Méthode simple pour l'ADN fluorescence In Situ Hybridation des chromosomes écrasé

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser l’hybridation in situ de l’ADN pour cartographier des séquences hétérochromatiques sur des chromosomes mitotiques. Ceci est accompli en disséquant d’abord le cerveau du troisième chez les larves de drosophile étoilée, ou un autre tissu d’intérêt. La deuxième étape consiste à fixer le tissu sur une lamelle.

Ensuite, le tissu est écrasé entre la lamelle et une glissière. Pour préparer les chromosomes à l’hybridation, l’étape finale consiste à hybrider de courtes sondes oligoscopiques synthétisées sur le tissu écrasé. Enfin, la microscopie à fluorescence est utilisée pour montrer la localisation de séquences complémentaires aux sondes oligo sur les chromosomes.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes est sa simplicité. La plupart des autres méthodes d’hybridation des chromosomes et C deux impliquent des lavages avec de grandes quantités d’amide de forme, ce qui peut être coûteux et salissant. Notre méthode ne nécessite aucun lavage IDE, ce qui en fait une technique moins chère, plus propre et plus rapide.

Bien que cette méthode offre un moyen simple de cartographier visiblement des séquences sur les chromosomes somatiques des cerveaux de drosophile, elle peut également être utilisée pour cartographier des séquences sur d’autres types de chromosomes à partir de différents tissus dans les différents organismes. Pour chaque lame à réaliser, préparez quatre ou cinq tissus, mais pas plus pour les dissections cérébrales. Commencez par sélectionner des larves errantes du troisième stade et collectez-les en un seul XPBS.

Choisissez des flacons à collecter qui ne sont pas surchargés. Sous la lunette de dissection, utilisez une pince à épiler ultra fine pour saisir les crochets buccaux et une autre paire pour saisir les deux tiers sur toute la longueur du corps. Ensuite, tirez doucement sur les crochets buccaux pour exposer le cerveau, les ganglions ventraux, les glandes salivaires et certaines parties du tube digestif.

Ensuite, épilez le cerveau et les ganglions ventraux des autres tissus et transférez-les dans une gouttelette d’un XPBT sur une plaque en plastique. Pour les dissections testiculaires nasia, recueillir le puy mâle de trois jours. Les puy de trois jours ont le corps jaune et les yeux rouges.

Ceux qui ont des coussinets alaires plus petits sont des mâles. Saisissez la chrysalide en haut de l’abdomen, près de la région thoracique, à l’aide d’une pince à épiler et d’une deuxième paire de pinces à épiler. Saisissez l’extrémité très distale de l’abdomen, puis retirez les testicules en forme de larme.

Ils sont entourés de corps adipeux qui peuvent être doucement secoués, détacher toutes les parties extérieures du corps des testicules, ce qui empêchera un bon écrasement et transférera les testicules en une goutte d’un XPBT sur une plaque propre. Une fois que tous les tissus sont collectés, traitez-les avec une solution hypotonique pour améliorer la séparation des chromatides sœurs. Dans les régions chromatiques, transférez les tissus dans une goutte de citrate de sodium à 0,5 % pendant 10 minutes.

Pour obtenir cet effet, la colchicine n’est pas recommandée car elle peut provoquer des artefacts dans la morphologie des chromosomes. Maintenant, fixez les mouchoirs à l’aide d’une pince à épiler ultra fine. Transférez-les dans une goutte de 20 microlitres de PFA à 2,5 % PFA fraîchement préparé dans de l’acide acétique à 45 % sur une lamelle propre traitée sigma, espacez les mouchoirs uniformément dans le fixateur et incuberez-les pendant quatre minutes à température ambiante, puis procédez à l’écrasement des lamelles de couverture, commencez par placer légèrement une lame enduite de polylysine face vers le bas sur le mouchoir et la lamelle.

Laissez le couvercle coller sur le dessous de la glissière sans appuyer. Traiter. Les lamelles de recouvrement avec couche sigma permettent de s’assurer que le tissu de la courge reste sur la glissière après le retrait de la lamelle. Cependant, il est rare que le tissu reste attaché à la lamelle.

Au cours de cette étape, nous vous recommandons d’effectuer des courges tissulaires répétées. Maintenant, retournez la diapositive et placez-la dans un morceau de papier épais plié. Ensuite, sur une surface stable, à l’aide du pouce, appuyez très fermement vers le bas sur le couvercle.

N’appuyez pas de manière à faire glisser le couvercle ou à tacher le tissu. Une pression très ferme entraîne normalement une bonne résolution des chromosomes dans le tissu de la courge. Cependant, à l’occasion, vous pouvez rencontrer une variabilité de la qualité des chromosomes, comme des chromosomes incomplets, écrasés ou fragmentés.

Encore une fois, nous vous recommandons d’effectuer deux ou trois réplications de courges tissulaires. Transférez l’ensemble sur un bloc de glace pendant quelques minutes, puis immergez-le dans de l’azote liquide jusqu’à ce que l’azote cesse de bouillir ou plus longtemps Après avoir retiré la lame immédiatement avant que le tissu ne décongèle, utilisez une lame de rasoir fraîche pour remonter un coin de la lamelle. L’enlevant ainsi.

Veillez à ne pas gratter le tissu. Ensuite, placez rapidement la diapositive dans un bocal coplin rempli à 100 % d’éthanol et laissez tremper pendant au moins cinq minutes. Retirez la mèche de la diapositive pour éliminer l’excès d’éthanol sans toucher le mouchoir et laissez la lame sécher à l’air libre pendant une heure.

Les lames peuvent ensuite être stockées pendant des semaines ou des mois dans une chambre de dessiccation. Commencez par ajouter 100 nanogrammes de chaque sonde à 20 microlitres de tampon d’hybridation 1,1 x pour une solution de 22 microlitres d’un tampon d’hybridation. Ensuite, pipetez le mélange sur le tissu fixé, en laissant le tissu intact et appliquez doucement un lamelle.

Une petite bulle d’air qui n’entre pas en contact avec le tissu ne posera pas de problèmes, mais plus de bulles justifient la réapplication de la lamelle. Placez la diapositive sur le côté plat d’un bloc de chaleur à 95 degrés Celsius et couvrez-la de papier d’aluminium. Attendez cinq minutes pendant lesquelles vous pouvez préparer la chambre d’humidité en ajoutant des serviettes en papier humides dans une boîte à pourboires.

Retirez ensuite la diapositive. Enveloppez soigneusement la lame dans une paraforme étirée et transférez-la dans une chambre humidifiée composée d’une serviette humide Dans une boîte à pointes, incubez la lame dans la chambre pendant quatre heures jusqu’à toute la nuit à 30 degrés Celsius. Cette température fonctionne bien pour les sondes à faible teneur en GC, mais pour les sondes à teneur en GC plus élevée, un dépannage avec des températures d’hybridation peut être nécessaire.

Après l’incubation, retirez délicatement le film para et soulevez lentement la lamelle d’un coin. Ensuite, lavez la diapositive trois fois dans un tampon XSSC 0,1 pendant 15 minutes par lavage. Couvrez le pot d’une feuille d’aluminium pendant les lavages pour minimiser l’exposition à la lumière.

Pour les sondes longuement biotinylées, ajoutez la tige domine avadon et lavez avant de continuer. Tout d’abord, séchez la zone autour du tissu et recouvrez le tissu de 100 microlitres de solution de blocage. Ensuite, appliquez délicatement une nouvelle lamelle sans coincer les bulles.

Encore une fois, enveloppez la diapositive avec param. Ensuite, incubez la lame à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Deuxièmement, après l’incubation, retirez la lamelle et épongez autour du tissu avec une lingette.

Ensuite, sur le tissu, appliquez 100 microlitres d’un à 1000 rumine avadon dilué dans du SBT. Poursuivez en couvrant, enveloppant et incubant la lame comme fait avec le bloc. Enfin, retirez délicatement la lamelle et lavez la lame.

Utilisez trois lavages dans quatre x SSC T, suivis de trois lavages dans 0,1 XSSC. Chaque étape de lavage doit durer au moins cinq minutes. En procédant au protocole, séchez les lames en épongeant l’excès de tampon sans toucher le tissu.

Placez ensuite le tissu de la lame côté vers le haut dans un endroit sombre pendant 10 à 15 minutes ou jusqu’à ce que l’humidité se dissipe complètement. Maintenant, montez la diapositive à l’aide de 11 microlitres de bouclier vectoriel avec DPI et abaissez-la soigneusement sur une glissière de recouvrement de manteau non sigma. Si le média n’atteint pas tous les bords, appliquez quelques microlitres de média supplémentaires sur le bord et essuyez tout excès.

Scellez ensuite la lamelle avec du vernis à ongles et rangez la lame à la verticale dans un endroit sombre pendant que le vernis à ongles sèche, ce qui prend généralement au moins une demi-heure. Conservez ensuite la lame à moins 20 degrés Celsius pendant une semaine et imagez le tissu dès que possible. Un ensemble de petits oligos synthétisés commercialement avec des conjugués fluorescents et une sonde biotinylée plus longue fabriquée par Nick Translation ont tous été hybridés en chromosomes à partir de plusieurs types de tissus différents.

En utilisant la méthodologie décrite, la sonde de la répétition satellite de la paire de bases Drosophila Melanogaster 359 a reconnu un grand bloc de paires de plusieurs mégabases sur le x et une région beaucoup plus petite sur le chromosome trois. Une sonde plus longue contre le satellite répondeur a détecté des blocs de répétition composés d’un nombre relativement faible de copies répétées d’environ 700. Ainsi, cette méthode permet de visualiser de très petits blocs satellites.

Lorsque la durée de l’étape de traitement en solution hypotonique a été doublée à 10 minutes, la séparation des chromatides sœurs a augmenté vers l’est. Cette procédure peut être couplée à d’autres méthodes telles que la coloration des anticorps afin de répondre à des questions telles que certaines protéines de la chromatine localisées à des séquences spécifiques.