Name: Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Découvrez la différenciation de l'épithélium pigmentaire rétinien à partir de cellules iPS en contrôlant la taille des corps embryonnaires. Cette méthode optimise le rendement cellulaire pour la recherche rétinienne et les applications thérapeutiques.

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Les opinions ou affirmations contenues dans ce document sont les opinions personnelles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou comme reflétant les vues du ministère de l’Armée ou du ministère de la Défense. Cette recherche a été réalisée alors que les auteurs Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene et Jae-Hyek Choi occupaient une bourse d’associé de recherche postdoctorale du Conseil national de recherches du Canada à l’USAISR. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche en médecine clinique de réadaptation (CRMRP) et le programme de recherche en médecine opérationnelle militaire (MOMRP) de l’armée américaine.

1. Préparation des réactifs culture et la culture Plaques <ol><li> Préparer milieu de culture cellulaire de la tige sans alimentation par addition de 100 ml de supplément gratuit de sérum 5x à 400 ml de cellules souches milieu de base. Le milieu est stable à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois. </li><li> Ajouter 10 uM solution de rho-associée, à enroulement en spirale contenant la protéine kinase (Rock) inhibiteur disponible dans le commerce corps embryoïdes (EB) support de formation (Y-27362). </li><li> Préparer un milieu de différenciation par addition de 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 10% de remplacement de sérum KO (KSR) et 10 ug / ml de gentamicine pour Modified Eagle Medium l&#39;Mélange / nutritive de Dulbecco F-12 (DMEM / F12). </li><li> Préparer milieu iPS-RPE en ajoutant 1x N1 supplément, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 250 ug / taurine ml, 13 ng sel de sodium / ml de triiodo-L-thyronine, de 20 ng / ml d&#39;hydrocortisone, 5 ug / ml de gentamicine et 15% de sérum bovin fœtal (FBS) &lt;sup&gt; 21 à milieu essentiel minimum de Eagle (MEM). Ajuster le pH à 7,4. </li><li> Préparer le sel de sodium solution stock triiodo-L-thyronine. Dissoudre 1 mg de sel de sodium triiodo-L-thyronine à 1 N d&#39;hydroxyde de sodium en remuant doucement. Ajouter 49 ml de MEM pour faire 50 ml de 20 pg / ml de sel de sodium triiodo-L-thyronine. Préparer des aliquotes et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour atteindre la concentration souhaitée dans du milieu de culture final. </li><li> Préparer hydrocortisone solution stock. Solubiliser 1 mg d&#39;hydrocortisone dans 1 ml d&#39;éthanol 100% par agitation douce. Ajouter 19 ml de MEM pour faire 20 ml de 50 pg / ml de solution d&#39;hydrocortisone stock. Aliquoter et congeler à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour obtenir la concentration désirée dans le milieu de culture final. </li><li> Préparer une solution de travail de dispase de 1 mg / ml dans du DMEM / F12. </li><li> Préparation de plaques de matrice revêtu <ol><li> Préparer matrice de protéine extraite de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucellules de sarcome soi dans DMEM / F12 à 0,08 mg / ml. Manteau de chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits avec 1 ml de la solution de la matrice. Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Après l&#39;incubation de 1 h, aspirer l&#39;excédent DMEM / F12. Ajouter 0,5 ml de souches milieu de culture cellulaire dépourvu d&#39;alimentation-pour éviter le dessèchement des puits. Les plaques de matrice revêtu sont prêts à l&#39;emploi. </li></ol></li><li> Préparer des plaques de microtitration, en rinçant chaque puits avec 2 ml de DMEM / F12. Retirer DMEM / F12 et ajouter 0,5 ml de milieu de formation EB complété avec un inhibiteur de rock à chaque puits. Centrifuger la plaque à 2000 g pendant 5 min pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Préparer du tampon de coloration FACS en mélangeant 2% de FBS et 0,09% d&#39;azide de sodium dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajuster le tampon à pH 7,4. </li><li> Préparer la solution de neutralisation de la trypsine par addition de 10% de FBS DMEM / F12. </li></ol> 2. iPS Culture <ol><li> Avant iPS cellules ensemencement, chaleureux souches milieu de culture cellulaire dépourvu d&#39;alimentation à 37 ° C, et ont la matrix plaques enduites de prêt. </li><li> Dégeler rapidement les cellules iPS IMR90-1 dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Ensuite, retirez le cryo-flacon du bain d&#39;eau et essuyez le flacon avec 70% d&#39;éthanol. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml en utilisant une pipette 2 ml de réduire au minimum la rupture des agglomérats de cellules. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu de culture chaude cellules souches sans alimentation à cellules goutte à goutte et mélanger délicatement. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension attentivement les amas de cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire de la tige sans chargeur-et épépiner les amas de cellules dans les puits de la plaque de matrice revêtu. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO2, 95% d&#39;humidité. </li><li> Changer le milieu de culture de cellules iPS quotidienne. Observez colonies indifférenciées de cinq à sept jours après l&#39;ensemencement. Vérifiez colonies indifférenciées qui sont prêts pour le passage (colonies avec un centre dense) sous un microscope optique. </li></ol> 3. Le repiquage des cellules iPS <ol><li> Au passage les cellules iPS Avant de commencer, réchauffer la solution de dispase, DMEM / F12 et la tige milieu de culture cellulaire dépourvu d&#39;alimentation à 37 ° C au bain-marie. </li><li> Avant de passage de cellules iPS, retirez tous les domaines de la différenciation en grattant la zone et en aspirant le milieu. Rincer soigneusement les cellules iPS avec 2 ml de DMEM / F12. </li><li> Ajouter 1 ml de 1 mg / ml de dispase à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 7 min. Aspirer le dispase et rincer délicatement les colonies de cellules avec 2 ml de DMEM / F12 deux fois. Après rinçage, ajouter 2 ml de milieu de culture de cellules souches des liaisons de connexion dans chaque puits. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette de 5 ml gratter doucement les colonies de la plaque pour former des amas de cellules. Transférer les amas de cellules individuelles dans un tube conique de 15 ml. Ajouter souches milieu de culture cellulaire dépourvu de chargeur-suffisante pour ensemencer le prochain passage de cellules. </li></ol> 4. Génération d&#39;EBS Utilisation Micropuits Plaques <ol><li> Préparation d&#39;une suspension cellulaire unique de cellules iPS <ol><li> Retirez le medium à partir des cellules iPS et rincer les cellules iPS avec 2 ml de DMEM / F12. Ajouter 750 pi de Accutase à cellules iPS à chaque puits de la plaque de 6 puits. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pour permettre aux cellules de se détacher de la plaque (environ 5 à 10 min). </li><li> Utiliser une pipette pour dissocier doucement toutes les cellules restantes et à détacher les cellules restant sur la surface de la plaque. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml. Rincer la plaque avec 5 ml de DMEM / F12 et combiner le DMEM / F12 avec rincé les cellules dans le tube conique. Faire passer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour éliminer les grumeaux de cellules résiduelles possibles. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante pour enlever le Accutase. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de formation EB sorte que la concentration en cellules est d&#39;environ 0,5 à 1,0 x 10 7 cellules / ml. </li><li> Déterminer le nombre de cellules viables par comptage des cellules avec du bleu trypan et un hémocytomètre. </li></ol></li><li> Adjustindensité cellulaire g dans des micropuits pour former EB grandeur contrôlée <ol><li> Ajuster le nombre de cellules dans chaque puits de la plaque à micropuits pour générer les tailles désirées EB. Ajouter des cellules dans les puits des plaques préparées à l&#39;étape 1.9, Répartir les cellules par pipetage doucement les cellules à plusieurs reprises. NOTE: Nombre de cellules nécessaires par puits = désiré nombre de cellules par EB x nombre de micropuits par puits. </li><li> Réglez le support de formation EB complété avec un inhibiteur de rock dans les puits à un volume final de 2,0 ml. Redistribuer les cellules par pipetage doucement chaque puits. Centrifuger les microplaques à 100 g pendant 3 min. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d&#39;humidité pendant 24 heures. </li></ol></li><li> EB de récolte des microplaques <ol><li> Récolte EB de micropuits par pipetage milieu des puits de haut en bas avec une micropipette 1 ml pour éliminer la plupart des EBS. Passez la suspension EB à travers une cellule de 40 um inversépassoire sur le dessus d&#39;un tube conique de 50 ml, pour éliminer les cellules simples. </li><li> Laver la microplaque cinq fois avec 1 ml de DMEM / F12 pour supprimer tous les EBS. Recueillir lavages et passez le tamis cellulaire inversée. Tournez le tamis cellulaire droite jusqu&#39;à un nouveau 50 ml tube conique. Recueillir les EB par lavage avec un milieu de formation EB. Comptez EBS pour déterminer le rendement. </li></ol></li></ol> 5. Placage EB et différenciation Initier <ol><li> EBS sur les plaques à matrice protéique revêtu des plaques six puits (comme à l&#39;étape 1.8.1) à une densité de &lt;1000 EB / puits dans du milieu de formation EB inhibiteur de roche, plus de 10 uM. Incuber les EB à 37 ° C avec 5% de CO2 et 95% d&#39;humidité pendant 24 heures. </li><li> 24 heures après EB placage, remplacer par un milieu de différenciation pour initier la différenciation. Changer la moitié du milieu de différenciation tous les deux jours jusqu&#39;à ce que les cellules sont collectées pour analyse ultérieure. </li><li> Prélever des échantillons à jour 6, 17, 29 et 60 à faire RT-PCR, immunocytochemistry et FACS pour valider l&#39;expression des gènes et des protéines caractéristiques de l&#39;EPR. </li></ol> 6. Extraction de l&#39;ARN et PCR <ol><li> Extraire l&#39;ARN à partir des échantillons EB selon les instructions fournies dans le kit disponible dans le commerce. Déterminer la concentration de l&#39;ARN en utilisant un spectrophotomètre. </li><li> Effectuer transcription inverse sur 100 ng d&#39;ARN total selon l&#39;ARN disponible dans le commerce à l&#39;ADNc kit de transcription inverse. </li><li> Effectuer la PCR avec 10 ng d&#39;ADNc en utilisant les amorces suivantes (tableau 1) à une concentration de 10 umol / 10 ng d&#39;ADNc. Régler la PCR comme suit: dénaturation de l&#39;ADN à 95 ° C pendant 5 min, 35 cycles avec amplifier à 95 ° C pendant 15 sec, 60 ° C pendant 30 sec, 72 ° C pendant 1 min, suivi d&#39;un cycle final à 72 ° C pendant 10 min. Exécuter le produit de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1%. </li></ol> 7. Immunocytochimie <ol><li> Laver les EB avec du PBS deux fois à la température ambiante. Fixer les EBS RT chez 4% paraformaldehyde pendant 10 min. Rincer une fois avec PBS à température ambiante. Conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu&#39;à utilisés pour la coloration. </li><li> Le jour coloration, traiter les cellules fixes avec fixation et perméabilisation réactifs. Incuber les échantillons avec une solution de blocage (sérum de chèvre à 10% dans une solution de perméabilisation) pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Effectuer immunochimie dans du sérum de chèvre à 10% dans une solution de perméabilisation en utilisant les anticorps primaires suivants aux dilutions indiquées: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), et anti- ZO1 (1: 100). Incuber les échantillons avec des anticorps O / N correspondant à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, retirez l&#39;anticorps primaire à partir des cellules et rincer les échantillons trois fois avec PBS. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Retirer l&#39;anticorps secondaire à partir des cellules et rincer les échantillons trois fois dans du PBS. Montez le couvercle glisse sur des lames de verre avec du DAPI contenant un milieu de montage et permettent de mettre en échantillons O / N dans une chambre sombre.Utilisation d&#39;un microscope à fluorescence pour visualiser la coloration. </li></ol> 8. coloration pour l&#39;analyse FACS <ol><li> Laver les EB cultivées en PBS deux fois. Incuber les EB avec 0,5 ml de trypsine à 0,25% pendant 5-10 min pour obtenir une suspension cellulaire unique. Neutraliser la trypsine avec une solution de neutralisation de la trypsine (1 ml / puits). </li><li> Transférer la suspension cellulaire unique dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 600 g pendant 10 min. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 10 ml de DMEM / F12 pour les cellules dans le tube. Inverser doucement pour mélanger les cellules. Centrifugeuse à 600 x g. Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de coloration FACS. </li><li> Comptez le nombre total de cellules. Centrifuger à 600 g pendant 10 min. Après centrifugation Rejeter le surnageant. Fixer les cellules immédiatement en ajoutant 0,5 ml de paraformaldéhyde 4%. Mélangez bien au vortex douce. Incuber les cellules à 4 ° C pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 600 g pendant 10 min et retirez lasurnageant. Vortex doucement à perturber le culot cellulaire. Perméabiliser les cellules en ajoutant 1 ml de solution de perméabilisation refroidi. Vortex légèrement pour bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Centrifuger à 600 g pendant 10 min et éliminer le surnageant. Ajouter 3 ml de FACS tampon de coloration et remettre en suspension. Répétez cette étape pour une fois de plus. Remettre en suspension les cellules dans un tampon de coloration FACS à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Transférer 100 pl de la suspension de cellules (0,5 x 10 6 cellules) à chacun des tubes de microcentrifugation et ajouter le volume recommandé de l&#39;anticorps primaire. Pour Pax6, ajouter 5 ul de PE anti-Pax6 dans 100 ul de suspension cellulaire. Pour MITF, ajouter 5 ul d&#39;anti-MITF dans 100 ul de suspension cellulaire. </li><li> Mélanger et incuber à température ambiante pendant 60 min. Ajouter 3 ml de tampon de coloration FACS. Mélanger et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et répéter 8,16 pour deux fois supplémentaires. </li><li> Pour MITF coloration, incuber les cellules dans Antibo secondairedy, de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 à une dilution de 1: 2000 pendant 1 heure à 4 ° C. Pour Pax6 coloration, éviter cette étape. </li><li> Laver les cellules avec 5 ml de tampon de coloration FACS et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Répétez le processus pour deux fois plus. </li><li> Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de coloration FACS et vortexer doucement pour perturber le culot cellulaire. Les échantillons sont prêts pour l&#39;analyse par cytométrie en flux. </li></ol> 9. iPS-RPE Isolement et culture <ol><li> Au jour 29, couper soigneusement autour des colonies pigmentées sélectionnés de la plaque de culture à l&#39;aide d&#39;une pipette de 200 pi. Transférer les colonies flottantes dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les colonies à 600 g pendant 10 min à température ambiante et retirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les colonies de cellules dans 10 ml de DMEM / F12 et centrifuger à 600 g pendant 10 min. Eliminer le surnageant. </li><li> Préparer une suspension de cellules uniques en faisant incuber les colonies avec 2 ml de trypsine à 0,25% à 37 ° C pendant 7-10 min. Vortexer doucement la suspension de cellules de dissocier les colonies. </li><li> Neutraliser le trypsine en ajoutant 2 ml de milieu iPS-RPE. Centrifuger à 600 g pendant 10 min et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules individuelles dans 2 ml de milieu iPS-RPE. Transférer les cellules dans une matrice protéique recouvert de plaque à 6 puits et placer dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d&#39;humidité. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour réaliser pleinement les promesses des cellules souches pluripotentes pour la thérapie cellulaire, il est nécessaire de réglementer leur différenciation d&#39;une manière cohérente et reproductible. Ce rapport décrit les protocoles pour former EB grandeur contrôlée en utilisant la technologie de la plaque micropuits, engager la différenciation vers EPR et identifier des marqueurs de protéines et de gènes de RPE. Pour synchroniser la différenciation in vitro, tailles homogènes d&#39;EBS ont été formés par un...

Souches pluripotentes (iPS) induites sont un type de cellules souches pluripotentes dérivées par la reprogrammation des cellules adultes avec des facteurs extrinsèques 1. En revanche, les cellules souches embryonnaires (CSE), un autre type de cellules souches pluripotentes, sont générés à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste 3.2. Malgré leurs origines différentes, les cellules iPS et les CES sont comparables dans leur capacité illimitée de reproduire in vitro et dans leur capacité à se différencier en tout type de cellule 4-5. Ces caractéristiques de cellules iPS en font des candidats idéaux pour des applications en médecine régénérative personnalisée. Récents efforts de recherche sont axées sur l&#39;élaboration de protocoles de différenciation robustes pour produire des cellules adultes spécialisées, y compris épithélium pigmentaire rétinien (EPR) 6-11. Pour les applications cliniques potentielles de cellules iPS dérivées, une différenciation dirigée pour ce type de cellule spécifique est indispensable. Il existe différentes méthodespublié pour la différenciation dirigée des deux cellules iPS en CES et RPE qui varie grandement dans leur efficacité 6-7, 12-16. Nous ne savons pas encore beaucoup d&#39;événements moléculaires qui régissent le sort de cellules / tissus au cours du développement ou de la différenciation. Au cours des dernières années, des efforts ont été faits pour développer le protocole de différenciation qui peut imiter le développement embryonnaire dans la mesure du possible. Pendant la phase de blastocyste, non engagé population de cellules souches sont ensemble dans un micro-environnement en trois dimensions. Ainsi, diverses stratégies ont été appliquées pour rendre les cellules ESC / iPS assemblés et les cultiver en trois dimensions. Ces agrégats de cellules souches sont appelées corps embryoïdes (EBS). Des études ont montré que la différenciation EB de cellules souches imiter stade précoce du développement embryonnaire et peut spontanément donner lieu à endoderme primitif sur sa surface extérieure. Plus tard, le développement EB progresse, les phénotypes de cellules différenciées de tous les trois lignées germinales apparaissent 17-18. Therefore, protocoles de différenciation basée EBS ont attiré beaucoup d&#39;attention à la différenciation in vitro de cellules ESC / iPS et sont un bon candidat pour la production de l&#39;EPR à partir de cellules souches pluripotentes 13. EB peuvent être faites en utilisant plusieurs méthodes à partir de cellules / iPS ESC. Initialement, EB ont été faites par raclage des colonies adhérentes et les maintenir dans une culture en suspension non adhérent. Cependant, cette approche donne population hétérogène de EB qui entraîne une faible reproductibilité. Hanging culture cellulaire de chute et micropuits formation EB base existe d&#39;autres techniques populaires pour la formation EB qui donnent EB homogènes de tailles définies qui sont hautement reproductible. En outre, la technique de microtitration peut produire un grand nombre d&#39;agrégats avec moins d&#39;effort. Différenciation des cellules à l&#39;intérieur EB est régulée par un multiplex de signaux morphogéniques de l&#39;microenvironnement extracellulaire et intracellulaire. Contrairement à la différenciation dans un LUN.Format olayer, EBS fournir une plate-forme pour l&#39;assemblage complexe de cellules et de signalisation intercellulaire de se produire 17. Fait intéressant, le nombre de cellules souches pluripotentes utilisés pour fabriquer EB individuels a été observée pour influencer le destin des cellules. Par exemple, dans une étude de la différenciation hématopoïétique des CES humains, il a été observé que 500 cellules EB une différenciation vers la lignée myéloïde des cellules alors que 1000 EB poussé vers lignée érythroïde 20. Dans une autre étude, les petites EB favorisé la différenciation de l&#39;endoderme alors que les grandes EB promus vers la différenciation neuro-ectoderme 11, 17. Ces études antérieures suggèrent fortement que le nombre de cellules ESC / iPS utilisés pour fabriquer EB individuels affecte les EB différenciation en fonction de tous les types de cellules. Cependant, à notre connaissance, il ne existe pas d&#39;études actuelles qui ont élucidé l&#39;impact de la taille EB dans sa propension à se différencier vers RPE. Le but de cette étude est de caractériser l&#39;influence deEB taille sur souches pluripotentes induites (iPS) - l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (iPS-RPE) différenciation et d&#39;identifier le nombre de cellules optimale pour faire EBS pour la différenciation dirigée vers RPE lignée.

<table><tbody><tr><td>Milieu mTeSR1 + supplément 5x</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibiteur de roche)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-7154</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH30853.01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de remplacement Life</td><td>Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM media</td><td>Life Technologies</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplément</td><td>Sigma</td><td>N-6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fœtus bovins sérum</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine sodium&nbsp ; sel</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Hyclone(Fisher)</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 plaque</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>27940</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Perméabilisation Kit</td> BD <td>Biosciences</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>souris Anti-anticorps PAX6</td><td>Études de développement Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anticorps anti-RX</td><td>Abcam</td><td>Ab23340</td><td></td></tr><tr><td>Souris&nbsp ; Anticorps anti-MITF</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-772-P</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anticorps anti-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy plus</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Promega</td><td>M7502</td><td></td></tr><tr><td>Kit ARN à ADNc haute capacité</td><td>Life Technologies</td><td>4387406</td><td></td></tr></tbody></table>

découlant épithélium pigmentaire rétinien (epr) à partir de souches pluripotentes induites (ips) de différentes tailles de corps embryoïdes

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Les cellules souches pluripotentes possèdent la capacité de proliférer indéfiniment et de se différencier en presque n’importe quel type de cellule. De plus, le développement de techniques pour reprogrammer les cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) a suscité de l’intérêt et de l’enthousiasme pour la possibilité d’une médecine régénérative personnelle personnalisée. Cependant, l’efficacité de la différenciation des cellules souches vers une lignée souhaitée reste faible. Le but de cette étude est de décrire un protocole pour dériver l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules iPS (iPS-RPE) en appliquant une approche d’ingénierie tissulaire pour générer des populations homogènes de corps embryoïdes (EB), un intermédiaire commun lors de la différenciation in vitro. Le protocole applique la formation de tailles spécifiques d’EB à l’aide de la technologie des plaques à micropuits. Les méthodes d’identification des marqueurs protéiques et géniques de l’EPR par immunocytochimie et réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR) sont également expliquées. Enfin, l’efficacité de la différenciation dans différentes tailles d’EB surveillées par l’analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des marqueurs EPR est décrite. Ces techniques faciliteront la différenciation des cellules iPS en EPR pour de futures applications.

Dans cette expérience, les cellules iPS ont été cultivées et différenciées dans la lignée de l&#39;EPR d&#39;EBS. EbS de tailles contrôlées ont été formés en utilisant des plaques micropuits. Comme on le voit sur ​​la figure 1 la formation EB était homogène dans les plaques de microtitration. Ces EB ont ensuite été recueillies et étalées sur des plaques à 6 puits (figure 2). RPE peuvent être identifiées par leur morphologie hexagonale classique, la pigmentat...

L&#39;objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes.

Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

L’objectif général de cette procédure est de caractériser l’influence de la taille du corps embryonnaire sur la différenciation de l’EPR à partir des cellules IPS afin d’orienter la différenciation du corps de l’embryon vers la lignée EPR. Pour ce faire, on utilise d’abord la technique des micropuits pour générer des corps embryonnaires homogènes de tailles définies. Dans la deuxième étape, la différenciation dirigée des cellules IPS est initiée vers la lignée rétinienne, puis les cellules I-P-S-R-P-E sont identifiées et isolées.Dans la dernière étape, les cellules I-P-S-R-P-E sont enrichies et développées. En fin de compte, les cellules I-P-S-R-P-E peuvent être analysées pour leur expression de marqueurs spécifiques I-P-S-R-P-E. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la différenciation spontanée, est que notre technique donne un taux de RP plus élevé. Cette matière peut aider à optimiser la différenciation dirigée des cellules IPS vers la lignée RP.Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies dégénératives de la rétine telles que la dégénérescence maculaire, la rétinite figmentaire ou la maladie de Stargardt. Étant donné que le remplacement de l’EPR malade par un EPR sain dérivé de cellules IPS peut être la meilleure option pour prévenir la perte de vision, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront généralement du mal car les cellules souches sont très délicates et des changements subtils dans leur poignée peuvent affecter le processus de différenciation. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’étape de prélèvement du corps embryonnaire à partir du micro-ondes est difficile.Avant l’ensemencement, réchauffez le milieu de culture de cellules souches libres nourricières à 37 degrés Celsius, puis réchauffez rapidement les cellules IPS IMR 90 dash one dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules sont décongelées, ajoutez cinq millilitres de culture de cellules souches exemptes de nourriture chaude, milieu aux cellules, goutte à goutte et mélangez doucement. Ensuite, faites tourner les cellules, puis remettez soigneusement en suspension les amas de cellules dans deux millilitres de culture de cellules souches libres de nourricier.Ensemencez les amas dans des puits individuels d’une plaque recouverte d’une matrice, puis placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité et des changements quotidiens de milieu. Cinq à sept jours plus tard, observez les colonies indifférenciées au centre dense qui sont prêtes à passer au microscope optique. Lorsque les cellules sont prêtes, ajoutez un milligramme par millilitre de dis space chaud à 37 degrés Celsius dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant sept minutes.Ensuite, aspirez l’espace DYS et rincez doucement les colonies cellulaires avec deux millilitres de DM MF 12 préchauffé. Deux fois. Après le rinçage, ajoutez deux millilitres de milieu de culture de cellules souches sans nourricier dans chaque puits et utilisez une pipette de cinq millilitres pour gratter doucement les colonies, libérant ainsi les amas de cellules.Transférez ensuite les touffes détachées dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez suffisamment de milieu de culture de cellules souches libres pour ensemencer le prochain passage de cellules afin de générer les corps embryonnaires. Tout d’abord, rincez les cellules IPS avec deux millilitres de DMMF 12, puis ajoutez 750 microlitres d’Accutane dans chaque puits de la plaque à six puits pendant cinq à 10 minutes. Dans un incubateur de culture cellulaire, lorsque les cellules ont commencé à se détacher, utilisez une pipette pour dissocier doucement les cellules en une suspension unicellulaire, puis transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres.Rincez la plaque avec cinq millilitres de DM MF 12, en regroupant le lavage avec les cellules du tube conique. Passez ensuite la suspension cellulaire dans une crépine de 40 micromètres pour éliminer tout amas de cellules résiduelles. Maintenant, faites tourner les cellules pour éliminer l’Accutane et le resus.Suspendre la pastille dans le milieu de formation du corps embryonnaire à une concentration de 0,5 à une fois 10 à la septième cellule par millilitre. Après avoir déterminé le nombre de cellules viables par exclusion du bleu trian, ajoutez le nombre approprié de cellules à chaque puits d’une plaque de micro-puits pour générer l’embryon souhaité. Tailles de corps.Pipetez doucement les cultures pour faciliter une distribution uniforme des cellules, puis ajustez le milieu de formation du corps embryonnaire complété par un inhibiteur de roche à un volume final de 2,0 millilitres. Après un pipetage plus doux, faites tourner les cultures cellulaires à micro-puits et incubez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain, pipetez le milieu de haut en bas dans chaque micro-puits avec un micro-pipeteur d’un millilitre pour récolter la plupart des corps embryonnaires, puis passez la suspension du corps embryonnaire à travers une passoire à cellules inversées de 40 micromètres pour prélever toutes les cellules individuelles.Ensuite, rincez la plaque à micro-puits cinq fois avec un millilitre de DMMF 12 pour éliminer le reste des corps embryonnaires en passant les lavages à travers la passoire. Ensuite, retournez la passoire cellulaire dans une boîte de Pétri et filtrez les corps embryonnaires collectés avec plus de milieu de formation de corps embryonnaire. Après avoir compté les cellules collectées, incubez les corps embryonnaires sur une matrice protéique recouverte de six plaques de puits à moins de 1000 corps embryonnaires par puits dans un milieu de formation de corps embryonnaire, complété par 10 inhibiteurs de roche micromolaire dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.Enfin, remplacez le milieu de formation du corps embryonnaire par un milieu de différenciation pour initier la différenciation. Prélever des échantillons aux jours 6, 17, 29 et 60 pour effectuer l’analyse appropriée en aval. Après 12 semaines de culture, 200 corps embryonnaires cellulaires développent une morphologie astrocytaire et fibroblastique sans pigmentation visible, tandis que les corps embryonnaires plus grands développent une monocouche de morphologie et de pigmentation RPE classiques, comme démontré dans ces images.Dans ce graphique, le marqueur neuroectodermique PAC six a été mesuré dans des corps embryonnaires de différentes tailles à différents moments par cytométrie en flux. Par exemple, dans les 3000 corps d’embryons cellulaires, environ 50 % des cellules analysées étaient positives pour PAC 6 au sixième jour de culture. De plus, l’analyse par fax du marqueur RPE MITF sur des corps embryonnaires de différentes tailles a révélé que 20 % des cellules exprimaient MITF au 60e jour de différenciation.Les EPR cultivés sont également caractérisés par leur capacité à perdre leur pigmentation et leur morphologie polygonale et à obtenir un phénotype de fibroblaste lors de l’emballage. Par exemple, ici, les cellules nouvellement passées qui ont perdu leur pigment et ont acquis une morphologie de fibroblaste sont montrées. Ces cellules prolifèrent ensuite, retrouvant leur morphologie polygonale classique lors de la confluence, et en quelques semaines, retrouvent leur pigmentation.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de bien identifier et d’isoler les colonies IPS RP après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches pour explorer la différenciation dirigée vers de nombreux types de cellules adultes en imitant le développement embryologique normal. N’oubliez pas que le travail dans les laboratoires virtuels peut être extrêmement dangereux et que les répercussions, telles que le port de jambières, de gants et de lunettes, doivent toujours être prises en compte lors de ces procédures.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des corps embryonnaires homogènes de la taille souhaitée pour diriger la déforestation vers I-P-S-R-P-E et pour isoler et enrichir les cellules RPE.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

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Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

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