Name: Méthode simple pour lADN fluorescence In Situ Hybridation des chromosomes écrasé (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Apprenez une méthode simple d'hybridation in situ par fluorescence de l'ADN pour visualiser les séquences hétérochromatiques sur les chromosomes de Drosophila. Cette technique utilise des oligosondes synthétisées et la microscopie à fluorescence.

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Nous remercions Zhaohua Irene Tang du département des sciences de W. M. Keck pour l’utilisation de son microscope à épifluorescence et le laboratoire Werren pour avoir fait don de Nasonia pour les dissections. Ce travail a été soutenu en partie par une bourse NIH-NRSA (5F32GM105317-02) à la lutte contre le blanchiment d’argent.

1. Tissue Dissection et fixation (60 min) <ol><li> Pour cerveaux drosophile, placer 3 ème stade larvaire dans une goutte de 1x PBS (tampon phosphate salin). Choisissez grand stade larvaire 3 ème qui sont activement l&#39;exploration à partir des flacons ou des bouteilles qui ne sont pas surpeuplées. <ol><li> Utilisez une pince à épiler ultrafine paire de se emparer de la bouche des crochets et une autre paire de pince pour saisir 2/3 sur la longueur du corps (figure 1A, B). Tirez doucement sur la bouche crochets pour exposer le cerveau, les ganglions ventrale, glandes salivaires et une partie du tube digestif des larves. Utilisez la pince à épiler pour séparer le cerveau et les ganglions ventrale (figure 1A, B) des autres tissus et les placer dans une gouttelette de 1x PBT (tampon phosphate salin avec du Tween) sur une plaque de Petri en plastique. </li></ol></li><li> Pour Nasonia dissections des testicules, choisissez mâle 3-day-old pupes (corps jaune avec des yeux rouges). Homme Nasonia ont de petites longueurs de rembourrage d&#39;aile par rapport à females pendant le stade de pupe (figure 1C). <ol><li> Maintenez la nymphe en haut de l&#39;abdomen près de la région thoracique avec une paire de pince à épiler, et en utilisant l&#39;autre paire de pince à épiler, prenez la pointe distale de l&#39;abdomen et sortir les testicules en forme de larme (ils seront entourés par de la graisse corps qui peut être doucement secoué loin; figure 1D). Détachez les pièces extérieures de carrosserie des testicules, ce qui empêchera l&#39;écrasement bon, et le placer dans une gouttelette de 1x PBT sur une plaque de Petri en plastique. </li></ol></li><li> Pour chaque diapositive, disséquer un total de quatre ou cinq échantillons de tissus (ce est à dire., Drosophila cerveaux larvaires ou testicules Nasonia). NOTE: Plus de cinq échantillons mèneront à noyaux et les chromosomes surpeuplées. </li><li> Eventuellement, pour atteindre une certaine séparation des chromatides soeurs dans les régions euchromatiques de chromosomes mitotiques, traiter le tissu avec une solution hypotonique: transférer cerveaux de 1x PBT à une baisse de citrate de sodium à 0,5% pour les 5-10 (pas plus de 10) min. NOTE: La colchicine (un inhibiteur mitotique) peut être utile pour augmenter le nombre de figures de mitose à la métaphase 11. Cependant, son utilisation ne est pas nécessaire si très grand larves saines sont utilisés, et même souhaitable car elle peut nuire à la résolution des chromosomes, la diffusion et la morphologie. </li><li> Placer une goutte (~ 20 ul) de solution de fixation (2,5% de paraformaldehyde dans de l&#39;acide acétique à 45%) sur la surface d&#39;une lamelle couvre-Sigmacote traité propre. NOTE: Préparer une solution de fixateur frais pour chaque jour d&#39;utilisation. Solutions fixateur allant de 1,8 à 3,7% de paraformaldehyde dans de l&#39;acide acétique 45% donnent les meilleurs résultats pour les poissons. En utilisant des tissus autres que le cerveau ou les testicules, ou l&#39;adaptation de ce protocole pour immuno-FISH peut exiger expérimenter avec différents fixateurs (pour une liste des différents fixateurs, voir 12). </li><li> Transférer soigneusement chaque échantillon de tissu de la mémoire tampon de dissection (1x PBT) dans la gouttelette fixateur avec des pincettes ultrafines, minimizing le transfert de dissection tampon dans la solution de fixateur. Placer les échantillons de tissu de sorte qu&#39;ils sont uniformément espacés les uns des autres à l&#39;intérieur de la gouttelette fixateur. Incuber les tissus de fixateur pendant 4 min à température ambiante. </li><li> Placez délicatement une surface de glissement poly-lysine vers le bas sur le glissement des tissus et de la couverture. Ne appuyez pas à ce point, mais au lieu de permettre aux deux à contacter légèrement de sorte que la lamelle colle sur la face inférieure de la diapositive. Inversez la diapositive de sorte que la lamelle est sur le dessus. </li><li> Sandwich glissement coulissant / tissus / couvercle intérieur d&#39;un morceau de papier plié de filtre. Sur une surface stable, avec le pouce, appuyez fermement vers le bas sur la position directement au-dessus de la lamelle. Soyez prudent pour éviter un glissement latéral de la lamelle (cela va provoquer des bavures du tissu). </li><li> Immerger la diapositive / tissus / lamelle dans l&#39;azote liquide (voir appareil de la figure 1E, F), et laisser reposer jusqu&#39;à ce que le azote arrête bouillante (plus est fine). Retirer la lame et enclenchez immédiatement la lamelle avec une lame de rasoir propre en appuyant sur un coin de la lamelle dans une direction ascendante (éviter de rayer le tissu fixe avec la lame de rasoir). <ol><li> Pré-refroidissement de la lame / tissus / lamelle sur un bloc de glace sèche, lamelle jusqu&#39;à, pendant 1-2 min avant immersion dans l&#39;azote liquide aidera à prévenir les diapositives de la fissuration. </li></ol></li><li> Placer immédiatement la diapositive avec le tissu dans une jarre Coplin remplie d&#39;éthanol à 100% à la température ambiante et laisser reposer pendant au moins 5 minutes (ce temps peut être plus long si nécessaire). REMARQUE: éthanol à 100% froid pourrait également être utilisé. </li><li> Retirer la lame avec le tissu, évacuer excès d&#39;éthanol avec un Kimwipe (sans toucher le tissu fixe), et de laisser la lame sécher à l&#39;air pendant 1 heure. <ol><li> Passez directement à l&#39;étape 2 ou garder diapositives secs dans l&#39;air à basse humidité ou dans une chambre de dessiccation pendant des semaines voire des mois à avant d&#39;effectuer l&#39;hybridation. </li></ol></li></ol> Figure 1: (A) Un 3 ème stade larve de drosophile (à droite), avec des positions indiquées pour savoir où récupérer les crochets buccaux (notée avec *) et 2/3 de la descente de la larves de disséquer le cerveau; (À gauche) un schéma d&#39;une larve d&#39;un même stade de développement, représentant la position relative du cerveau dans la tête des larves. (B) Le cerveau et les ganglions ventrale disséqué d&#39;une 3 ème stade larve de drosophile (à droite) et un schéma de ce tissus (à gauche). (C) 3-day-old nymphe Nasonia au stade de l&#39;oeil du corps rouge jaune. (D) Une paire de testicule disséqué d&#39;un homme âgé de nymphe 3 jours Nasonia (à droite) avec des positions indiquant où saisir la nymphe à la partie postérieure de l&#39;abdomen (désigné par *) et à mi-chemin sur le corps; (À gauche) schématique mâle et femelle était dépeignantp pupes; pupes mâles se distingue par des ailes qui ne se étendent pas au-delà du profil sagittal (flèche noire), contrairement aux femelles, qui ont des ailes qui se étendent au-delà du profil; la position relative de la paire de testicule est montré dans la nymphe mâle. (E) L&#39;appareil-une chaîne de trombones-et méthode (F) utilisés pour immerger les lames dans un récipient d&#39;azote liquide. Plusieurs chaînes de trombone peuvent être utilisés pour l&#39;immersion simultanée de plusieurs diapositives. 2. Hybridation in situ (30 min le jour 1; 1 h-2,5 heures pendant de longues sondes sur deux jours) <ol><li> Ajouter 1 pi (100 ng) de chaque sonde de 20 ul de tampon d&#39;hybridation 1,1x. Pipet sonde / tampon d&#39;hybridation sur la surface du tissu fixe (éviter de toucher le tissu). </li><li> Placez délicatement une lamelle directement sur le tampon sonde / hybridation, faire en sorte que la lamelle est centré directement sur le tissu. Le tampon doit migrer vers the bord extérieur de la lamelle, ne laissant aucune bulles d&#39;air. NOTE: Les petites bulles qui ne contactent pas les tissus ne pose pas de problèmes à la procédure. Retirer les grosses bulles en soulevant délicatement un coin de la lamelle et soigneusement laisser tomber en arrière sur la diapositive. </li><li> Placez le glissement coulissant / tissus / couvercle sur la surface d&#39;un bloc pré-chauffé à 95 ° C (couverture glisser vers le haut). Couvrir avec un grand morceau de papier d&#39;aluminium pour éviter exposition à la lumière. Laissez la diapositive incuber à 95 ° C pendant 5 min. REMARQUE: Un bloc de chaleur typique avec des trous pour les tubes peut être retourné pour fournir une surface plane sur laquelle placer la diapositive / tissus / lamelle. </li><li> Retirer la lame, le laisser refroidir légèrement jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit chaud au toucher. Envelopper soigneusement un morceau de Parafilm étiré autour de la lamelle pour sceller le liquide en dessous. </li><li> Placer la lame scellé à l&#39;intérieur d&#39;une chambre d&#39;humidité et placer la chambre dans un incubateur préchauffé à 30 ° C. Incuber à 30 ° C pendant 4 heures à une nuit.<ol><li> Créer une chambre humide à partir d&#39;une boîte de pointe vide ou un récipient à couvercle de Tupperware avec Kimwipes mouillées ou des serviettes en papier placés au fond. REMARQUE: Les sondes ADN simples brins oligonucléotidiques ont été conçues pour être de 28 à 33 bases pour atteindre une température de fusion théorique (T m) de 45 à 47 ° C. Ces longueur et T m fourchettes reflètent le fait que beaucoup de séquences répétitives que nous avons étudiés sont AT-riche et donc très faible teneur en GC. Des sondes plus longues auront probablement des valeurs plus élevées de m T; il peut en résulter une hybridation ultérieure de fond à la température d&#39;hybridation standard de 30 ° C. Ainsi, un peu de dépannage avec des températures d&#39;hybridation peut être nécessaire pour obtenir les meilleurs résultats. Pour trouver la meilleure température d&#39;hybridation, augmentation (ou diminution) de la température de 5 ° C, progressivement. </li></ol></li><li> Retirez délicatement le Parafilm de la diapositive, puis retirez soigneusement la lamelle en soulevant lentement un coin. Washingtonsh la diapositive trois fois pour 15 minutes chaque lavage dans un tampon SSC 0,1x. Couvrir la jarre de Coplin avec du papier d&#39;aluminium pendant les lavages à minimiser exposition à la lumière. </li><li> Si vous ne utilisez pas une longue sonde biotinylée, passez à l&#39;étape 2.8. <ol><li> Si vous utilisez une sonde à long biotinylé, sécher la zone autour du tissu avec un Kimwipe, en faisant attention de ne pas toucher le tissu lui-même. Placez 100 pi de solution de blocage sur le tissu et recouvrir délicatement avec une lamelle, en prenant soin d&#39;éviter les bulles de piégeage. Enveloppez la lame sur la lamelle avec du Parafilm et lieu à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirez délicatement la lamelle et épongez autour du tissu avec un Kimwipe. Distribuer 100 ul de la rhodamine-avidine diluée 1: 1000 dans les soins SBT sur le tissu et recouvrir délicatement avec une lamelle, en prenant pour éviter la formation de bulles. Enveloppez la lame sur la lamelle avec du Parafilm et lieu à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirez délicatement la lamelle et laver la lame 3 fois pendant 5 minutes chacun dans 4x SSCT puis3 fois pendant 5 min chacun dans 0,1x SSC. REMARQUE: Les diapositives peuvent être lavé pendant des périodes de temps plus longues. </li></ol></li><li> Retirer la lame et épongez autour du tissu avec un Kimwipe sec pour enlever l&#39;excès de tampon (éviter de toucher le tissu). Placez le côté tissu de glisser vers le haut dans un endroit sombre pendant 10-15 min ou jusqu&#39;à ce que l&#39;humidité se dissipe complètement. </li><li> Pipeter 11 ul de milieu de montage Vectashield (avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole-DAPI) sur le tissu. Placez délicatement une lamelle propre (pas traité avec Sigmacote) directement sur le centre du milieu de montage et de tissus. Le milieu de montage devrait migrer lentement vers l&#39;extérieur vers les bords de la lamelle. NOTE: Si le milieu de montage ne parvient pas à atteindre le bord de la lamelle sur tous les côtés, puis un 1-2 ul supplémentaire de milieu de montage peut être appliquée à une position au bord de la lamelle à remplir le volume nécessaire. Dans ce cas, veillez à essuyer tout excès du milieu de la surface de glissement avantétanchéité. </li><li> Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Évitez de peindre le vernis à ongles sur l&#39;échantillon de tissu. </li><li> Placer la lame en position verticale dans un endroit sombre et laisser le vernis à ongles à sec jusqu&#39;à ce que complètement dur (généralement 30 minutes ou plus). À ce stade, l&#39;image du tissu ou de conserver à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 1 semaine pour l&#39;imagerie tard. </li></ol> Buffer / Recettes Solution 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g de KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g de KH 2 PO 4 </li><li> pH à 7,4, H 2 O de 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml de PBS 10x </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g de NaCl </li><li> 88,2 g de citrate de Na </li><li> dans 800 ml de H 2 O </li><li> pH à 7, H 2 O à 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Mélange d&#39;hybridation (20 pi; modifié à partir 11) <ul><li> 10 ul de formamide </li><li> 4 ul de 50% de sulfate de dextrane </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 ul de H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g de sérumalbumine bovine (BSA) </li><li> 10 pi de Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> 8 La solution de blocage (10 ml) <ul><li> 0,3 g de BSA </li><li> 10 pi de Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml de H 2 O </li></ul> Solution de fixation au paraformaldéhyde (1 ml) <ul><li> 393,75 pi H 2 O (ajouter de l&#39;eau en premier) </li><li> 450 ul d&#39;acide acétique glacial </li><li> 156,25 ul 16% de paraformaldehyde </li></ul>

<ol><li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
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<li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts financier ou autre.

ADN ISH est fréquemment utilisé pour cartographier des séquences spécifiques à chromosomes. Nous avons décrit une méthode simple pour l&#39;ADN ISH optimisé pour nombre élevé de copies, séquences hétérochromatiques. Plutôt que d&#39;utiliser des lavages dans une solution de formamide, ce qui est une exigence dans d&#39;autres protocoles ADN ISH existants, on place les lames de tissus montés directement sur un bloc de pré-chauffé pour dénaturer l&#39;ADN. Ce procédé évite l&#39;utilisation de grandes quantités de formami...

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Sondes aux régions à copie unique dans euchromatine peuvent être générés par une poignée d&#39;approches, y compris translation de coupure ou la fin-étiquetage des produits de 1,2 ADN longues et l&#39;incorporation de deoxygenin (DIG) nucléotides -attached et leur reconnaissance à travers une grande variété de conjugué anticorps-groupe 1-3. Visualisation des séquences euchromatiques dans peu ou seul numéro de copie nécessite l&#39;utilisation soit simples, grandes sondes ayant une activité spécifique élevée ou un cocktail de plusieurs petites sondes, qui améliorent collectivement signaux. En revanche, les séquences hautement répétitives trouvés dans hétérochromatine, comme ADN satellites, sont des cibles plus faciles pour l&#39;ADN ISH parce qu&#39;ils existent normalement que des dizaines de milliers de répétitions groupées dans les régions chromosomiques simples appelés blocs. Les éléments transposables peuvent également êtretrouvé à grand nombre de copies à distincte loci chromosomiques 2. Dans ces cas, les sondes simples avec faible activité spécifique peuvent effectivement étiqueter séquences hétérochromatiques en raison de leur hybridation à plusieurs sites. Sondes à séquences répétitives peuvent être synthétisés oligonucléotides commercialement aussi courtes (30-50 pb) et chimiquement conjugués avec une des multiples différents groupes fluorescents. Cartographie de séquences répétitives au sein hétérochromatine en utilisant des technologies de séquençage des génomes est difficile en raison de difficultés rencontrées dans les échafaudages de construction dans les blocs de satellites hautement répétitives 4-6,7. Actuellement, ISH se présente comme le moyen le plus efficace de la cartographie de ces séquences au niveau des sous-chromosome. Cette stratégie est importante pour cartographier un grand nombre de séquences répétitives qui sont découverts par des études génomiques et de séquençage du transcriptome en cours. L&#39;efficacité et la facilité de cartographie des séquences répétitives sur les chromosomes de diapositives montées seraient GREatly renforcée par un protocole simplifié pour l&#39;ADN ISH. Par exemple, les protocoles existants pour l&#39;ADN ISH impliquent de multiples lavages de tissus hybrides en solution formamide 2,8, ajoutant ainsi sensiblement au temps requis pour les séquences de cartographie et de produire de grandes quantités de déchets chimiques pour ce réactif coûteux. Nous décrivons ici un procédé ADN ISH révisé qui contourne la nécessité de lavages formamide et utilise le matériel et les réactifs de laboratoire de base. Cette méthode a été initialement conçu pour la cartographie rapide de séquences d&#39;ADN hautement répétitives dans des régions hétérochromatiques neuroblastes larves de Drosophila en utilisant les oligos de synthèse dans le commerce qui sont conjugués avec des colorants fluorescents. Cependant, cette méthode fonctionne également pour mettre en correspondance des séquences répétitives en utilisant de plus grandes sondes synthétisées par d&#39;autres moyens et 9,10 dans de multiples types de tissus et de chromosomes différents. En outre, cette méthode peut être utilisée pour cartographier des séquences euchromatiques en utilisant plus ou Multiple, de courtes sondes dans la séquence euchromatique d&#39;intérêt.

<table><tbody><tr><td>Lames recouvertes de poly-L-lysine (des lames ordinaires peuvent également être utilisées)</td>Pince à épiler ultrafine <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(calibre 5)</td><td>Lames de recouvrement Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Fisher</td><td></td><td></td><td>Sigmacote traitée par immersion pendant 15 secondes, en épongeant et en essuyant toute trace de Sigmacote de sorte que la feuille de couverture soit transparente</td></tr><tr><td>Papier filtre Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr>Papier <td></td><td></td><td></td><td>ciré à la paraffine</td></tr><tr><td>Bloc chauffant avec thermomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td></td><td></td><td></td>sec</tr><tr><td>Lames de</td><td></td><td></td><td></td>rasoir</tr><tr><td>Chambre</td><td></td><td></td> d’humidité <td>vide boîte à pointes de pipette ou Tupperware, doublée d’essuie-tout humidifié ou</td></tr><tr>de <td></td> pots Kimwipes<td>Coplin</td><td></td><td>avec rainures à glissière</td></tr><tr>Feuille <td></td><td></td><td></td><td>d’aluminium</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td></td><td></td><td></td>Pasteur</tr><tr><td>1,5 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td>à microfuge</tr><tr><td>Vernis</td><td></td><td></td> à ongles <td>Micropipette P20 transparente ou colorée</td></tr><tr><td>et embouts</td><td></td><td></td><td></td>en plastique</tr><tr><td>Trombones</td><td></td><td></td><td>20 à 25 trombones métalliques standard reliés pour former un chain</td></tr><tr><td colspan="4">Réactifs</td></tr><tr><td>16 % paraformaldéhyde de qualité EM</td><td>Réactifs</td><td></td><td></td>de microscopie</tr> électronique <tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td><td></td>liquide</tr><tr><td>100 % éthanol, qualité</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> chimique<td colspan="4">Oligos synthétisés commercialement, marqués par fluorescence</td></tr><tr><td>Sonde longue biotinylée</td><td>Invitrogen ; Étapes alternatives 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>p. ex., Nick traduit et biotinylé avec BioNick d’Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche ; Etapes alternatives 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>pour la détection d’une sonde biotinylée longue Tampon d’hybridation</td></tr><tr><td></td><td>Recette au-dessus</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>4x SSCT</td><td>Recette au-dessus</td><td></td> du <td>citrate salin-sodium + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recette au-dessus</td><td></td> du <td>citrate salin-sodium</td></tr><tr><td>Solution bloquante</td><td>Recette au-dessus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recette ci-dessus</td><td></td><td>SSC, albumine sérique bovine, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recette ci-dessus solution</td><td></td><td>saline tamponnée au phosphate + Tween</td></tr><tr>1x <td>solution saline tamponnée au phosphate</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution hypotonique</td><td></td><td></td><td>de citrate de sodium à 0,5 % dans H2O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield milieu de montage avec DAPI</td><td>Vector Laboratoires</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

méthode simple pour l&#39;adn fluorescence<em&gt; in situ</em&gt; hybridation des chromosomes écrasé

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

ADN hybridation in situ (ISH ADN) en est une méthode couramment utilisée pour la cartographie des séquences à des régions spécifiques de chromosomes. Cette approche est particulièrement efficace pour la cartographie des séquences hautement répétitives à des régions hétérochromatiques, où les approches de calcul face à des défis prohibitifs. Ici, nous décrivons un protocole simplifié pour l&#39;ADN ISH qui contourne lavages formamide qui sont des mesures standard dans d&#39;autres protocoles ADN ISH. Notre protocole est optimisé pour l&#39;hybridation avec de courtes sondes d&#39;ADN simple brin qui transportent des colorants fluorescents, qui marquent efficacement des séquences d&#39;ADN répétitives à l&#39;intérieur des régions chromosomiques hétérochromatiques dans un certain nombre de types de tissus de différents insectes. Toutefois, les applications peuvent être étendues à utiliser avec des sondes et la visualisation de séquences d&#39;ADN copie unique (non répétitive) grands. Nous démontrons cette méthode en cartographiant plusieurs différentes séquences répétitives à des chromosomes de Drosophila melanogaster écrasés cellules neurales et Nasoniavitripennis spermatocytes. Nous montrons schémas d&#39;hybridation pour les deux petites sondes, synthétisées dans le commerce et pour une plus grande sonde pour comparaison. Cette procédure utilise des consommables et réactifs de laboratoire simples, et est idéal pour les enquêteurs qui ont peu d&#39;expérience avec l&#39;exécution de l&#39;ADN ISH.

Pour illustrer cette méthode, nous avons hybridé un ensemble de petits oligos synthétisés dans le commerce qui ont été modifiés chimiquement avec des conjugués fluorescents (figure 2) et une sonde plus biotinylé (fait par translation de coupure d&#39;un produit PCR; Figure 2B), les chromosomes de plusieurs tissus différents types (voir le tableau 1). Les séquences cibles incluses répétitions satellites situés dans les régions péricentromériques (hétérochromatine) de chr...

Ici, nous présentons une méthode simple pour effectuer une hybridation in situ de l’ADN en fluorescence (DNA ISH) pour visualiser des séquences hétérochromatiques répétitives sur des chromosomes montés sur lame. La méthode nécessite un minimum de réactifs et elle est polyvalente pour une utilisation avec des sondes courtes ou longues, différents tissus et la détection avec des signaux basés sur la fluorescence ou non.

Méthode simple pour l&#39;ADN fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation des chromosomes écrasé

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser l'hybridation in situ d'ADN pour cartographier des séquences hétérochromatiques sur des chromosomes mitotiques. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les cerveaux de larves de drosophile de troisième stade larvaire, ou d'un autre tissu d'intérêt. La deuxième étape consiste à fixer le tissu sur un lamelle.Ensuite, le tissu est écrasé entre la lamelle et une lame. Pour préparer les chromosomes en vue de l'hybridation, la dernière étape consiste à hybridater des sondes oligonucléotidiques courtes synthétisées au tissu écrasé. Enfin, une microscopie en fluorescence est utilisée pour révéler la localisation des séquences complémentaires des sondes oligonucléotidiques sur les chromosomes.Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes réside dans sa simplicité. La plupart des autres méthodes d'hybridation chromosomique et C deux impliquent des lavages avec de grandes quantités de formamide, ce qui peut être coûteux et fastidieux. Notre méthode ne nécessite aucun lavage au formamide, ce qui en fait une technique moins coûteuse, plus propre et plus rapide.Bien que cette méthode offre un moyen simple de cartographier visuellement des séquences sur les chromosomes somatiques de cerveaux de drosophile, elle peut également être utilisée pour cartographier des séquences sur d'autres types de chromosomes provenant de tissus différents chez divers organismes. Pour chaque lame à préparer, prélevez quatre ou cinq tissus, mais pas davantage pour les dissections de cerveau. Commencez par sélectionner des larves de troisième stade en phase de vagabondage et réunissez-les dans une goutte de 1 XPBS.Choisissez des flacons de collecte qui ne sont pas surpeuplés. Sous le microscope de dissection, utilisez des pinces très fines pour saisir les crochets buccaux et une autre paire pour tenir les deux tiers de la longueur du corps. Ensuite, tirez doucement sur les crochets buccaux afin d'exposer le cerveau, les ganglions ventraux, les glandes salivaires et certaines parties du tube digestif.Ensuite, prélevez le cerveau et les ganglions ventraux à l'aide de pinces et séparez-les des autres tissus, puis transférez-les dans une goutte de XPBT sur une plaque en plastique. Pour les dissections des testicules de nasia, collectez des mâles de trois jours puy. Les puy mâles âgés de trois jours ont un corps jaune et des yeux rouges.Ceux qui ont de plus petites ébauches d'ailes sont des mâles. Saisir la nymphe par le haut de l'abdomen, près de la région thoracique, avec une première paire de pinces, et, à l'aide d'une seconde paire de pinces, attraper l'extrémité la plus distale de l'abdomen, puis extraire les testicules de forme ovale.Ils sont entourés par des corps gras qui peuvent être doucement secoués pour les détacher ; retirez toutes les parties externes du corps des testicules, ce qui empêchera un écrasement adéquat, puis transférez les testicules dans une goutte de XPBT 1 % sur une plaque propre. Une fois tous les tissus collectés, traitez-les avec une solution hypotonique afin d'améliorer la séparation des chromatides sœurs. Dans les régions e chromatiniques, transférez les tissus dans une goutte de citrate de sodium à 0,5 % pendant 10 minutes.Pour obtenir cet effet, la colchicine n'est pas recommandée car elle peut provoquer des artefacts dans la morphologie des chromosomes. Fixez maintenant les tissus à l'aide de pinces ultrafines. Transférez-les dans une goutte de 20 microlitres de PFA 2,5 % fraîchement préparé dans de l'acide acétique à 45 %, déposée sur une lame couvre-objet propre traitée avec du revêtement sigma ; répartissez uniformément les tissus dans le fixateur et incubez pendant quatre minutes à température ambiante, puis procédez au platelage des lames couvre-objets en plaçant délicatement une lame recouverte de polylysine, face vers le bas, sur les tissus et la lame couvre-objet.Laisser le couvre-lame adhérer à la face inférieure de la lame sans appuyer. Le traitement des couvre-lames avec du sigma coat permet de s'assurer que le tissu écrasé reste sur la lame après le retrait du couvre-lame. Toutefois, rarement, le tissu pourrait rester attaché au couvre-lame.Au cours de cette étape, nous recommandons d'effectuer plusieurs écrasements de tissus en parallèle. Retournez maintenant la lame et placez-la dans une feuille de papier épais pliée. Ensuite, sur une surface stable, appuyez fermement avec le pouce directement vers le bas sur la lamelle.Ne pas appuyer de manière à faire glisser la lamelle, car cela étalerait le tissu. Un pressage très ferme donne généralement des chromosomes bien individualisés dans le tissu écrasé. Toutefois, il peut arriver que la qualité des chromosomes soit variable, avec des chromosomes incomplets, écrasés ou fragmentés.Par conséquent, nous recommandons à nouveau de réaliser deux ou trois écrasements tissulaires en réplique. Transférez l'assemblage sur un bloc de glace pendant quelques minutes, puis immergez-le dans de l'azote liquide jusqu'à ce que l'azote cesse de bouillir, ou plus longtemps. Après avoir retiré la lame juste avant que le tissu ne commence à dégeler, utilisez une lame de rasoir neuve pour soulever un coin de la lamelle. Cela permet de l'ôter.Veillez à ne pas rayer le tissu. Ensuite, placez rapidement la lame dans un bocal Coplin rempli d'éthanol à 100 % et laissez-la tremper pendant au moins cinq minutes. Retirez la lame, absorbez l'excès d'éthanol sans toucher le tissu et laissez sécher la lame à l'air pendant une heure.Les lames peuvent ensuite être conservées pendant des semaines à des mois dans une chambre de dessiccation. Commencez par ajouter 100 nanogrammes de chaque sonde à 20 microlitres de tampon d'hybridation 1,1 x pour obtenir une solution de 22 microlitres de tampon d'hybridation 1 x. Ensuite, pipetez une goutte du mélange sur le tissu fixé, en laissant le tissu intact, puis appliquez délicatement une lamelle. Une petite bulle d'air n'entrant pas en contact avec le tissu ne posera pas de problème, mais la présence de bulles supplémentaires nécessite de replacer la lamelle. Placez la lame sur la face plane d'un bloc chauffant à 95 degrés Celsius et recouvrez-la de papier aluminium. Attendez cinq minutes, durant lesquelles vous pouvez préparer la chambre d'humidité en ajoutant des serviettes en papier humides dans une boîte à pointes.Ensuite, retirez la lame. Enveloppez soigneusement la lame dans du parafilm étiré et transférez-la dans une chambre humidifiée composée d'une serviette humide. Dans une boîte pour pointes, incubez la lame dans la chambre pendant quatre heures à toute la nuit à 30 degrés Celsius. Cette température convient bien pour les sondes à faible teneur en GC, mais pour les sondes à teneur plus élevée en GC, des ajustements peuvent être nécessaires concernant les températures d'hybridation.Après l'incubation, retirez soigneusement le film parafilm et soulevez lentement la lame couvre-objet par un coin. Lavez ensuite la lame trois fois dans du tampon 0,1 XSSC pendant 15 minutes par lavage. Couvrez le bocal avec du papier d'aluminium pendant les lavages afin de minimiser l'exposition à la lumière.Pour les sondes biotinylées longues, ajoutez de l'avidine à domaine en tige et rincez avant de poursuivre. Tout d'abord, séchez la zone autour du tissu et recouvrez le tissu de 100 microlitres de solution de blocage. Ensuite, appliquez délicatement une nouvelle lame couvre-objet sans piéger de bulles.Ensuite, enveloppez à nouveau la lame avec du paraffine. Incubez ensuite la lame à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Deuxièmement, après l'incubation, retirez le couvre-objet et essuyez délicatement autour du tissu avec un essuie-tout.Ensuite, appliquez sur le tissu 100 microlitres d’un diluté de un à 1000 d’avadon ruminal dans du SBT. Procédez ensuite en recouvrant, enveloppant et incubant la lame comme effectué pour le bloc. Enfin, retirez soigneusement la lamelle et rincez la lame.Effectuez trois lavages dans du quatre x SSC T, suivis de trois lavages dans du 0,1 x SSC. Chaque étape de lavage doit durer au moins cinq minutes. Poursuivez le protocole en séchant les lames en éliminant le tampon excédentaire par absorption, sans toucher le tissu.Ensuite, placer la lame, côté tissu vers le haut, dans un endroit sombre pendant 10 à 15 minutes ou jusqu'à ce que l'humidité ait complètement disparu. Monter maintenant la lame en utilisant 11 microlitres de vector shield avec DPI et poser délicatement une lame à couvre-objet non revêtue sigma coat. Si le milieu n'atteint pas toutes les extrémités, ajouter quelques microlitres supplémentaires de milieu depuis le bord et essuyer tout excès.Ensuite, sceller la lame avec du vernis à ongles et conserver la préparation verticalement dans un endroit sombre pendant que le vernis sèche, ce qui prend généralement au moins une demi-heure. Puis conserver la lame à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine au maximum et imager le tissu dès que possible. Un ensemble d'oligonucléotides courts synthétisés commercialement, portant des conjugués fluorescents, ainsi qu'une sonde plus longue biotinylée réalisée par traduction de brèche, ont tous été hybridés à des chromosomes provenant de plusieurs types de tissus différents.En utilisant la méthodologie décrite, la sonde ciblant la répétition satellite de 359 paires de bases de Drosophila Melanogaster a révélé un grand bloc multi mégabase sur le chromosome X et une région beaucoup plus petite sur le chromosome trois. Une sonde plus longue dirigée contre le satellite « responder » a détecté des blocs répétitifs composés d'un nombre relativement faible de copies répétées, d'environ 700. Ainsi, cette méthode permet la visualisation de très petits blocs satellites.Lorsque la durée de l'étape de traitement par la solution hypotonique a été doublée, passant à 10 minutes, la séparation des chromatides sœurs a augmenté nettement. Cette procédure peut être associée à d'autres méthodes, telles que la coloration par anticorps, afin de répondre à des questions telles que : certaines protéines de la chromatine se localisent-elles sur des séquences spécifiques ?

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