Reconstitution d'une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

L’objectif global de l’expérience suivante est d’incorporer des canaux ioniques voltage-dépendants dans des vésicules unilamellaires géantes et de caractériser leur activité à l’aide de mesures par patch clamp. Ceci est réalisé en déshydratant d’abord partiellement, une solution de petites vésicules contenant le canal ionique KVAP pour créer un film protéique lipidique. Ensuite, le film lipidique est réhydraté, ce qui provoque la formation et la croissance de vésicules ALR géantes de la taille d’une cellule ou gvs contenant le canal.

Ensuite, les gvs sont transférés dans notre chambre d’enregistrement et un morceau de membrane GUV est excisé avec une pipette patch afin de mesurer les courants ioniques. Les résultats montrent que les canaux ioniques dans la membrane GUV s’activent en réponse aux changements de tension de la membrane sur la base de l’analyse des enregistrements de courant. Les physiques unilatérales géantes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique liées aux interactions entre les protéines membranaires.

Par exemple, l’interaction des protéines transmembranaires avec les propriétés physiques de la membrane lipidique. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la fonction du canal de fer dépendant de la tension KVAP, elle peut également être appliquée à d’autres canaux de fer, transporteurs et pompes, ainsi qu’aux protéines transmembranaires en général. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, tout comme les étapes impliquant la manipulation de vésicules géantes le sont.

Comment ramasser juste en lisant des articles Après avoir préparé des solutions et de petites vésicules unales contenant KVAP. Selon le protocole du texte, préparez la chambre d’électroformation en insérant d’abord les fils à travers les trous et en faisant pivoter et essuyant les fils pour vous assurer qu’ils sont propres, exposés au soleil et séchant sous un courant d’azote ou d’air. Préparez 30 microlitres de suspension SUV de trois milligrammes par millilitre dans le tampon SUV comme décrit dans le protocole texte, mélangez vigoureusement la solution pour déposer la solution SUV.

Utilisez une pipette de deux microlitres ou une seringue en verre de cinq microlitres pour placer de petites gouttelettes de la solution SUV sur les fils. Assurez-vous que les gouttes sont suffisamment petites et suffisamment espacées pour qu’elles ne se touchent pas ou ne fusionnent pas. Laissez sécher les SUV déposés pendant environ 30 minutes à l’air libre.

Lorsque les gouttelettes se sont déposées, tournez le fil de manière à ce que les dépôts lipidiques soient plus faciles à observer au microscope. Ensuite, à l’aide d’une seringue, appliquez de la graisse sous vide au fond de la chambre autour des trois puits et appuyez doucement sur une glissière de 40 millimètres sur 22 millimètres contre celle-ci pour sceller le fond de la chambre afin qu’elle adhère sans espace. Ensuite, utilisez de la pâte à plafond pour sceller les côtés de la chambre et appliquez de la graisse sous vide sur le dessus de la chambre en délimitant les trois puits.

Ajoutez lentement un tampon de croissance jusqu’à ce que chaque puits soit rempli jusqu’en haut. Évitez tout mouvement rapide de la solution dans les puits car cela peut être fait. Retirez le film lipidique des électrodes.

Fermez la chambre en appuyant doucement sur la glissière du capot supérieur sur la graisse. En prenant soin de ne pas déloger la cale inférieure. Utilisez deux pinces crocodiles pour connecter le générateur de signaux aux fils.

Réglez la fréquence en fonction de la concentration en sel du tampon utilisé et à l’aide d’un multimètre, mesurez et ajustez la tension aux bornes des fils. Toujours selon votre tampon, utilisez du papier d’aluminium pour couvrir la chambre afin de protéger les quatre flores de la lumière. Laissez les G UUV croître pendant deux à trois heures dans le tampon à faible teneur en sel et 12 heures ou toute la nuit pour le tampon à haute teneur en sel.

Après l’incubation, débranchez la chambre du générateur et placez-la soigneusement sur un microscope inversé. Pour évaluer le plasma de croissance GUV, nettoyez une lame de couverture pendant une minute afin que la solution ARO s’étale bien dessus. Dans les 15 minutes suivant le nettoyage de la diapositive de couverture, appliquez 200 microlitres de solution d’aro chaude préparée selon le protocole de texte afin qu’elle mouille toute la surface.

Inclinez la lame verticalement et touchez le bord inférieur d’un mouchoir en papier pour éliminer l’excès de liquide, laissant une fine couche lisse d’aros sur la lame. Placez la diapositive sur une plaque chauffante ou un four à 60 degrés Celsius et laissez-la sécher pendant au moins 30 minutes. Ensuite, placez une lamelle enrobée AROS dans une boîte de Pétri standard de 3,5 centimètres.

Ensuite, après avoir préparé la solution SUV, appliquez doucement environ 15 microlitres en environ 30 très petites gouttes sur la surface de l’aros. Veillez à ne pas trop déformer la couche aros. Placez la lame sous un léger jet d’azote pendant environ 10 à 15 minutes et suivez l’évaporation du tampon à l’œil nu.

Au fur et à mesure que les gouttelettes sèchent dès que les VUS ont séché, ajoutez environ un millilitre de tampon de croissance pour couvrir la surface de glissement. Laissez le gonflement se poursuivre pendant environ 30 minutes, puis utilisez un microscope inversé avec contraste de phase ou DIC Pour examiner la croissance des UUV GU dans la chambre de croissance pour patcher clamp gu UUVs mangé la chambre en ajoutant une solution bêta de Caine de cinq milligrammes par millilitre, ce qui empêche le Gus d’adhérer, propagation et rupture. Incuber pendant cinq minutes et rincer, insérer l’électrode de terre et utiliser un tampon d’observation pour remplir la chambre.

Ensuite, transférez les UUV G dans la chambre d’observation pour les UUV GU électroformés. Ouvrez la chambre de croissance en retirant délicatement la lamelle du couvercle supérieur. Placez la pointe de la pipette directement au-dessus de chaque fil et pour détacher les UUV GU, aspirez lentement environ 10 microlitres tout en déplaçant la pointe de la pipette le long du fil pour le gonflement assisté par gel des UUV GU.

Tapotez d’abord plusieurs fois le côté de la boîte de Pétri pour détacher les UUV GU de la surface de la lamelle. Positionnez la pointe de la pipette juste au-dessus de la lamelle et aspirez 10 microlitres tout en tirant la pointe vers l’arrière sur la surface, transférez directement le GVS récolté dans la chambre d’observation. Attendez quelques minutes que le Gus se stabilise au fond pour réparer le GVS.

Utilisez un tampon d’observation pour remplir une pipette patch neuve et montez-la sur la platine de la tête de serrage de patch. Fouillez la chambre pour trouver un GUV sans défaut et vérifiez qu’il contient une protéine fluorescente. Appliquez une pression positive constante de plus de 100 pascals pour garder l’intérieur de la pipette patch propre et insérez la pipette patch dans la chambre.

Placez la pipette patch dans le champ de vision et appliquez des impulsions de test pour mesurer ou compenser le décalage de tension et la résistance de la pipette. Examinez ensuite la pipette sous un éclairage fluorescent pour confirmer que la pointe est propre. Amenez la pipette patch vers le GUV et, si nécessaire, réduisez simultanément la pression positive afin que le flux sortant de la pipette patch ne fasse pas fuir le GUV.

Lorsque la pipette patch est proche de la GUV, appliquez une pression négative pour tirer la GUV contre la pipette patch. Surveillez la résistance lorsque la languette de la membrane GUV pénètre dans la pipette patch et que le giga joint se forme. Lorsque le patch de membrane à l’envers a été retiré du GUV et que le joint giga est stable, coupez les impulsions de test et appliquez un protocole de tension comme indiqué dans le texte.

Cette figure montre des images DIC et épifluorescence d’un GUV sans défaut. La fluorescence uniforme des protéines dans la membrane GUV confirme que KVAP est incorporé dans le GUV plutôt que de rester dans le film lipidique et n’a pas formé d’agrégats Gus produits à l’aide des trois méthodes que l’on voit ici. Les signaux lipidiques et protéiques fluorescents ont été mis à l’échelle à la même densité moyenne, de sorte que les UUV g avec une densité protéique faible ou élevée ont une teinte magenta ou verte dans les images de superposition, tandis que les GVS avec une densité protéique moyenne sont blancs.

Des UUV G isolés sans défaut ont été identifiés et la distribution granulométrique des GUV est illustrée ici. En règle générale, l’électroformation produit plus d’UUV G sans défaut que le gonflement assisté par gel, mais les GUS produits par l’électroformation sont plus petits. La distribution de la densité protéique déduite de la fluorescence GUV est illustrée ici.

L’électroformation avec un tampon salin élevé produit des UUV GU avec des densités de protéines variables. La densité varie beaucoup moins pour l’électroformation avec un faible tampon salin et la densité protéique des UUV GU produits par le gonflement assisté par gel est remarquablement uniforme en fonction de la concentration en protéines dans le patch excisé. Les traces actuelles montrent soit des canaux uniques, soit un ensemble de canaux.

KVAP montre l’ouverture dépendante de la tension. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler les vésicules géantes d’objets fragiles non résistants au stress pur et osmotique. À la suite de cette procédure, des méthodes telles que l’extraction de nanotubes lipidiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la détection de courbure des protéines.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des GVS contenant des protéines fonctionnellement reconstituées.