Name: Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Apprenez à détecter les cellules B productrices d'IgE chez la souris en utilisant un protocole de trypsine et de cytométrie en flux. Cette méthode permet d'identifier précisément les cellules exprimant l'IgE après recombinaison de classe in vitro.

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DRW est financé par des subventions du NIH AI089972 et AI113217, et par les études Immunologie équipe muqueuses, et titulaire d&#39;une bourse de carrière pour les scientifiques médicaux du Burroughs Wellcome Fund.

NOTE: Toutes les expériences décrites ici étaient en accord avec le Comité soin et l&#39;utilisation des animaux institutionnel (IACUC) directives et approuvé par l&#39;Hôpital pour enfants Animal Research (ARCH), Boston, Mass. 1. Préparation des réactifs <ol><li> 1,000x IL-4 Image: Diluer cytokine IL-4 à 20 pg / ml dans H 2 O ou 0,1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA). Répartir en aliquotes de 200 ul de 1,5 ml microtubes et conserver à -20 ° C. </li><li> 1,000x anti-CD40: Obtenir du fabricant à 1,0 mg / ml, conserver à 4 ° C. </li><li> B médias de stimulation cellulaire: Pour 425 ml de milieu RPMI-1640, ajouter 75 ml de sérum de veau foetal fraîchement décongelé (FCS), 10 ml de 1,0 M de tampon HEPES, 5 ml de L-glutamine actions, 5 ml Pénicilline: stocks streptomycine, 5 ml milieu essentiel non-acides aminés essentiels ul (MEM-NEAA), et 3,5 minimum de 2-mercaptoéthanol. Rangez les supports à 4 ° C pendant une semaine. Ajouter IL-4 (20 ng / ml) et anti-CD40 (1,0 pg / ml) immédiatement avant l&#39;emploiseulement au volume de support requis. </li><li> 2% FCS-tampon FACS: Ajouter 10 ml de FCS à 490 ml de PBS 1x. Conserver à 4 ° C. </li><li> 2x solution de trypsine-EDTA: Diluer 5 ml de 10x trypsine-EDTA solution stock (5,0 g trypsine, 2,0 g par litre EDTA) dans 20 ml de PBS 1x. Magasin de trypsine-EDTA à 2x aliquotes de travail à 4 ° C. On laisse réchauffer à température ambiante avant utilisation. </li><li> Sérum de veau foetal: Gardez FCS décongelés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux semaines. Placez sur la glace 15 minutes avant la procédure de coloration cytoplasmique. </li><li> Neutre-formol tamponné: Préparer une solution de formaline à 10% (3,7% de paraformaldehyde). Le formol est toxique et donc le manipuler sous une hotte de laboratoire, tout en portant des EPI appropriés. formol de magasin à la température ambiante dans une armoire de stockage de produits chimiques. </li><li> Méthanol: Magasin methanol absolu (100%) à -20 ° C jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes à être perméabilisées. Notez que le méthanol est inflammable et doit être stocké dans un congélateur approprié. </li></ol> 2.La purification et l&#39;activation des cellules B <ol><li> A partir d&#39;une rate de souris fraîchement récoltées, préparer une suspension de cellules isolées par pressage de l&#39;organe doucement à travers un tamis cellulaire de 70 pm avec le plongeur d&#39;une seringue de 3 ml. Dans un tube à centrifuger conique de 15 ml, de recueillir les cellules dans 10 ml de 1 x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans 1 ml de Red Blood Cell tampon de lyse pendant 5 min. Neutraliser avec 13,5 ml de PBS 1x et centrifuger à 300 g pendant 5 min. </li><li> (Facultatif) séparer magnétiquement les cellules B en utilisant anti-CD45R (B220) marqué à billes, suivant le protocole de purification MACS selon les instructions du fabricant. </li><li> Stimuler les cellules B purifiées à 1,0 x 10 6 cellules / ml dans réchauffé médias de stimulation des cellules B contenant de l&#39;IL-4 (20 ng / ml) et anti-CD40 (1,0 ug / ml) pendant 5 jours à 37 ° C. Commencer avec 8 ml de culture divisé en deux puits d&#39;une plaque de culture à 6 puits (4 ml chacune). </li><li> Vérifiez culture quotidiennement pour maintenir à 1,0 x 10 6 cellules / ml. Ajuster la concentration en fractionnant dans d&#39;autres puits et la dilution de la culture avec un milieu de stimulation de cellules B contenant des frais d&#39;IL-4 et anti-CD40. </li></ol> 3. trypsine, Fixation et perméabilisation <ol><li> Trypsinisation <ol><li> Recueillir jusqu&#39;à 1,0 x 10 7 cellules cultivées de dans un tube conique de 15 ml, centrifuger à 300 g pendant 5 min et décanter le surnageant. </li><li> Laver avec 10 ml de PBS pour éliminer la protéine résiduelle dans le milieu de collecte de cellules. Répétez l&#39;étape de centrifugation et décanter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans le volume résiduel après décantation (environ 100 pi). </li><li> Ajouter avec précaution 800 ul de la température ambiante de 0,1% (2x) de trypsine-EDTA pour les cellules. Verser lentement à un angle sur le côté du tube conique de 45 °. </li><li> Fermer le tube et mélanger doucement en inclinant le tube de sorte que le liquide se écoule le long de la longueur du temps le tube 5-6s. Un précipité blanc filandreux peut se former dans la solution. Limiter le temps de traitement à la trypsine en vertu d&#39;une min. </li><li> Stopper la réaction de traitement à la trypsine avec 1 ml de FCS froid. Diluer le FCS immédiatement en ajoutant 10 ml de PBS froid. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, puis décanter le surnageant et retrouver les tubes à la glace. </li></ol></li><li> Fixation <ol><li> Resuspendre les cellules dans le volume résiduel après décantation. Si nécessaire, porter le volume à 100 pi avec du PBS froid. </li><li> Dans une hotte, ajouter 800 ul de solution neutre à 10% de formaline tamponnée à pipeter les cellules et de haut en bas. Le tube se réchauffe lors de l&#39;addition de formol. Incuber à 37 ° C pendant 10 min. </li></ol></li><li> Perméabilisation <ol><li> Mettre en place un mélangeur de paillasse de vortex à une vitesse d&#39;agitation douce. </li><li> Dessin 9 ml de froid (-20 ° C) de methanol dans une pipette sérologique de 10 ml. </li><li> Tenir le tube contenant les cellules sur le vortex et commencer doucement shaking les cellules. </li><li> Ajouter methanol froid pour le tube de sorte qu&#39;il tombe goutte à goutte sur les cellules tandis que le tube tremble encore de sorte que le méthanol est continuellement mélange. Après les 2 premiers ml de methanol la vitesse de distribution peut être augmentée à un lent courant. </li><li> Laissez reposer le tube sur la glace pendant 30 min pour achever la perméabilisation. En variante, les cellules peuvent être stockées à -20 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. </li></ol></li></ol> 4. fluorescence Coloration pour IgG1 et IgE commutation Classe <ol><li> échantillon de Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min et décanter la solution de méthanol. Un précipité blanc peut se sédimenter les cellules. </li><li> Ajouter 10 ml de la température ambiante 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min pour laver les cellules. Répéter une fois. Remarque: Se laver le culot avec la température ambiante PBS dissout précipité supplémentaire qui peut se former après l&#39;étape 4.1. </li><li> Effectuer un lavage supplémentaire avec 10 ml de tampon FACS FCS-2%. </li><li> Distribuer des échantillons à un 96 puits ronde plaque de fondet centrifuger à 300 g pendant 5 min. Décanter le surnageant et mettre la plaque sur la glace. </li><li> Colorer dans 60 pi de tampon FCS-FACS 2% par puits avec les dilutions d&#39;anticorps suivantes: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Après 5 min de la coloration, laver la plaque avec 150 ul de 2% de tampon FCS-FACS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Remettre en suspension dans 400 ul de tampon 2% de FCS et FACS pipette à travers un filtre cellulaire en nylon de 40 pm en une 5 ml FACS tube. </li></ol> 5. Utilisez la Stratégie Gating la suite: <ol><li> Isoler CD45R (B220) cellules positives de la population de lymphocytes dynamitage situé sur la / lot SSC FSC (Figure 1). </li><li> A partir des cellules positives B220, utiliser l&#39;intrigue IgE et IgG1 de révéler les populations correspondantes. </li></ol>

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<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
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<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

La stimulation de la rate de souris les cellules B dans la culture avec anti-CD40 et IL-4 simule T auxiliaires de type 2 (T H 2) les interactions, la commutation de classe IgG1 et encourageant de 5 IgE. cellules B peuvent être activés pour la RSE dans le contexte de splénocytes un total de 12 ou de cellules B spléniques purifiées comme 11. Comme indiqué dans le protocole (étape 2.3), l&#39;enrichissement des cellules B est facultative, et est à la discrétion de l&#39;expérimen...

Au cours de chaîne lourde d&#39;immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) chez les souris et les humains, l&#39;IgH μ exons de région constante (Cp) sont supprimés et remplacés par un ou plusieurs ensembles de aval exons de région constante (C H s) (par exemple, Cy, Cε, et Ca), résultant en un passage de la production de IgM à la production d&#39;autres classes d&#39;Ig (par exemple IgG, IgE, IgA ou). RSE se produit au sein de commutateur (S), régions qui sont de 1 à 10 kb séquences situées en 5 &#39;de chaque ensemble de C H 1 s. L&#39;enzyme activation induite cytidine désaminase (AID) lance la RSE par l&#39;activité cytidine désamination. IgE est un médiateur clé de la maladie allergique 2 et une meilleure compréhension de la façon dont IgE est produit et réglementé peut ouvrir des portes à de nouvelles approches thérapeutiques pour la maladie atopique. Chez les souris et les humains, IgE est l&#39;isotype Ig plus strictement réglementée. IgE est normalement détecté à des niveaux milliers de times moins que les autres IgH ISOTYPES 3, mais peut être très élevé dans quatre états pathologiques. Toutefois, la RSE à l&#39;IgE ne est pas complètement comprise. In vitro l&#39;activation des cellules B à l&#39;aide d&#39;IL-4 en combinaison avec l&#39;anti-CD40 ou LPS, induit à la fois à la RSE IgG1 et IgE 5. Cellules B activées expriment le récepteur de faible affinité IgE FceRII / CD23 2,6, qui se lie IgE soluble sécrétée dans la culture après la RSE. Par conséquent, lorsque l&#39;analyse de cytométrie en flux, les cellules B avec récepteur IgE liée tache similaire à B cellules exprimant de manière endogène IgE 7. Se il est connu que la souris B cellules expriment le récepteur de faible affinité IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, dans notre expérience, il ne semble pas interférer avec la mesure de la commutation de classe d&#39;IgG1. Cependant, lors de la mesure IgE commutation après l&#39;activation des cellules B dans la culture, non spécifique lié à la surface IgE peut obscurcir l&#39;analyse. Avec les méthodes de coloration communes, les cellules non-IgE exprimant colorent positivement pour les IgE. Décrite ici est une stratégie qui a été utilisée pour mener des essais en matière de RSE et de détecter les véritables cellules IgE exprimant B de souris 9-11. Le traitement des cellules B activées avec de la trypsine, un réactif de laboratoire commun pour digérer les protéines, supprime surface à la fois lié à la membrane cytophylic et IgE. Après perméabilisation et une coloration cytoplasmique pour IgE révèle ainsi les véritables cellules productrices d&#39;IgE.

<table><tbody><tr><td>Anti-souris IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>clone R35-72</td></tr><tr><td>Rat Anti-souris IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Maintenir à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 & micro ; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &micro ; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Souris/Rat CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clone HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microbilles&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de purification MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstituer dans l’eau ou à 0,1 % BSA</td></tr><tr><td>Solution de formol, tamponnée neutre, 10 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Solution trypsine-EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g de trypsine, 2,0 g d’EDTA&#8226 ; 4 Na par litre de 0,9 % de NaCl</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10 000 U Pénicilline ; 10 mg/ml Streptomycine (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol (99 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clone 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Sérum de veau fœtal</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> de stimulation des <td>cellules B Le milieu de stimulation des cellules B se compose d’un RPMI avec sérum de veau fœtal (15 %), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamine,&nbsp ; 1x Pénicilline-Streptomycine (Pénicilline : 100 U/ml, Streptomycine : 100 & micro ; g/ml), bêta-mercaptoéthanol (7 & micro ; L/L), IL-4 (20 ng/ml) et anti-CD40 (1 & micro ; g/ml)</td></tr></tbody></table>

détection de true ige exprimant souris b cellules de la lignée

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte chaîne lourde d&#39;immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe (RSE) est un procédé dans lequel initialement exprimé IgM passe à d&#39;autres isotypes IgH, comme IgA, IgE et d&#39;IgG. Mesure de IgH RSE in vitro est une méthode clé pour l&#39;étude d&#39;un certain nombre de processus biologiques allant de recombinaison de l&#39;ADN et de réparation à des aspects de l&#39;immunologie moléculaire et cellulaire. Dosage in vitro RSE implique la cytométrie de flux surface de mesure expression Ig sur les cellules B activées. Bien que la mesure de sous-classes d&#39;IgA et IgG est simple, la mesure des IgE par ce procédé est problématique en raison de la liaison des IgE à FceRII soluble / CD23 exprimé sur la surface de cellules B activées. Nous décrivons ici un procédé unique pour la mesure précise de cellules productrices d&#39;IgE-B de souris qui ont subi RSE en culture. La méthode est basée sur le clivage de la trypsine à médiation de complexes IgE-CD23 sur la surface des cellules, ce qui permet la détection de l&#39;IgE-production de cellules de la lignée B par cytoplasmic coloration. Cette procédure offre une solution pratique pour l&#39;analyse par cytométrie en flux de la RSE à l&#39;IgE.

Cette procédure a été mise en œuvre avec succès pour étudier la RSE à l&#39;IgE dans les cellules B de souris. Pour démontrer l&#39;efficacité de la mesure de RSE, nous avons stimulé les lymphocytes B spléniques de souris avec des anticorps anti-CD40 et IL-4 comme décrit précédemment 11. Après cinq jours de stimulation, les cellules ont été recueillies et traitées en utilisant le protocole décrit ci-dessus et colorées avec marqué par fluorescence IgM, IgG1, IgE, des anticorps et B220 (CD45R). Fermé sur les ly...

L’analyse in vitro de la recombinaison de commutation de classe chez la souris est difficile en raison des molécules d’IgE cytophiles liées aux récepteurs Fc à la surface des lymphocytes B. Nous décrivons une méthode de détection des IgE utilisant le clivage médié par la trypsine des IgE liées à la surface avant la fixation et la perméabilisation pour la coloration par fluorescence cytoplasmique.

Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de distinguer les véritables lymphocytes B exprimant les IgE des lymphocytes B, exprimant d’autres isotypes d’IgE sécrétés par des IgE. Au cours de l’analyse in vitro, les tests de commutation de classe se lient aux protéines de surface des cellules B, ce qui obscurcit la capacité de mesurer la commutation de classe en IgE. L’objectif est atteint en éliminant d’abord les molécules d’IgE liées au récepteur avant l’analyse à l’aide de la trypsine, qui ne clive pas spécifiquement les protéines de surface cellulaire tout en laissant intactes les molécules d’immunoglobulines intracellulaires produites de manière endogène.Deuxièmement, les protéines intracellulaires sont exposées en fixant les cellules B avec de la formine et en perméant les cellules avec du méthanol. Ensuite, les cellules sont colorées avec des anticorps marqués par fluorescence pour révéler les immunoglobulines intracellulaires. Les résultats montrent une population distincte de lymphocytes B IgE positifs.Si la trypsine est utilisée sur la base de l’analyse par cytométrie en flux, les études sur la biologie des IgE ont été limitées en raison de la difficulté de détecter les cellules productrices d’IgE. Cette méthode offre une solution accessible que les laboratoires peuvent facilement adopter pour accélérer notre compréhension de cette molécule intéressante. Cette technique est avantageuse par rapport aux méthodes existantes d’élimination de l’effet des IgE liées au récepteur.Par exemple, il est moins coûteux que le blocage des IgE de surface avec des anticorps anti-IgE et plus indulgent qu’un traitement de lavage à l’acide. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’analyse de la classe de cellules B de souris, le passage au traitement IgE avec de la trypsine avant la coloration des faits pourrait également être appliqué à d’autres protocoles nécessitant l’élimination des protéines de surface d’une rate de souris fraîchement récoltée. Préparez une suspension à cellule unique.Appuyez doucement sur l’organe à travers une passoire à cellules de 70 microns à l’aide du piston d’une seringue de trois millilitres. Rassemblez les cellules dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’un XPBS. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Décantez le supra natant et remettez en suspension la pastille dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges. Laissez la réaction de lyse se dérouler pendant cinq minutes avant de la neutraliser avec 13,5 millilitres d’un XPBS. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules à 300 G pendant cinq minutes et remettez le granulé en suspension dans le volume résiduel.Ajoutez maintenant aux cellules un milieu de stimulation chaud des lymphocytes B contenant de l’IL quatre et de l’anti CD 40. Commencez par une culture de huit millilitres divisée en deux puits d’une plaque de culture à six puits et stimulez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Vérifiez la culture quotidiennement pour maintenir les cellules à 1 million par millilitre.Ajustez une concentration en divisant les cultures dans d’autres puits et en diluant avec une stimulation par cellules B. Supports contenant de l’IL quatre frais et de l’anti CD 40. Commencez par collecter jusqu’à 10 millions de lymphocytes B stimulés dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, centrifugez-les à 300 G pendant cinq minutes et décantez le surnageant pour éliminer la protéine résiduelle du milieu de collecte cellulaire. Lavez les cellules B avec 10 millilitres de PBS suivies d’une autre centrifugation et décantation du SNAT Après la décantation, remettez en suspension la pastille cellulaire dans le volume résiduel d’environ 100 microlitres et ajoutez soigneusement 800 microlitres de température ambiante 0,1 % de voyages dans EDTA. Ajoutez la solution lentement le long de la paroi latérale du tube.Ajoutez une inclinaison, puis bouchez le tube et mélangez-le en faisant couler doucement le liquide sur toute la longueur du tube. Cinq ou six fois un précipité blanc filandreux peut se former dans la solution en une minute. Trempez la réaction avec un millilitre de FCS froid.Gardez les cellules sur de la glace. Aujourd’hui, ils sont toujours en vie et peuvent exprimer de nouvelles protéines de surface. Diluez immédiatement le FCS en ajoutant 10 millilitres de PBS froid.Retirez tous les débris flottants à l’aide d’une pipette. Faites tourner les cellules à quatre degrés Celsius. Décantez immédiatement le snat et remettez les cellules en suspension dans le volume résiduel.Si nécessaire, portez le volume à 100 microlitres avec du PBS froid, en procédant rapidement dans une hotte à 800 microlitres de pipette de formine tamponnée neutre à 10 %, le mélange de haut en bas du tube commencera à se réchauffer une fois mélangé, incubez les cellules dans le fixateur pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, installez un mélangeur vortex de paillasse à une vitesse d’agitation douce et préparez le méthanol refroidir à moins 20 degrés Celsius pour l’utilisation. Lorsque les cellules ont fini d’incuber.Prélevez neuf millilitres de méthanol dans une pipette sérologique. Ensuite, débouchez doucement le tube tout en ajoutant le méthanol goutte à goutte. Après avoir distribué deux millilitres de méthanol, accélérez jusqu’à un jet lent.Laissez maintenant le tube reposer sur de la glace pendant 30 minutes pour permer les cellules. Alternativement, les cellules peuvent être stockées à moins 20 degrés Celsius pendant un mois maximum. Commencez la procédure de coloration en centrifugeant d’abord les cellules de perme et en transvasant le méthanol.Un précipité blanc peut se granuler avec les cellules. Ensuite, lavez les cellules en mélangeant dans 10 millilitres de température ambiante un XPBS de centrifugation et de décantation. Effectuez cette étape de lavage deux fois.Ensuite, faites un lavage supplémentaire avec 10 millilitres de fax FCS à 2 %, tamponnez et remettez en suspension. La pastille dans le volume résiduel se fait en chargeant l’échantillon dans un puits d’une plaque à fond rond de 96 puits. De nombreux échantillons sont généralement traités en parallèle.Chargez 20 à 50 microlitres à l’aide d’une centrifugeuse à plaques centrifuger les cellules à 300 G pendant cinq minutes. Ensuite, décantez le snat et posez l’assiette sur de la glace. Maintenant, colorez les cellules de chaque puits, ajoutez 60 microlitres de tampon de fax FCS à 2 % contenant quatre anticorps différents.Laissez les cellules incuber dans la coloration pendant cinq minutes après la coloration. Lavez les cellules en ajoutant 150 microlitres de fourrure tampon de fax FCS à 2 %. Ensuite, centrifugez la plaque comme précédemment, puis décantez la solution et suspendez à nouveau les cellules.Utilisez 400 microlitres de tampon de télécopie FCS à 2 %. Maintenant, pipetez les cellules à travers une crépine en nylon de 40 microns dans un tube de télécopie de cinq millilitres pour le portique de télécopie. Les cellules en isolant d’abord les cellules CD 45 R positives, également appelées cellules B deux 20 positives, de la population de lymphocytes explosifs sur le graphique F-S-C-S-S-C, puis des cellules B deux 20 positives.Utilisez les graphiques IgE et IgG un pour révéler les populations correspondantes à l’aide de cette procédure. La recombinaison de commutation de classe en IgE a été étudiée dans des cellules B de souris à l’aide d’une stratégie de déclenchement basée sur les lymphocytes explosifs. Une population claire de cellules IgE positives n’a pas pu être clairement discriminée sans que la trypsine des cellules trypsine avant la fixation et la perméation ait permis la séparation des cellules productrices d’IgE en raison de l’élimination des IgE liées à la surface Une fois maîtrisées.Cette technique de coloration peut être effectuée en environ une heure si elle est effectuée correctement. Travailler avec du formol et du méthanol peut être dangereux. Par conséquent, un fuma doit toujours être utilisé et un équipement de protection individuelle approprié doit toujours être utilisé lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

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