimètres dans la trachée et retirez l’otoscope. Fixez le cathéter avec la main non dominante. Ensuite, fixez brièvement au cathéter une longueur de leurre reliée à un 16e tube transparent contenant un colorant coloré.Le colorant doit migrer rapidement d’avant en arrière en réponse à la respiration de l’animal lorsque l’animal a été intubé avec succès. Insérez l’aiguille émoussée de calibre 22 dans le cathéter et distribuez l’inoculum directement dans le poumon en un seul mouvement de fluide. Ensuite, retirez immédiatement l’aiguille et le cathéter de l’animal et remettez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à ce que l’animal soit complètement rétabli de l’anesthésie.Pour évaluer la charge bactérienne du tissu pulmonaire infecté, retirez les poumons à l’aide d’une technique stérile et placez le tissu dans un sac d’échantillon stérile pré-pesé d’une once. Après avoir pesé le sac d’échantillon et les poumons, ajoutez un millilitre de PBS stérile au tissu et revendez le sac d’échantillon. Ensuite, roulez doucement une pipette sérologique de 25 millilitres sur le sac d’échantillon pour homogénéiser le tissu.Retirez le tissu connecté à travers un filtre mural en polyester stérile et traitez l’homogénat avec du tritton X 100 à une concentration finale de 1 % pour libérer les bactéries. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, effectuez une dilution en série de six fois de l’homogénat dans une plaque à puits UBO 96. Ensuite, utilisez un multicanal à huit puits pour plaquer l’homogénat triplicate de 10 aliquotes de microlitres sur une plaque de gélose LBA.Enfin, incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius et énumérez les unités formant colonie le lendemain. L’administration de la bactérie est très efficace via cette méthode, avec plus de 98 % de l’inoculum de pseudomonas aerogen récupéré dans les poumons des animaux instillés dans cette expérience représentative. De plus, l’installation de l’IIT est hautement reproductible quelle que soit la concentration de l’inoculum administré.Pour visualiser la distribution du matériau instillé via la méthode IIT, 50 microlitres de colorant bleu brillant Kumasi à 0,1 % peuvent être délivrés dans les poumons, comme cela vient d’être démontré pour l’inoculum. A noter, la distribution du colorant à tous les lobes du poumon Une fois maîtrisée. Cette méthode peut être réalisée rapidement avec une équipe de deux chercheurs dans un temps moyen de deux à trois minutes, y compris l’anesthésie, l’inoculation de l’IMA et la récupération de l’anesthésie.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas faire plus de deux tentatives infructueuses pour intuber la souris. L’échec de l’intubation peut entraîner un traumatisme potentiel en insérant le cathéter dans l’œsophage plutôt que dans la trachée. De nombreux agents pathogènes respiratoires, y compris ceux nécessitant un confinement abs L trois, peuvent être efficacement administrés par imed car cette procédure peut être effectuée, comme le démontrent les enceintes de sécurité et en outre par les chercheurs portant une protection respiratoire complète, y compris un écran facial.Nous avons démontré qu’imit est une méthode très précise et efficace pour l’administration de matériaux directement dans les poumons de souris. Ces propriétés rendent imit bien adapté aux études de type GLP qui nécessitent des systèmes de modèles hautement reproductibles.

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Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux

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Découvrez l'intubation intratrachéale médiation (IMIT) pour l'étude des maladies respiratoires chez la souris. Cette méthode non invasive permet une distribution précise et reproductible d'inoculums bactériens directement aux poumons.

Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

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