Intubation médiation intratrachéale (GI-TI) instillation: un système de distribution non invasive, Lung-spécifique

L’objectif global de cette procédure est d’administrer des bactéries de manière non invasive directement dans les poumons des souris. Pour ce faire, il suffit de charger d’abord un coussin d’air de 150 microlitres dans une seringue étanche au gaz, puis de 50 microlitres de la suspension bactérienne préparée. Dans la deuxième étape, une souris anesthésiée est intubée à l’aide d’un cathéter de calibre 20 à l’aide d’un fil-guide pour faciliter la mise en place.

Ensuite, après avoir confirmé le succès de l’intubation à l’aide d’un simple débitmètre, l’inoculum bactérien est administré par le cathéter directement dans le poumon à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 22. En fin de compte, l’inoculation intratrachéale médiée par intubation ou l’inoculation omission peut être utilisée pour étudier les maladies des voies respiratoires inférieures chez la souris, évitant ainsi l’implication concomitante des voies respiratoires supérieures. Le principal avantage de l’imit par rapport aux méthodes d’inoculation internasale est que cette technique permet une administration précise et reproductible d’un inoculum directement dans les poumons.

Parce que l’IIT est une technique non chirurgicale, elle réduit également le risque de complications associées aux procédures chirurgicales intratrachéales. Bien que cette méthode puisse fournir un mécanisme fiable pour délivrer des bactéries dans les poumons afin d’étudier la pathogenèse, l’IMA peut également être appliquée à l’administration d’autres réactifs, tels que les composés environnementaux pour étudier les lésions pulmonaires, l’administration ciblée de traitements pour le traitement et l’administration de sondes d’imagerie ou l’ARNS pour étudier la biologie pulmonaire de base. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à passer l’étape d’intubation, car celle-ci nécessite un positionnement minutieux de l’animal et l’autoscope pour l’insertion du fil-guide.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car la mise en place initiale du fil-guide dans la trachée est conceptuellement difficile à décrire aux nouveaux chercheurs. 15 heures avant l’installation, inoculez trois millilitres de culture de bouillon avec une seule colonie bactérienne et cultivez la culture à 37 degrés Celsius et un agitateur à 200 tr/min. Après 15 heures, faites tourner un millilitre de cellules dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre et suspendez à nouveau le palais dans un millilitre de PBS.

Ensuite, mesurez une dilution de un à 10 de la suspension bactérienne à une DO de 600 pour déterminer la concentration bactérienne. Diluez ensuite les cellules bactériennes dans le PBS à la concentration souhaitée de bactéries par 50 microlitres d’inoculum. Pour l’installation de l’IIT, les souris sont préparées pour l’IIT en administrant une solution de lidocaïne à 2 % à une souris légèrement anesthésiée par des souris à l’aiguille de gavage.

Un retour à l’anesthésie pendant que la lidocaïne fait effet. Maintenant, aspirez 150 microlitres d’air dans une seringue de résurgence de type gaz de 250 microlitres, équipée d’une longue aiguille émoussée de calibre 22. Ensuite, faites passer le piston en téflon de la marque de 150 microlitres à la marque de 200 microlitres sur le corps de la seringue pour aspirer 50 microlitres de l’inoculum bactérien lorsque la seringue est chargée.

LA, une souris sous sédation en décubitus dorsal sur une plate-forme d’intubation sécurisant l’animal par les incisives sur un sans anneau attaché à une bande velcro reliée à la plate-forme. Soulevez la souris à une inclinaison de 45 degrés, puis utilisez un applicateur en micro coton pour rétracter la langue avec un mouvement de roulement avec la main dominante. Ensuite, avec la main non dominante, utilisez un otoscope opératoire ajusté avec un spéculaire d’intubation pour maintenir la rétraction de la langue et visualiser l’épiglotte.

Ensuite, en tenant un fil de guidage enfilé dans un cathéter de calibre 20 dans la main dominante, intubez la souris à une profondeur de 10 millimètres dans la trachée et retirez l’otoscope. Fixez le cathéter avec la main non dominante. Ensuite, fixez brièvement au cathéter une longueur de leurre reliée à un 16e tube transparent contenant un colorant coloré.

Le colorant doit migrer rapidement d’avant en arrière en réponse à la respiration de l’animal lorsque l’animal a été intubé avec succès. Insérez l’aiguille émoussée de calibre 22 dans le cathéter et distribuez l’inoculum directement dans le poumon en un seul mouvement de fluide. Ensuite, retirez immédiatement l’aiguille et le cathéter de l’animal et remettez la souris dans sa cage avec surveillance jusqu’à ce que l’animal soit complètement rétabli de l’anesthésie.

Pour évaluer la charge bactérienne du tissu pulmonaire infecté, retirez les poumons à l’aide d’une technique stérile et placez le tissu dans un sac d’échantillon stérile pré-pesé d’une once. Après avoir pesé le sac d’échantillon et les poumons, ajoutez un millilitre de PBS stérile au tissu et revendez le sac d’échantillon. Ensuite, roulez doucement une pipette sérologique de 25 millilitres sur le sac d’échantillon pour homogénéiser le tissu.

Retirez le tissu connecté à travers un filtre mural en polyester stérile et traitez l’homogénat avec du tritton X 100 à une concentration finale de 1 % pour libérer les bactéries. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, effectuez une dilution en série de six fois de l’homogénat dans une plaque à puits UBO 96. Ensuite, utilisez un multicanal à huit puits pour plaquer l’homogénat triplicate de 10 aliquotes de microlitres sur une plaque de gélose LBA.

Enfin, incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius et énumérez les unités formant colonie le lendemain. L’administration de la bactérie est très efficace via cette méthode, avec plus de 98 % de l’inoculum de pseudomonas aerogen récupéré dans les poumons des animaux instillés dans cette expérience représentative. De plus, l’installation de l’IIT est hautement reproductible quelle que soit la concentration de l’inoculum administré.

Pour visualiser la distribution du matériau instillé via la méthode IIT, 50 microlitres de colorant bleu brillant Kumasi à 0,1 % peuvent être délivrés dans les poumons, comme cela vient d’être démontré pour l’inoculum. A noter, la distribution du colorant à tous les lobes du poumon Une fois maîtrisée. Cette méthode peut être réalisée rapidement avec une équipe de deux chercheurs dans un temps moyen de deux à trois minutes, y compris l’anesthésie, l’inoculation de l’IMA et la récupération de l’anesthésie.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas faire plus de deux tentatives infructueuses pour intuber la souris. L’échec de l’intubation peut entraîner un traumatisme potentiel en insérant le cathéter dans l’œsophage plutôt que dans la trachée. De nombreux agents pathogènes respiratoires, y compris ceux nécessitant un confinement abs L trois, peuvent être efficacement administrés par imed car cette procédure peut être effectuée, comme le démontrent les enceintes de sécurité et en outre par les chercheurs portant une protection respiratoire complète, y compris un écran facial.

Nous avons démontré qu’imit est une méthode très précise et efficace pour l’administration de matériaux directement dans les poumons de souris. Ces propriétés rendent imit bien adapté aux études de type GLP qui nécessitent des systèmes de modèles hautement reproductibles.