Name: TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour lévaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Découvrez la dynamique des vésicules de neurotransmetteur dans les cellules SH-SY5Y par microscopie TIRFM et sondes GFP sensibles au pH. Cette méthode permet d'étudier la fusion vésiculaire avec haute résolution spatiale et temporelle.

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Les auteurs tiennent à remercier l&#39;Università degli Studi di Milano pour le soutien aux Eliana Di Cairano (post-doctorat) et Stefania Moretti (Ph.D. bourse). Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche de l&#39;Université PUR CP Nous tenons à remercier le professeur Jeremy M. Henley, École de biochimie, Université de Bristol, Royaume-Uni, pour la pHluorin construire et le Dr Francesco Dotti d&#39;assistance dans l&#39;analyse de données, et Silvia Marsicano pour l&#39;assistance technique.

1. Culture cellulaire et transfection <ol><li> Culture de cellules SH-SY5Y REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en utilisant le neuroblastome humain SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y grandir comme un mélange de grappes flottantes et les cellules adhérentes. Suivez les instructions figurant dans le protocole (de densité cellulaire, rapport de division, etc.) D&#39;avoir des cellules qui se développent fermement attachés à couvercle en verre, qui est crucial pour TIRFM. <ol><li> Avant de commencer, sous le poste de sécurité microbiologique à flux laminaire, de porter le volume opportun de solution de phosphate stérile de solution saline tamponnée (PBS) et un milieu de culture. <ol><li> Ajouter 50 ml de PBS à la concentration de 150 mM de NaCl, 24 mM de tampon phosphate, pH 7,4. Filtrer la solution. </li><li> Ajouter 50 ml de milieu cellulaire à partir du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec haute teneur en glucose, 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS), de la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), L-glutamine ( 2 mM), etpyruvate de sodium (1 mM). Filtrer la solution. </li></ol></li><li> Éliminer le milieu de croissance complet et laver les cellules avec 3 ml de PBS. </li><li> Incuber les cellules avec 2 ml de 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (par boîte de Petri de 6 cm) pendant 5 min à 37 ° C, 5% CO 2 et détacher les cellules en utilisant une pipette. </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant 2 ml de DMEM, et de recueillir les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min. </li><li> Eliminer le surnageant, ajouter 1 ml de DMEM à la pastille et pipeter la solution de haut en bas suffisamment pour disperser les cellules dans une suspension cellulaire unique. </li><li> Diviser les 1: 4 dans une nouvelle boîte de diamètre de 6 cm de Pétri contenant 3 ml de milieu complet. Maintenir les cellules en culture dans des boîtes de Pétri de diamètre 6 cm, à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Sous-culture une fois par semaine ou quand ils ont couvert 80 - 90% de la superficie de la surface. </li></ol></li><li> SH-SY5Y placage pour l&#39;imagerie de cellules <ol><li> Pour les expériences de TIRFM, plaquecellules sur les couvercles de verre. Employer verre couvre de 0,17 ± 0,005 mm d&#39;épaisseur et un indice de réfraction 1,5255 ± 0,00015. Avant de commencer, préparer les lamelles de verre comme suit: <ol><li> Nettoyez le verre couvre de 90% d&#39;éthanol, O / N. </li><li> Rincez-les soigneusement à l&#39;eau distillée (trois changements d&#39;eau distillée). Verre couvre sec dans un four de séchage. </li><li> Lieu couvre en verre boîtes de Pétri et stériliser dans un four préchauffé à 200 ° C pendant 3 heures. </li></ol></li><li> Le jour avant la transfection, placer chaque lamelle dans un plat 3,5 cm Petri, ajouter 1 ml de milieu de culture et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 de 5%. </li><li> Trypsiniser cellules comme décrit dans les étapes 1.1.3 - 1.1.5, suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet et compter. Calculer le volume correct de la suspension cellulaire à ajouter à chaque boîte de Petri pour obtenir 3 x 10 5 cellules / puits. Cette densité est nécessaire pour une croissance cellulaire optimale et une transfection efficace. Incuber à 37 ° Cen 5% de CO 2 incubateur O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection par polyéthylènimine (PEI) REMARQUE: Pour visualiser les vésicules synaptiques dynamique, vecteur pCB6 contenant synapto-pHluorin a été utilisé. Le synapto-pHluorin a été générée par fusion dans le cadre d&#39;une variante sensible au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) 16 et la protéine de membrane vésiculaire synaptobrévine 2. La construction a été largement utilisé pour étudier les propriétés des vésicules synaptiques dans les neurones 9. <ol><li> Avant de commencer la transfection, faire 10 ml des solutions suivantes. Conserver les solutions que maximale que 1 mois. <ol><li> Faire une solution 150 mM de NaCl. Ajuster le pH à 5,5 avec du HCl 0,01. </li><li> Faire une solution de PEI à 10% de polyéthylènimine (PEI; 25 kDa linéaire) en solution 150 mM de NaCl. Le pH de la solution se élève à 8,8. Ajuster le pH à 7,8 avec du HCl 0,01. </li></ol></li><li> 24 heures après l&#39;étalement, éliminer le milieu et rafraîchir avec 1,5 ml demilieu complet. Maintenir les cellules à 37 ° C, dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Sous l&#39;enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml, ajouter 3 pg d&#39;ADN de plasmide à 25 ul d&#39;une solution 150 mM de NaCl et 100 ul de solution de PEI 3,5 cm par boîte de Pétri. </li><li> Vortex pendant 10 secondes, puis incuber le mélange ADN / PEI pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Ajouter délicatement le mélange ADN / PEI à la boîte de Petri contenant des lamelles avec des cellules et secouez doucement pour répartir équitablement le réactif dans la boîte de Pétri. </li><li> Après 4 h changer le milieu et on incube les cellules O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Réaliser des expériences d&#39;imagerie 24-48 heures après transfection. </li></ol></li></ol> 2. imagerie cellulaire par réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) <ol><li> Imagerie set-up <ol><li> Effectuer imagerie de la FRBR avec le set-up décrit à la figure 1. Il comprend un moteur inversémicroscope (Figure 1, encart A), la source laser (figure 1, encadré B) et la TIRF-coulisseau (Figure 1, encart C). Atteindre l&#39;illumination TIRFM à travers une ouverture numérique élevée (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) d&#39;huile 100X, objectif à immersion. </li><li> Pour l&#39;éclairage de TIRFM, employer un multi-ligne (458/488/514 nm) 100 mW laser argon-ion. Utilisation d&#39;une fibre en mode mono, introduire la lumière laser polarisée linéairement dans le trajet du faisceau, par l&#39;intermédiaire du coulisseau TIRF. Insérez le curseur TIRF dans le plan de la membrane champ lumineux de la trajectoire du faisceau de lumière réfléchie. <ol><li> Pour l&#39;éclairage à grand champ, connectez le microscope à un HBO lumière blanche de la lampe au mercure à court d&#39;arc classique. Un double prisme à maintien de polarisation dans le coulisseau assure la combinaison simultanée de TIRF illumination et la lumière blanche. </li></ol></li><li> On filtre la lumière laser avec un filtre d&#39;excitation (largeur bande de 488/10 nm) monté sur une roue de filtre, introduit dans le trajet du laser. Employerune vitesse élevée, l&#39;obturateur commandé par logiciel, afin de permettre un contrôle rapide de l&#39;illumination laser. Pour l&#39;analyse pHluorin, monter un passe-bande 525/50 nm filtre d&#39;émission. Capturez des images numériques (512 x 512 pixels) sur une caméra CCD rapide refroidi avec l&#39;image ProPlus logiciel. </li></ol></li><li> La réalisation de l&#39;éclairage de la FRBR (Figure 2) <ol><li> Tourner sur les lasers, l&#39;ordinateur, l&#39;appareil photo, la roue de filtre, et les contrôleurs d&#39;obturation; puis, attendez 20 minutes avant de commencer l&#39;expérience que les lasers ont besoin pour se réchauffer et se stabiliser. </li><li> Avant imagerie, rendre le volume opportun des solutions suivantes. <ol><li> Ajouter 50 ml de Krebs (KRH) solution à 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de l&#39;acide 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl2 et 6 mM de glucose. </li><li> Ajouter 10 ml de solution KRH-KCl (pH 7,4) à 80 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de HEPES (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl2 et 6 mM de glucose. </li></ol></li><li> Retirer le couvercle en verre avec des cellules transfectées et l&#39;insérer dans la chambre d&#39;imagerie approprié. Monter la chambre et ajouter 500 ul de solution KRH dans le centre de la vitre. </li><li> Ajouter l&#39;huile sur l&#39;objectif. Placer la chambre d&#39;imagerie sur la platine du microscope et la position de l&#39;objectif sous la lamelle couvre-objet en verre. Positionner le couvercle sécuritaire sur l&#39;échantillon. </li><li> En mode épifluorescence, se concentrer sur la lamelle (surface supérieure) et choisissez cellules transfectées placés dans le centre de la chambre. Sélectionnez les cellules dont le signal fluorescent peut être clairement enregistrée en utilisant un temps d&#39;exposition inférieure à 80 ms. </li><li> Sous le contrôle du logiciel, passer à l&#39;éclairage FRBR en mode direct. </li><li> Pour définir la configuration de la FRBR, vérifier la position de la poutre qui émerge de l&#39;objectif, sur la couverture de l&#39;échantillon (figure 2B). Lorsque le faisceau est positionné dans le centre de til objectif (figure 2A, à gauche), un endroit est visible au centre de la couverture de l&#39;échantillon de la FRBR (figure 2B, à gauche) et la cellule est imagé en mode épifluorescence (plusieurs avions de discussion, une forte fluorescence de fond; la figure 2C, gauche) . </li><li> Pour atteindre l&#39;angle critique, déplacer le point focalisé dans la direction Y (avant ou arrière; Figure 2B, centre) en utilisant l&#39;angle vis de réglage sur le curseur de la FRBR (figure 1C). Lorsque le faisceau converge sur le plan de l&#39;échantillon à un angle supérieur à l&#39;angle critique (figure 2A, à droite), le spot disparaît et une droite, mince ligne axé est évident dans le milieu de la couverture de l&#39;échantillon (figure 2B, à droite). </li><li> Pour affiner l&#39;angle FRBR utiliser l&#39;échantillon de cellules (figure 2C). Regarder l&#39;image de fluorescence sur la vidéo, à ce stade, une image à épifluorescence-like est encore visible. Doucement, déplacer la vis jusqu&#39;à la FRBR concondition est atteint: un seul plan optique de la cellule est au point (ce est à dire, la membrane plasmique en contact avec la lamelle), il en résulte une image plate avec un contraste élevé (figure 2C, à droite). </li></ol></li><li> imagerie de l&#39;échantillon <ol><li> Réglez l&#39;expérience time-lapse à canal unique. Pour minimiser photoblanchiment, capturer l&#39;image en utilisant à faible temps d&#39;exposition et gain élevé. Temps d&#39;exposition appropriées sont entre 40 à 80 msec. Acquérir des images à 1-2 Hz fréquence d&#39;échantillonnage. cinétique de vésicules échantillonnage peuvent être mieux appréciée à plus haute fréquence (10 Hz). Le temps d&#39;observation régulière est généralement de 2 min. </li><li> Ajouter 500 pi de cellules de solutions et d&#39;enregistrer KRH en mode TIRFM. Ce est la condition de repos. Enregistrez les images séquentielles de temps. </li><li> Concentrez-vous sur la même cellule et enregistrer dans les mêmes conditions de repos (de puissance laser, exposition de temps, le numéro de châssis). Après cinq cadres, ajouter 500 pi de solution KCl-KRH et de garder KCl dans la chambre.Ce est la condition stimulée; enregistrer les images séquentielles de temps. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de l&#39;image et de traitement des données REMARQUE: Pour analyser les images, les macros ont été développées dans le laboratoire, basée sur des fonctions existantes du logiciel d&#39;analyse d&#39;image; macros similaires sont disponibles en ligne (URL fournie dans le tableau des matériaux et équipements). <ol><li> quantification de l&#39;intensité de fluorescence <ol><li> Utiliser une macro &quot;Séquence d&#39;intensité de fluorescence&quot; pour la quantification de l&#39;intensité de fluorescence dans une région d&#39;intérêt (ROI) de l&#39;image, au cours de la séquence. </li><li> Ouvrir les images séquentielles dans le temps. Allez dans le menu macro et sélectionnez «Séquence intensité de fluorescence. Dans la fenêtre &quot;Analyse de apparaît&quot; sélectionner le ROI &quot;. </li><li> Choisissez l&#39;un des outils de sélection dans le menu pour créer le ROI. Placez 3 Rois dans les régions de la membrane cellulaire sans taches (fond ROI). Employer this &quot;background ROI&quot; pour évaluer le photoblanchiment et de fixer le seuil pour l&#39;analyse des événements de fusion (figure 3A). </li></ol></li><li> Photobleaching correction et la détermination de seuil (figure 3B) <ol><li> Pour évaluer le photoblanchiment, ouvrir les lignes de fluorescence d&#39;intensité &quot;de fond&quot;, ROI (Figure 3ba). Normaliser les valeurs d&#39;intensité de fluorescence dans chaque trame à la valeur d&#39;intensité initiale (F0) (F / F0) (figure 3Bb). La moyenne des valeurs. </li><li> Mettez en surbrillance les données moyennes et de créer un terrain de ligne en utilisant les options de menu de graphique. </li><li> Dans le menu d&#39;analyse de données, sélectionnez &quot;Trendline&quot; pour ouvrir la boîte de dialogue d&#39;analyse de la parcelle. Sélectionnez le type de régression. Réglez la régression &quot;exponentielle&quot;. Ensuite, sélectionnez &quot;équation d&#39;affichage sur le tableau&quot;. Dans la fenêtre graphique, l&#39;équation exponentielle apparaît et les valeurs des paramètres sont automatiquement attribué, (Figure 3bc </strong&gt;). </li><li> Appliquer la correction exponentielle pour les valeurs d&#39;intensité dans chaque trame comme suit: Fn (corrigé) = Fn / exp (-n * a) Fn = expérimentale intensité de fluorescence mesurée à la trame n; n = le nombre de trames; a = facteur de blanchiment (constante exprimant le taux de perte d&#39;intensité en raison de photoblanchiment; &#160; Figure 3BD). </li><li> Pour définir le seuil, ouvrir un &quot;background ROI&quot; normalisée et corrigée, calculer le signal de fluorescence moyenne et son écart type (SD). La valeur moyenne plus 3 SD représente le seuil (Figure 3BE). Utilisez ce seuil pour l&#39;analyse des données. </li></ol></li><li> La sélection des événements de fusion en utilisant une procédure semi-automatique <ol><li> Ouvrir les images séquentielles dans le temps avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image. Application d&#39;un filtre gaussien à la séquence d&#39;image active. </li><li> Analyser les images à l&#39;aide de la fonction &quot;compter des objets&quot; ou une macro qui permet la sélectiond&#39;un objet dont les pixels ont une intensité de fluorescence moyenne dans une plage définie. Réglez l&#39;intensité gamme manuellement, en utilisant la fonction de seuil (aller à la barre de menu, réglez le seuil de mesure → pour sélectionner la zone d&#39;intérêt). Un seuil adéquat est de 30% sur le signal de fond fluorescent locale. </li><li> Appliquer une macro &quot;Filtres objets&quot; pour sélectionner uniquement les objets répondant aux critères suivants: <ol><li> Appliquer l&#39;option gammes (min et max inclus) pour l&#39;aspect. Aspect indique le rapport entre le grand axe et le petit axe de l&#39;ellipse équivalente à l&#39;objet. Aspect est toujours ≥1. Les valeurs adéquates sont min = 1, max = 3. </li><li> Appliquer gammes de diamètre. Diamètre rapporte la longueur moyenne des diamètres mesurés à intervalles de deux degrés joignant deux points de contour et passant par le centre de gravité de l&#39;objet. Définissez la plage de pixels (ou en pm, si vous utilisez un système calibré). </li><li> Définir la gamme optimale dans preliminexpériences aires: sélectionner manuellement les points d&#39;intérêt, puis de mesurer leur diamètre en utilisant la fonction de profil de la parcelle. </li></ol></li><li> Sélectionnez «objets d&#39;affichage&quot;: objets sélectionnés apparaîtront superposée à l&#39;image de TIRFM (figure 4B). </li><li> Inclure dans l&#39;analyse que les taches qui montrent une courte durée (de une à trois cadres) augmentation transitoire de l&#39;intensité de fluorescence, immédiatement suivie d&#39;une perte marquée de signaux transitoires (taches). Employer la sélection circulaire pour créer un retour sur investissement de diamètre environ une place radialement autour des vésicules / spots sélectionnés (ROI expérimental). Effectuez cette étape manuellement. </li><li> Avec les ROI sélectionné, calculer l&#39;intensité de fluorescence moyenne de chaque ROI au cours du film. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des données (figure 3C-D) <ol><li> Exporter le décours temporel de l&#39;évolution de fluorescence mesurés dans chaque &quot;ROI expérimentale» dans un tableur; (Figure 3da). Normaliser la valeur d&#39;intensité dans chaque trame à l&#39;intensité de fluorescence initiale (F / F0), (figure 3dB). </li><li> Appliquer la correction exponentielle pour les valeurs d&#39;intensité dans chaque trame comme indiqué à l&#39;étape 3.2.4 (Figure 3Dc). </li><li> Pour calculer le nombre total d&#39;événements de fusion (nombre crête), le temps que chaque fusion se produit (largeur de pic) et l&#39;amplitude du pic fluorescent (hauteur de pic et l&#39;ASC) appliquer des fonctions logiques en utilisant des tableurs ou mathématiques. Un exemple d&#39;analyse d&#39;événement de fusion en utilisant des formules logiques est rapporté dans la Figure 3DD et 3De. </li><li> Supposons que l&#39;augmentation de l&#39;intensité de fluorescence supérieure au seuil (intensité moyenne de fluorescence de fond ± 3SD) comme la fusion des vésicules à la membrane plasmique et le pic résultant comme un événement de fusion. </li><li> Calculer la largeur du pic en tant que différence entre la dernière et la première valeur x de chaque pic. Multipliez cette valeur pour 1 / (fréquence d&#39;échantillonnage). Considérez cette valeur uns Le temps de fusion des vésicules et l&#39;adhérence à la membrane plasmique vésiculaire avant ré-acidification et recyclage (Figure 3DD). </li><li> Calculer la CUA cellule entière comme une somme de valeurs sur le seuil. Considérer cette valeur comme la variation nette fluorescente pendant la durée d&#39;enregistrement en raison de la spontanée (repos) ou évoquée (stimulé) l&#39;activité synaptique. </li><li> Calculer la hauteur de pic comme la différence entre la valeur y de chaque pic maximal et le seuil. Considérer cette valeur comme indicative du type de fusion (un ou de fusion séquentielle / simultanée ou transitoire vs pleine fusion). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Cet article présente un protocole à l&#39;image et à analyser la dynamique des vésicules dans les cellules sécrétant, utilisant des vecteurs et TIRFM ADNc codé fluorescentes. Les éléments clés de l&#39;imagerie par TIRFM succès sont la sélection du modèle cellulaire et transfection de cellules avec des indicateurs optiques génétiquement codés de la libération des vésicules et le recyclage. TIRFM est idéal pour la croissance des cellules adhérentes à un couvercle de verre plat et suffisamment...

La transmission synaptique chimique entre les neurones est un mécanisme majeur de la communication dans le système nerveux. Elle se appuie sur la libération de neurotransmetteurs par un cycle dynamique de la fusion des vésicules et la récupération sur le site présynaptique. Un grand nombre de protéines impliquées dans la dynamique des vésicules ont été identifiés; Toutefois, leur contribution spécifique au phénomène reste à préciser une. Notre compréhension est en partie limitée par le fait que les tests les plus largement utilisés pour exo / endocytose ne sont pas toujours les plus appropriées. Plusieurs études relatives à la fusion des vésicules et la dynamique reposent sur des techniques électrophysiologiques. Cette technique fournit une résolution temporelle optimale et est excellent pour enquêter sur la fusion initiale des vésicules à la membrane plasmique, mais est incapable de détecter la plupart des événements moléculaires sous-jacents qui soutiennent la fonction présynaptique. La microscopie électronique, de l&#39;autre côté, fournit le meilleur morphological description de chaque étape singulière, mais l&#39;aspect dynamique de l&#39;événement ne peut pas être capturé, parce que les échantillons doivent être fixés de façon à être analysé. L&#39;avènement de nouvelles techniques d&#39;enregistrement optique 2,3, en combinaison avec les progrès de la fluorescence des sondes moléculaires développement 4-6, permet la visualisation des processus d&#39;exocytose dans les cellules vivantes, fournissant ainsi de nouveaux niveaux d&#39;information sur la structure et la fonction synaptique. Les premières études exploitées colorants dépendants de l&#39;activité styryliques (FM1-43 et colorants organiques connexes) 7,8. State-of-the-art techniques d&#39;imagerie utilisent des variantes sensibles au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) (pHluorin) attaché à vésicules luminal protéines neuf. Ces sondes sont normalement désactivés lorsqu&#39;ils sont présents dans les vésicules en raison du faible pH luminal. Après la fusion avec la membrane plasmatique, l&#39;intérieur des vésicules est exposée à l&#39;espace extracellulaire neutre, le pH<html> brusquement augmente, soulage la trempe de protons dépend de pHluorin et le signal fluorescent apparaît rapidement. Comme la variation de pHluorin est plus rapide que l&#39;événement de fusion, en contrôlant la fluorescence augmente, la fusion des vésicules avec la membrane peut être mesurée et analysée. Étant donné que les molécules d&#39;pHluorin surface sont marqués endocytose, le signal de fluorescence retourne ensuite au niveau de base, par conséquent la même construction peut également être utilisée pour contrôler le recyclage des vésicules 9. Bien que le capteur de pH des vésicules à marquage assure uniquement la visualisation de ces vésicules qui fusionnent vraiment avec la membrane plasmique, l&#39;imagerie à résolution spatiale et temporelle élevée est nécessaire de décrire en détail les étapes intervenant dans les processus d&#39;endocytose exo /. La technique optique qui fournit la résolution spatio-temporelle est nécessaire microscopie de réflexion totale interne de fluorescence (TIRFM), une demande de 10 microscopie à fluorescence. &quot;&gt; La réflexion interne totale se produit à l&#39;interface entre le verre lamelle et l&#39;échantillon. Lorsque le trajet de la lumière atteint la lamelle de avec un angle d&#39;incidence supérieur à l&#39;angle critique, la lumière d&#39;excitation ne est pas transmise dans l&#39;échantillon, mais est complètement réfléchie. Dans ces conditions, un évanescentes formes d&#39;onde de la lumière à l&#39;interface et se propage dans le milieu avec moins de densité optique (l&#39;échantillon). Comme l&#39;intensité du champ évanescent décroît exponentiellement avec la distance de l&#39;interface (avec une profondeur de pénétration environ 100 nm) que les fluorophores à proximité la plus proche de la lamelle couvre-objet peut être excité, tandis que ceux plus éloignés de la limite sont pas. Dans les cellules transfectées avec GFP-assemblage, cette profondeur correspond à des protéines exprimés sur la membrane plasmique ou dans des structures vésiculaires approcher. Comme fluorophores dans l&#39;intérieur de la cellule ne peuvent pas être excités, la fluorescence de fond est minimisée, et une image avec un signal très élevé / fond ratio est formée 11. Plusieurs caractéristiques font TIRFM la technique de choix pour la surveillance de la dynamique des vésicules. Le contraste parfait et le rapport signal-bruit ratio élevé permettent la détection de très faibles signaux découlant de vésicules simples. acquisition d&#39;image à base de puce dans chaque trame fournit la résolution temporelle nécessaire pour détecter des processus hautement dynamiques. Enfin, l&#39;exposition minimal de cellules à la lumière à tout autre plan dans l&#39;échantillon réduit fortement phototoxicité et permet l&#39;enregistrement longue durée time-lapse 12. L&#39;analyse des données reste l&#39;aspect le plus difficile et crucial de cette technique. La façon la plus simple de contrôler la fusion des vésicules est de mesurer l&#39;accumulation de protéines fluorescentes reporter à la surface de la cellule, au fil du temps 13. Comme fusion augmente, le signal de fluorescence augmente ainsi nettes. Cependant, cette méthode peut sous-estimer le processus, en particulier dans les grandes cellules et dans des conditions de repos,parce que les processus d&#39;endocytose et photoblanchiment compensé l&#39;augmentation de l&#39;intensité de fluorescence due à la vésicule exocytose. Une autre méthode consiste à suivre chaque événement de fusion unique 14. Cette dernière méthode est très sensible et peut révéler des détails importants sur les mécanismes de fusion. Cependant, il nécessite la sélection manuelle des événements uniques, parce que les procédures à suivre complètement automatisés vésicules et d&#39;enregistrer la fluctuation de leurs signaux fluorescents sont pas toujours disponibles. L&#39;observation de la dynamique des vésicules nécessite cellules d&#39;échantillonnage à haute fréquence. Cela génère une grande quantité de données qui peuvent difficilement être analysée manuellement. La proposition de ce document est d&#39;optimiser la technique d&#39;imagerie de TIRFM de surveillance de la base et la libération de neurotransmetteurs stimulée dans la lignée de cellules de neuroblastome SH-5YSY, et de décrire, étape par étape, une procédure développée dans le laboratoire pour analyser les données, à la fois à des niveaux de cellules entières et unique vésicules.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Équipement</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>491912-9850-000</td><td>microscope inversé</td></tr><tr><td>Laser Argon multiligne Lasos 77</td><td><a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lasos</a></td><td>00000-1312-752</td><td>laser à ions argon multiligne (458/488/514 nm), 100&amp;nbsp;mW</td></tr><tr><td>Lame TIRF laser</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>423681-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Objectif 100X</td><td><a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;amp;p=us&amp;amp;f=o&amp;amp;a=v&amp;amp;m=a&amp;amp;id=421190-9900-000&amp;amp;ss=1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>421190-9900-000</td><td>à immersion, NA 1,45 Alpha-Plan</td></tr><tr><td>Caméra CCD RetigaSRV Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> QImaging</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Changement optique de filtres LAMBDA 10-3 avec SmartShutter</td><td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sutter Instrument Company</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Logiciels</td></tr><tr><td>Logiciel Image ProPlus 6.3</td><td><a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td></td><td>sélection de points, sélection de régions d’intérêt (ROI), détermination de l’intensité de fluorescence</td></tr><tr><td>Excel</td><td><a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td></td><td>correction du photoblanchiment, analyses au niveau de la cellule entière et des vésicules individuelles</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad Software, Inc.</a></td><td></td><td>analyse statistique</td></tr></tbody></table>

tirfm et gfp-sondes sensibles au ph pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur dynamics dans les cellules sh-sy5y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Les vésicules synaptiques libèrent des neurotransmetteurs au niveau des synapses chimiques à travers un cycle dynamique de la fusion et la récupération. Suivi de l&#39;activité synaptique en temps réel et disséquer les différentes étapes de exo-endocytose au niveau d&#39;une seule vésicule sont cruciales pour comprendre les fonctions synaptiques dans la santé et la maladie. Génétiquement codés sondes sensibles au pH visant directement les vésicules synaptiques et réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) fournissent la résolution spatio-temporelle nécessaire de suivre la dynamique de vésicules. Le champ évanescent généré par réflexion interne totale ne peut exciter des fluorophores placés dans une couche mince (&lt;150 nm) au-dessus du couvercle de verre sur lequel les cellules adhèrent, exactement là où les processus de exo-endocytose ont lieu. Les images à contraste élevé qui en résultent sont parfaitement adaptés pour des vésicules suivi et l&#39;analyse quantitative des événements de fusion. Dans ce protocole, SH-SY5Y n humainecellules euroblastoma sont proposées comme un modèle précieux pour étudier la libération de neurotransmetteurs au niveau d&#39;une seule vésicule par TIRFM, en raison de leur surface plane et la présence de vésicules dispersées. Les méthodes pour la culture de SH-SY5Y comme cellules adhérentes et pour leur transfection avec synapto-pHluorin sont fournis, ainsi que la technique pour effectuer l&#39;imagerie et TIRFM. Enfin, une stratégie visant à sélectionner, compter et analyser les événements de fusion au niveau des cellules entières et unique vésicules est présenté. Pour valider la procédure d&#39;imagerie et l&#39;analyse des données approche, la dynamique de vésicules pHluorin-marqués sont analysés en vertu de repos et stimulés (dépolarisants concentrations de potassium) conditions. Dépolarisation membranaire augmente la fréquence des événements de fusion et provoque une augmentation parallèle du signal de fluorescence nette enregistrée dans la cellule ensemble. Analyse d&#39;un seul vésicules révèle modifications de comportement fusion-événement (hauteur accrue de pointe et la largeur). Ces données suggèrent eà la dépolarisation de potassium non seulement induit une libération de neurotransmetteurs massive, mais modifie également le mécanisme de la fusion des vésicules et le recyclage. Avec la sonde fluorescente approprié, cette technique peut être utilisée dans différents systèmes cellulaires pour disséquer les mécanismes de sécrétion constitutive et stimulée.

Les procédures de la FRBR imagerie et analyse des données décrites sont conçus pour étudier la dynamique des vésicules dans les systèmes cellulaires. Cette technique peut être utilisée pour déterminer les effets de molécules de signalisation et des médicaments sur les événements de fusion et de la dynamique des vésicules 17 neurotransmetteur. Utilisation de protéines de membrane de plasma GFP étiqueté, l&#39;analyse de la TIRFM a été utilisée pour caractériser le trafic constitutive de transporteurs de glutam...

Cet article propose une méthode pour étudier la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome, à l’aide d’une construction synaptobrevin2-pHluorin et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. La stratégie développée pour le traitement d’images et l’analyse des données est également rapportée.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l&#39;évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la dynamique des vésicules des neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome à l’aide de sondes sensibles au pH et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale ou de la terre de gazon. Ceci est accompli en plaquant d’abord les cellules sur des lamelles de verre et en les transectant avec des sondes fluorescentes sensibles au pH génétiquement codées de fusion et de recyclage des vésicules, qui sont sélectivement ciblées sur les vésicules synaptiques. L’expression des protéines est attendue dans les 24 à 48 heures.La deuxième étape consiste à enregistrer la dynamique des vésicules par microscopie à réflexion interne totale. Cette étape est particulièrement critique pour le succès de l’expérience et une description étape par étape de la configuration du gazon est fournie. Prochain. Une fois la configuration correcte du gazon atteinte, les images séquentielles peuvent être automatiquement enregistrées par le logiciel dans des conditions basales ou stimulées.La dernière étape consiste à traiter les images et à extraire les données des vidéos à l’aide d’un logiciel commercial ou d’algorithmes faits maison. En fin de compte, nous avons utilisé la microscopie sur gazon pour enregistrer les changements dans le signal fluorescent dérivé de la fusion des vésicules vers la membrane plasmique. Il est possible d’obtenir des informations sur la fréquence des événements de fusion et le mode de fusion des vésicules.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme par exemple l’électromicroscopie et l’électrophysiologie, est qu’elle fournit une solution à la fois spéciale et temporaire nécessaire pour détecter la dynamique des vésicules. En effet, les images très contrastées obtenues par cette technique permettent de détecter des signaux provenant de vésicules uniques. L’analyse d’acquisition d’image de base bon marché fournit la solution temporaire nécessaire pour détecter la dynamique.Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la science nerveuse, comme la compréhension du rôle d’une protéine synaptique particulière sur la dynamique des vélos, ou le mécanisme d’action des médicaments agissant sur les transmissions synaptiques. En général, les personnes novices en la matière ont du mal avec cette analyse parce que des procédures entièrement automatiques pour suivre la vésicule et enregistrer la fluctuation du signal PROEs ne sont pas toujours disponibles. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons décidé d’étudier l’impact d’une protéine mutante ou synaptique pathogène sur la libération des vésicules du transmetteur Nevo.Les méthodes existantes n’étant pas suffisamment complètes, nous décidons donc de mettre en place cette technique dans la lignée cellulaire du neuroblastome SH SY five one pour parvenir à la solution appropriée. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes clés, telles que la façon d’obtenir la configuration de niveau quatre et la façon d’extraire les données quantitatives des vidéos, sont essentielles à expliquer à l’aide de mots, tout en étant plus compréhensibles et persuasives. Si visualisé.Pour effectuer l’imagerie du gazon, installez un microscope inversé motorisé, une source laser et le curseur du gazon comme indiqué dans le protocole texte. Pour obtenir un éclairage du gazon. Retirez le couvercle en verre avec les cellules transfectées et insérez-le dans la chambre d’imagerie appropriée.Assemblez la chambre et ajoutez 500 microlitres de solution de sonnerie Krebs au centre du verre. Ajoutez ensuite de l’huile sur l’objectif. Placez la chambre d’imagerie sur la platine du microscope et placez l’objectif sous la lamelle en verre.Positionnez le couvercle de sécurité sur l’échantillon en mode épifluorescence. Concentrez-vous sur la lamelle de recouvrement et choisissez des cellules transfectées placées au centre de la chambre sous contrôle logiciel. Passez à l’éclairage du gazon en mode direct.Pour régler la configuration du gazon, vérifiez la position du faisceau qui sort de l’objectif sur le couvercle de l’échantillon. Lorsque le faisceau est positionné au centre de la lentille de l’objectif, un point est visible au centre de la couverture de l’échantillon de gazon et la cellule est imagée en mode épifluorescence. Pour atteindre l’angle critique, déplacez le point focalisé dans la direction Y à l’aide de la vis de réglage de l’angle sur le curseur de gazon.Lorsque le faisceau converge sur le plan de l’échantillon à un angle supérieur à l’angle critique, la tache disparaît et une fine ligne focalisée droite est évidente au milieu de la couverture de l’échantillon. Pour affiner l’angle du gazon, utilisez un échantillon de cellule. Regardez l’image de fluorescence sur la vidéo.À ce stade, une image semblable à celle de l’épifluorescence est encore visible. Déplacez doucement la vis jusqu’à ce que l’état du gazon soit atteint. Ici, un seul plan optique de la cellule est net, ce qui donne une image plate avec un contraste élevé.Pour effectuer l’imagerie d’échantillons, réglez l’expérience time-lapse sur un seul canal de manière à ce que les temps d’exposition appropriés soient compris entre 40 et 80 millisecondes. Acquérez des images à une fréquence d’échantillonnage d’un ou deux hertz. Ajoutez 500 microlitres de solution de ringer Krebs et enregistrez les cellules en mode microscopie sur gazon.Enregistrez les images séquentielles temporelles de l’état de repos. Concentrez-vous sur la même cellule et enregistrez dans les mêmes conditions de repos. Après cinq images, ajoutez cinq microlitres de solution de chlorure de potassium et conservez le chlorure de potassium dans la chambre.Gagnez du temps. Images séquentielles de la condition stimulée. Utilisez une macro d’intensité de fluorescence de séquence pour l’intensité de fluorescence, la quantification dans une région d’intérêt ou la valeur d’intérêt de l’image au cours de la vidéo.Pour ce faire, ouvrez d’abord les images séquentielles dans le temps. Allez dans le menu macro et sélectionnez l’intensité de fluorescence de la séquence. Dans la fenêtre d’analyse, naviguez.Pour sélectionner le retour sur investissement, choisissez l’un des outils de sélection dans le menu. Pour créer le retour sur investissement, placez trois zones d’intérêt dans des régions de la membrane cellulaire sans taches. Pour l’image de fond de l’arrière-plan, j’utilise ce retour d’intérêt d’arrière-plan pour évaluer le blanchiment des photos et définir le seuil d’analyse des événements de fusion.Une fois le ROI sélectionné, cliquez sur OK. Calculez automatiquement l’intensité de fluorescence moyenne de chaque retour sur investissement au cours du film, exportez les données vers un tableur pour une analyse plus approfondie. Pour évaluer le blanchiment photo, l’intensité de la fluorescence a augmenté.Les ROI d’arrière-plan normalisent les valeurs d’intensité de fluorescence dans chaque image à la valeur d’intensité initiale et font la moyenne des valeurs. Mettez en surbrillance les données moyennes et créez un graphique linéaire à l’aide des options du menu du graphique. Dans le menu d’analyse des données, sélectionnez Courbe de tendance pour ouvrir la boîte de dialogue d’analyse du tracé.Définissez le type de régression sur Régression exponentielle. Sélectionnez ensuite Afficher l’équation sur le graphique. Dans la fenêtre du graphique, l’équation exponentielle apparaît et les valeurs des paramètres sont automatiquement attribuées.Après avoir appliqué la correction exponentielle aux valeurs d’intensité comme décrit dans le protocole de texte, réglez le seuil en ouvrant un arrière-plan normalisé et corrigé. Le ROI calcule ensuite le signal fluorescent moyen et son écart-type. La valeur moyenne plus trois unités d’écart-type représente le seuil.Pour sélectionner les événements de fusion. Tout d’abord, ouvrez les images séquentielles dans le temps avec un logiciel d’analyse d’images, appliquez un filtre gaussien à la séquence d’images active. Analysez les images à l’aide de l’outil comptage des objets ou d’une macro, ce qui permet de sélectionner un objet dont les pixels ont une intensité de fluorescence moyenne dans une plage définie.Définissez manuellement la plage d’intensité à l’aide de la fonction de seuil, appliquez une macro, filtrez les objets pour ne sélectionner que les objets répondant à des critères spécifiques. Appliquez d’abord l’option plages pour l’aspect. L’aspect indique le rapport entre le grand axe et le petit axe de l’ellipse équivalente à l’objet.Les valeurs adéquates pour l’aspect sont un minimum de un et un maximum de 2,3. Appliquez ensuite des plages pour le critère de diamètre En pixels le diamètre indique la longueur moyenne des diamètres mesurés à deux degrés d’intervalle, joignant deux points délimités et passant par l’OID de l’objet. Sélectionnez ensuite les objets d’affichage.Les objets sélectionnés apparaîtront superposés à l’indice de l’image de microscopie du gazon dans l’analyse uniquement les points qui montrent une courte augmentation transitoire de l’intensité de la fluorescence immédiatement suivie d’une perte marquée du signal. Utilisez manuellement la sélection circulaire pour créer une zone d’intérêt d’environ un diamètre de spot radialement autour de la vésicule sélectionnée. Une fois la zone d’intérêt sélectionnée, calculez l’intensité de fluorescence moyenne de chaque zone d’intérêt au cours du film.Exportez l’évolution temporelle des changements de fluorescence mesurés dans chaque retour sur investissement expérimental vers une feuille de calcul pour normaliser la valeur d’intensité dans chaque image à l’intensité de fluorescence initiale. Après avoir appliqué la correction exponentielle aux valeurs d’intensité de chaque image, comme précédemment, appliquez des fonctions logiques à l’aide d’un tableur ou de progiciels mathématiques pour calculer le nombre total d’événements de fusion, l’heure à laquelle chaque fusion se produit et l’amplitude du pic fluorescent. Supposons que l’augmentation de l’intensité de la fluorescence dépasse le seuil de fusion des vésicules avec la membrane plasmique et le pic résultant soit un événement de fusion.Calculez la largeur du pic comme la différence entre la dernière et la première valeur X de chaque pic. Multipliez ensuite cette valeur par un sur la fréquence d’échantillonnage. Considérez cette valeur comme le temps de fusion et d’adhésion des vésicules au niveau de la membrane plasmique avant la vésicule, la réacidification et le recyclage.Ensuite, calculez l’aire totale de la cellule sous la courbe comme la somme des valeurs au-dessus du seuil. Considérez cette valeur comme une variation fluorescente nette Pendant le temps d’enregistrement dû à l’activité synaptique spontanée ou évoquée, calculez la hauteur du pic comme la différence entre la valeur y maximale de chaque pic et le seuil, et considérez cette valeur comme indicative du type de fusion. Dans l’analyse de cellules entières, le nombre total et la fréquence des événements de fusion se produisant dans la cellule sont analysés dans des conditions de repos.De temps en temps, les vésicules s’approchent de la membrane plasmique et fusionnent avec elle dans le tracé de l’intensité fluorescente. Cela se traduit par un changement brusque de l’intensité de la fluorescence au-dessus du seuil après l’application du stimulus secrétaire. Différents pics d’intensité de fluorescence variable apparaissent soudainement dans le graphique du profil d’intensité de fluorescence.Notez l’augmentation du nombre de pics et de la hauteur après la stimulation potassique. Dans l’analyse de pic unique, chaque événement de fusion est analysé. Deux paramètres sont mesurés.La largeur du pic, qui correspond au temps de la vésicule, de l’adhésion et de la fusion à la membrane plasmique, ainsi que la hauteur du pic, qui reflète le mécanisme de fusion du pic. Sous dépolarisation potassique, la hauteur et la largeur du pic augmentent, reflétant un changement dans la fusion de la vésicule motrice avec la membrane plasmique. Lors de l’assistance à cette procédure, il est important de se rappeler que cette technique ne peut permettre que la visualisation de l’événement qui se déroule au niveau de la membrane plasmique ou immédiatement après cette procédure.D’autres méthodes, comme une microscopie riche, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le sort des bicyclettes internalisées, des protéines dans les cellules après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs travaillant dans le domaine de la biologie cellulaire et de la physiologie pour étudier les événements dynamiques se produisant au niveau de la membrane personnelle, tels que l’exocytose vésicale, l’édition de la matrice cellulaire et les flux d’ions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une configuration de niveau quatre, d’enregistrer la dynamique verticale et d’analyser les données.

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

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En marquant les domaines extracellulaires des récepteurs membranaires avec pHluorin superecliptic, et par imagerie par ces récepteurs de fusion dans les neurones de souris en culture, on peut directement visualiser les différents événements d'insertion vésiculaires des récepteurs à la membrane plasmique. Cette technique permet de contribuer à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent l'insertion du récepteur à la membrane plasmique.

Imagerie pHluorin-étiqueté insertion du récepteur de la membrane plasmique dans les neurones primaires de souris en culture

Cette vidéo montre comment les vésicules neuronales sont marquées avec des protéines fluorescentes spécifiques pour visualiser leur mouvement. Tout d’abord, un plasmide codant pour une protéine fluorescente est incubé avec un agent de transfection, puis introduit dans une culture de neurones. Par la suite, des images des neurones sont acquises et analysées pour suivre le mouvement des vésicules.

Visualisation des motilités vésiculaires dans les neurones à l’aide de l’imagerie par fluorescence

Source : Daniele, F., et. al Sondes TIRFM et GFP sensibles au pH pour évaluer la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y : imagerie cellulaire et analyse des données. J. vis. exp. (2015). Cette vidéo montre l’imagerie de cellules de neuroblastome humain à l’aide d’un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les vésicules synaptiques marquées au fluorophore. Les cellules sont d’abord focalisées en mode...

Imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale

Source : Lacin, E., et al. Construction de neurotransmetteurs fluorescents à base de cellules (CNiFERs) pour la détection optique de neurotransmetteurs in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo présente une technique d’imagerie de la libération de neurotransmetteurs in vivo à l’aide de neurotransmetteurs à base de cellules CNiFERs, des cellules rapporteures spécialisées pré-injectées dans le cortex de la souris. Positionnée sous un microscope à deux photons, la souris permet de visualiser la...

Imagerie de la libération de neurotransmetteurs à l’aide de rapporteurs fluorescents de neurotransmetteurs à base de cellules

Etiquetage du domaine extracellulaire d'une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l'expression et le trafic à déterminer. les protéines d'imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

L'étude du trafic membranaire est cruciale pour comprendre les fonctions neuronales. Ici, nous introduisons un procédé pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones. C'est une méthode pratique qui peut être adaptée à la quantification du trafic membranaire dans le système nerveux.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

Endocytose Vésicule synaptique est détectée par microscopie de pHluorin fusionnée avec des protéines de la vésicule synaptique et par microscopie électronique de l’absorption de la vésicule.

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

Une analyse optique pour le recyclage de vésicule synaptique dans les neurones en culture surexprimant protéines présynaptiques

Les maladies neurodégénératives sont associées à des fonctions microgliales dérégulées. Cet article décrit un test in vitro de phagocytose des cellules de neuroblastome par les macrophages iPSC. Les lectures de microscopie quantitative sont décrites à la fois pour l’imagerie time-lapse sur cellules vivantes et l’imagerie à haut contenu à cellules fixes.

Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par iPSC-Macrophages

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

La jonction neuromusculaire larvaire du poisson-zèbre est un modèle intéressant pour l’étude de la physiologie synaptique. Il se prête à de nombreuses techniques expérimentales, notamment l’électrophysiologie et l’imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole d’imagerie de la transmission synaptique à l’aide d’une sonde à base de pHluorin sous un microscope à épifluorescence vertical.

Imagerie en direct du recyclage des vésicules synaptiques dans la jonction neuromusculaire de larves de poisson-zèbre disséquées

Découvrez la dynamique des vésicules de neurotransmetteur dans les cellules SH-SY5Y par microscopie TIRFM et sondes GFP sensibles au pH. Cette méthode permet d'étudier la fusion vésiculaire avec haute résolution spatiale et temporelle.

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour lévaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données (Vidéo) | JoVE Journal

TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l'évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

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