Name: Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez le profilage des polysomes pour identifier les ARNm sélectivement traduits sous stress dans les cellules de mammifères. Cette méthode permet d'étudier la régulation de la traduction et l'adaptation cellulaire.

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Nous sommes reconnaissants envers les membres passés et présents du laboratoire, en particulier Urszula Liwak, pour la discussion critique concernant les protocoles de profilage des polysomes et le partage des données. Ces travaux ont été financés par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada, de la Société de recherche sur le cancer et du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada. MDF a été soutenu par la bourse d’études supérieures du Canada Vanier au doctorat et la bourse d’études supérieures de l’Ontario, et ce travail fait partie de sa thèse de doctorat.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Profilage polysomique est une technique puissante qui permet la quantification de l&#39;état de la traduction des transcrits spécifiques dans différentes conditions de traitement. Il est une technique très simple dans son principe mais il nécessite plusieurs étapes d&#39;exécution, dont certains sont essentiels pour produire de bons profils de polysomes. Ces étapes clés sont les suivants: 1) utilisation de produits chimiques sans RNase et en plastique, 2) la préparation de bons gradients de saccharose (dans mon expérience, un 10-50% des gradients de saccharose qui fonctionnent le mieux pour résoudre efficacement 40 / 60S sous-unités et ARNm aux ribosomes liés), et 3 ) en utilisant des cellules qui sont en croissance exponentielle et pas plus de 80% de confluence afin de capturer les taux de conversion les plus élevés. Cette dernière étape doit être pris en considération lors de faire des traitements de cellules longs, tels que effet de choc ou de surexpression de gène, de sorte que la quantité de cellules à plaque sera une fonction de la quantité de cellules confluentes sont en fin d&#39;étude. Dans les résultats présenTed ici, polysome analyse de profil était un outil important pour évaluer rôle PDCD4 dans la régulation de la traduction de l&#39;IRES hébergeant les ARNm de XIAP et Bcl-xL 12. Le fait que nous ne voyons aucun changement dans les profils généraux de polysome sur PDCD4 knock-down (figure 1B) nous a permis de conclure que PDCD4 n&#39;a pas altéré la traduction cellulaire global dans les conditions de l&#39;expérience. Nous avons ensuite utilisé l&#39;analyse par RT-PCR quantitative pour déterminer la distribution de la protéine XIAP et Bcl-xL ARNm dans les cellules traitées avec les siRNA PDCD4 ou de contrôle. qPCR est une méthode de choix pour l&#39;analyse des profils de polysomes, par opposition à la norme RT-PCR ou transfert de Northern, car elle permet une plus quantitative que l&#39;analyse semi-quantitative de la distribution de l&#39;ARNm et pour la détection de changements subtils dans l&#39;efficacité de translation entre les traitements. Grâce à cette technique, nous avons pu montrer que la distribution des XIAP et Bcl-XL ARNm (exprimé en pour cent de l&#39;ARNm cible totale à travers le gradient) est significativement décalée dans polyribosomes lourds (ARNm avec un grand nombre de ribosomes qui leur sont associés) après PDCD4 knock-down (figure 1D, E), ce qui indique une augmentation de la traduction de ces ARNm. Cela a été confirmé en outre par une augmentation des niveaux de protéine XIAP et Bcl-xL, mais pas dans les niveaux d&#39;ARN à l&#39;état stationnaire (figure 1F, G). Fait important, la distribution de polysomes de la variante non-IRES de XIAP est restée inchangée entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En variante, l&#39;efficacité de translation peut être présenté comme un rapport de la teneur en ARNm de polysomes (habituellement des fractions 5 à 10) par rapport à monosomes (habituellement des fractions 2 à 4) 14. L&#39;utilisation de contrôles tout au long du protocole est important dans la validation de toute polysome profilage résultat, comme des pics observés à partir de lectures d&#39;absorbance à 254 nm ne peuvent pas eux-mêmes être attribuées à l&#39;ARN ribosomal (détergents, tels que le Triton X-100 absorbent fortement dans cette région du spectre et peut obscurcir 40 / 60S sommets au sommet du gradient). Gradients vierges sans lysat et / ou avec un tampon de lysat doivent être exécutés pour déterminer la contribution relative des tampons à l&#39;absorbance à 254 nm. Artefactual structures d&#39;ordre supérieur peuvent également conduire à des interprétations erronées de polysomes où il n&#39;y a en fait aucun (par exemple «pseudo-polysomes&quot; 20). Séquestrant magnésium (utilisé tout au long de la procédure de stabiliser les ribosomes 80S) avec l&#39;EDTA cation divalent chélateur ajoutée à lysats et à la mémoire tampon de gradient (20 mM pendant 15 min) provoque une séparation du ribosome en ses composantes de petite taille (40S) et de grande taille (60S des sous-unités). Ainsi, si les pics d&#39;absorbance enregistrées à 260 nm sont en effet polysomes, le traitement de l&#39;EDTA sera replier le profilé de telle sorte qu&#39;un seul maximum est observé à proximité de la partie supérieure du gradient correspondant à libérer l&#39;ARNm et des unités ribosomiques (données non présentées). Coïncidentavec l&#39;effondrement induit EDTA-du profil, tous les objectifs spécifiques analysés par qPCR devrait maintenant être trouvé au sommet de la pente. Le nombre de ribosomes associés à un ARNm est pas toujours un indicateur de l&#39;efficacité avec notamment l&#39;ARNm qui est en cours de traduction. En effet, il existe des contextes spécifiques dans lesquels traduction active sur polysomes devient au point mort 21,22 laquelle le lecteur doit être conscient de. Déterminer si oui ou non les transcriptions sont activement engagés avec la machinerie de traduction qui peut être fait par un) traitement de l&#39;échantillon avec la puromycine, qui, contrairement à l&#39;EDTA, provoque «run-off» des ribosomes qui sont activement translocation à travers un ARNm, ou b) le traitement de l&#39;échantillon avec homoharringtonine qui inhibe la translocation de seulement la première ribosome au niveau du codon de démarrage, provoquant de nouveau &quot;run-off&quot; de toutes les ribosomes de translocation en aval. L&#39;utilisation de transcriptions de contrôle pour l&#39;analyse qPCR est également critique. La Selection des transcriptions qui ne sont pas affectés par des conditions de traitement telles que certains gènes de ménage (GAPDH, actine, tubuline, la nucléoline), ARNm ribosomique (18S, Rpl13a) ou dans ce cas, la variante non-IRES du IRES de XIAP, est important dans vérifier si l&#39;effet du traitement sur la traduction est spécifique ou généralisée. Ces transcrits de commande peuvent être utilisés pour normaliser la distribution des ARNm analysés comme cela a été fait ici (XIAP et Bcl-xL ARNm ont été normalisées par rapport à l&#39;ARNm GAPDH et exprimé en pourcentage de la teneur en ARNm total représenté par la somme de la teneur en ARNm de chaque fraction ) ou encore, cibles et de contrôle ARNm peuvent être exprimées en valeurs absolues et présentés séparément. analyse qPCR des lysats d&#39;entrée (généralement de 10% du volume total) est une autre étape qui permettra de contrôler la distribution des ARNm spécifiques. Idéalement, la teneur en ARNm de transcription spécifique dans le lysat d&#39;entrée doit être comparable à la somme de la teneur en ARNm de l&#39;ensemble des 10 fractions analysées. Enfin, Une étape facultative pour contrôler pour le phénol: étape d&#39;extraction de chloroforme est à pic chaque fraction de polysome avec un transcrit in vitro ARNm rapporteur (comme CAT, le chloramphénicol acétyl-transférase) qui seront ensuite quantifié par qPCR et peut même être utilisé pour normaliser la données 14. Comme toute technique, le profilage polysome présente certaines limites. Le fait que généralement un minimum de 10 fractions (changements plus subtils dans l&#39;efficacité de traduction peut nécessiter 20 ou plus) doivent être collectées dans le but d&#39;avoir de belles distributions de polysome rend cette étape limitante, en ce sens que seul un maximum de 4 échantillons peut être analyse à la fois pour pouvoir manipuler aisément l&#39;extraction d&#39;ARN et l&#39;analyse par qPCR de 40 échantillons et les contrôles d&#39;entrée 4 à la fois. La taille de l&#39;échantillon peut facilement ajouter avec combien de transcriptions doivent être analysées et combien de qPCR réplique à faire, et cela peut être coûteux. Une autre limitation d&#39;un polysomal base-qPCR profilage unenalyse est qu&#39;il ne peut être fait sur une approche fondée sur les candidat (où les transcriptions pour analyser sont connus à l&#39;avance) et ne peuvent pas être appliquées pour l&#39;analyse du génome entier de traduction. Cependant, au début du 21 e siècle, les enquêteurs ont commencé à interroger leur ARN polysomal à un niveau génomique en utilisant puces à ADN 15 et, plus récemment, avec le séquençage de prochaine génération 16,17. Dans cette approche puissante, profilage polysomal est effectuée comme décrit dans ce protocole, sauf que plutôt que d&#39;effectuer des analyses qPCR de fractions individuelles, monosomes fractions (généralement fraction 2-4) et polysomes fractions (en général) des fractions sont regroupées et les variations dans la traduction globale analysés par puces à ADN ou du génome entier séquençage de l&#39;ARN. Ainsi avec cette approche, il est possible d&#39;évaluer l&#39;ensemble des ARNm dont la distribution des changements de polysomes à monosomes (diminution de traduction) ou vice-versa (augmentation de la traduction) à un traitement spécifiquement. Validation et quantification de la distribution des polysomes d&#39;ARNm spécifique peuvent être effectuées par qPCR. Une utilisation encore plus puissant du principe polysomal de profilage est profilage ribosome. Une nouvelle extension haut débit de cette technique a été signalé récemment que permet la surveillance simultanée de centaines de polysomes 23 fractions. Cela donne un avantage certain lorsque sondage efficacité traductionnelles des collections de mutants ou dans un des écrans ARNi à grande échelle. Profilage ribosome est une technique qui tire parti de séquençage de prochaine génération à la carte des fragments d&#39;ARN protégés par les ribosomes (empreintes des ribosomes) engagés dans la synthèse des protéines 24,25. Dans cette technique, la translocation des ribosomes peut être inhibée par le cycloheximide (réversible) ou émétine (irréversible), suivie par la lyse des cellules et la RNase digestion pour obtenir une population d&#39;empreintes ribosome. Les ribosomes sont enrichis, l&#39;ARN total est isolé, et de contaminer ribosomal et ARN ribosomique mitochondrial est retiré.empreintes d&#39;ARN de 26-28 nucléotides environ sont isolés, transcription inverse, transformée en une banque d&#39;ADNc et séquençage 26. Contrairement au profilage de polysome standard, cette approche identifie non seulement les ARNm spécifiques qui sont réglementés en translation mais donne également des informations ARNm spécifique à la résolution de codon comme la profession exacte et la densité des ribosomes le long d&#39;une transcription spécifique. Ceci est particulièrement intéressant pour les ARNm de certains modes de traduction tels que les ARNm IRES-hébergeant, car elle pourrait donner plus d&#39;informations sur où sur le ribosome-recrutement de transcription qui se passe.

Régulation de la synthèse protéique (traduction) est un processus cellulaire clé qui est intimement liée à la survie cellulaire. Étant donné que la traduction consomme plus de 50% de l&#39;énergie de la cellule, il est peu surprenant que la traduction est strictement réglementée et que les perturbations dans la traduction ne sont pas bien toléré. En revanche, de nombreux processus cellulaires aberrantes exiger que la machinerie de traduction et de sortie de traduction (par exemple du protéome) doivent être modifiés. Cela est souvent le cas dans divers états d&#39;intervention et de stress, les maladies et est probablement le meilleur exemple dans le cancer. Un avantage clé de contrôle de la traduction est la capacité des cellules à reprogrammer rapidement la production de la protéine en réponse à différents déclencheurs externes et internes, le mécanisme de réglage fin ainsi que pencher la balance entre la survie et la mort cellulaire 1. Deux aspects de contrôle de la traduction sont particulièrement intéressants; la compréhension de la nature de la régulation mechanism (s) et de contrôle des éléments qui permettent de traduction spécifique, et l&#39;identification des ARNm spécifiques et de leurs produits de protéines qui participent à la réponse cellulaire à la gâchette particulier qui a suscité traduction sélective en premier lieu. Polysomes profilage est une technique qui permet d&#39;étudier efficace des deux processus. L&#39;objectif global de la technique polysome de profilage est d&#39;étudier et de quantifier l&#39;état de la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires. Le principe de la technique est de capturer traduction de l&#39;ARNm par &#39;&#39; geler &#39;&#39; ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d&#39;établir une distinction entre les transcriptions très traduits (liée par plusieurs ribosomes) et les mal traduit (lié par un ou deux ribosomes). Dans ce protocole particulier, le cycloheximide antibiotique qui se lie à la60S de la sous-unité ribosomique et bloque la libération de déacétylé ARNt du site E ribosome 2, est utilisée pour inhiber la translocation du ribosome et caler ribosomes sur les ARNm de traduction. Cependant, d&#39;autres agents de blocage, tels que l&#39;émétine cette traduction aussi des blocs allongement 3, peut être utilisé. Contrairement à la Western blot et 35 S-méthionine techniques de marquage qui mesurent le résultat final du processus de traduction, polysome profilage a l&#39;avantage de mesurer les ribosomes association avec des ARNm activement traduits, ce qui permet une étude plus détaillée des mécanismes de traduction dans différentes conditions. Par conséquent, la technique peut être facilement adapté pour étudier spécifiquement les différents modes de traduction 4-6, facteurs de protéines impliquées dans la régulation de la traduction 7-9, les conditions de stress affectant la synthèse des protéines 1,10,11 ou les effets des structures d&#39;ARNm tels que IRES ou en amont cadres de lecture ouverts sur la protéine synthéSIAE 12-14. Aujourd&#39;hui, polysome Profilage des applications sont encore plus large avec l&#39;utilisation de puces à ADN 15 ou séquençage de nouvelle génération 16,17 à analyser polysomes associés ARNm.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 machine à gradient automatisée</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow machine à gradient à deux chambres</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modèle # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Fractionneur de gradient de densité</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composé de : système de perçage de tube, pompe péristaltique, détecteur UA-6 avec filtres de 254 et 280 nm et Foxy R1 Fraction</td></tr><tr><td>Collector Logiciel d’acquisition de données WinDaq DATAQ</td><td>INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmTubes à centrifuger ultra-centrifugeux Pollyallomer (pour SW41, 14 x 89 mm)</td>Tubes à centrifuger <td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>sans nucléases de 2 ml (nez de dauphin)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 2 ml sans nucléases (à fond plat)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (sans nucléases)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. Remettre en suspension dans le DMSO et maintenir à -80 °C pour un isolement à long terme. Attention : TOXIQUE ! Peut provoquer des voies respiratoires et une irritation de la peau. Portez un masque lors de la pesée.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (sans nucléases)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (sans nucléases)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (sans nucléases)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Attention : TOXIQUE ! Peut provoquer des voies respiratoires reproductrices et une irritation cutanée</td></tr><tr><td>RNasin recombinante Inhibiteur de la ribonucléase</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase solution d’inactivation</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acide-phénol :Chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Attention : TOXIQUE ! Peut provoquer une irritation des voies respiratoires ainsi qu’une irritation et une corrosion de la peau</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la sélective arnm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Régulation de la synthèse des protéines représente un point de contrôle clé dans la réponse cellulaire au stress. En particulier, des éléments de régulation de l&#39;ARN discret ont été montrés pour permettre à la traduction sélective des ARNm spécifiques, qui codent pour des protéines généralement nécessaires pour une réaction de stress particulier. L&#39;identification de ces ARNm, ainsi que la caractérisation des mécanismes de régulation chargées de la traduction sélective a été à la pointe de la biologie moléculaire pour un certain temps. Profilage polysome est une méthode pierre angulaire dans ces études. Le but de polysome profilage est de capturer traduction de l&#39;ARNm en immobilisant ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d&#39;établir une distinction entre les transcriptions très traduits et les mal traduits. Ceux-ci peuvent ensuite être en outre caractérisés par des méthodes de biologie moléculaire et de biochimie classiques. Surtout, p combinantolysome profilage haut débit avec des approches de génomique permet une analyse à grande échelle de régulation de la traduction.

Nous avons récemment décrit un nouveau rôle pour le suppresseur de tumeur PDCD4 comme un inhibiteur sélectif de la traduction des ARNm codant pour des inhibiteurs apoptotiques XIAP et Bcl-xL 12 IRES-hébergement. Profilage polysome était une technique clé pour démontrer l&#39;implication spécifique de PDCD4 dans la traduction IRES-médiation. Les cellules HEK293 ont été transfectées de manière transitoire pour épuiser les niveaux endogènes de PDCD4 (figure 1A) et ensuite soumis à une analyse polysomes profil. Nous avons observé que la réduction des niveaux de PDCD4 ne portent pas atteinte à la traduction cellulaire mondial, à en juger par l&#39;absence de changements dans le profil de polysome lorsque l&#39;on compare siCTRL et siPDCD4 cellules traitées (figure 1B). De même, la distribution de polysomes IRES non-XIAP variant de 19 est resté inchangé entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En revanche, polysome distribution des ARNm deux IRES-hébergeant, XIAP et Bcl-xL, a été modifiée de façon significative. En l&#39;absence de PDCD4 la distribution de ces deux ARNm est décalé dans ribopolysomes lourds (figure 1D, E). Depuis ce ne soit pas accompagnée de changements dans les niveaux de XIAP et Bcl-xL ARNm (figure 1F) ces résultats à l&#39;état stationnaire démontrent une amélioration de la traduction de la protéine XIAP et Bcl-xL dans les cellules avec des niveaux réduits PDCD4, qui a été confirmée par Western blot (Figure 1G). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Polysomes profilage identifie PDCD4 comme inhibiteur sélectif de la traduction XIAP et Bcl-xL (A) des cellules HEK293 ont été traitées avec ou PDCD4 siRNA contrôle (CTRL), le siRNA ciblant non, lysées et soumises à une analyse Western blot avec des anticorps anti-PDCD4 et des anticorps anti-nucléoline de vérifier l&#39;étendue de PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 a été renversé comme dans (A) etLes lysats cellulaires ont été soumis à des polysomes profilage. Profil de polysome représentatif est montré dans le panneau supérieur; la distribution de l&#39;IRES de XIAP non (C), Bcl-xL (D), et d&#39;IRES de XIAP (E) par rapport à celui des ARNm de GAPDH est représenté comme le pour cent de l&#39;ARNm total (% de l&#39;ARNm) dans chaque fraction. (F) Steady les niveaux d&#39;ARNm -state ont été mesurés par RT-PCR quantitative en PDCD4 siRNA ou de contrôle (CTRL) siRNA cellules traitées. (G) Les lysats provenant de (A) ont également été soumis à une analyse Western blot avec des anticorps anti-XIAP, anti-Bcl-xL, et anticorps anti-nucléoline. (NB. Les données présentées dans la figure 1 ont été à l&#39;origine publié en 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de distinguer les ARNm fortement traduits de ceux faiblement traduits par l'immobilisation et la séparation des polyribosomes. Cette distinction est obtenue en ajoutant d'abord du cycloheximide aux cellules afin d'inhiber la translocation des ribosomes et la traduction de l'ARN. Dans un deuxième temps, des lysats provenant des cellules traitées sont déposés sur un gradient de saccharose et soumis à une ultracentrifugation afin de séparer les polyribosomes stockés selon leur masse. Ensuite, le gradient est divisé en fractions égales afin de séparer, lors de l'étape finale, les transcrits fortement traduits de ceux faiblement traduits. La séquence R-T-Q-P-C-R est utilisée pour détecter la présence des ARNm d'intérêt dans chacune des fractions. En définitive, le profilage des ribosomes permet de détecter les modifications de la traduction globale ainsi que de la traduction spécifique des ARNm en réponse à des stress physiologiques et physiopathologiques distincts.Le profilage PolyOne peut répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie moléculaire et cellulaire, telles que lesquels ARNm sont sélectionnés et traduits pendant le stress S, et comment cela permet aux cellules de s'adapter à ces conditions. Pour démontrer cette procédure, mom Dar, étudiante diplômée dans le laboratoire, utilise un gradientateur automatisé afin de préparer un gradient de saccharose. Commencez par allumer le gradientateur et mettez à niveau la plaque qui accueillera les gradients. Une fois la plaque nivelée, cliquez sur « terminé ».Ensuite, pour sélectionner le programme de gradient, ouvrez le menu grad et sélectionnez liste. Cliquez sur SW 41, puis faites défiler la liste jusqu'à ce que le programme de gradient 10 à 50 % en 11 étapes apparaisse à l'écran, puis appuyez sur Utiliser. Placez ensuite un tube conique SW 41 pour ultracentrifugeuse dans le bloc repère et utilisez le marqueur de tube fin fourni pour tracer une ligne sur le tube le long de l'étape supérieure du bloc.Placer les tubes dans un support adapté sur une surface stable, puis fixer les deux canules fournies à deux seringues de 10 millilitres. Aspirer et expulser plusieurs fois de l'eau distillée tiède contenant des ARN dans la solution d'activation afin de rincer les seringues. Ensuite, après avoir éliminé toute trace d'eau, remplir l'une des seringues avec du saccharose à 10 % plus du cycloheide, puis insérer la canule au fond du tube d'ultracentrifugation.Dispensez délicatement la solution jusqu'à ce qu'elle dépasse légèrement la marque effectuée sur le tube, en prenant soin d'éviter les bulles. Ensuite, remplissez l'autre seringue avec du saccharose à 50 % plus du cycloheide, et essuyez tout liquide excédentaire sur le tube à l'aide d'un chiffon.Utilisez la canule pour insérer délicatement la solution de saccharose à 50 % dans le tube, en vous arrêtant lorsque la solution atteint le niveau du repère, puis retirez rapidement et sans à-coups la canule. La solution de saccharose à 10 % doit remonter pour former un ménisque en haut du tube. Ensuite, inclinez légèrement le tube d'ultracentrifugation pour déplacer les éventuelles bulles d'air et insérez le bouchon en utilisant une micropipette pour éliminer tout excès de liquide présent dans la réserve du bouchon.Placer les tubes sur le générateur de gradient, puis appuyer sur le bouton de démarrage. Remarquez que la plaque s'inclinera à l'angle spécifié. Faire une pause de cinq secondes, puis les rotations nécessaires à la formation du gradient commenceront.Après environ deux minutes, la machine émettra un signal sonore indiquant que la formation du gradient est terminée. Transférez délicatement les tubes dans un support et retirez rapidement les bouchons d'un seul mouvement ascendant afin d'éviter de perturber le gradient. Chargez ensuite délicatement une quantité équivalente à 260 unités d' lysat cellulaire préparé auparavant sur chaque gradient de saccharose, puis faites tourner les tubes pendant une heure et demie à 260 343 × g et à 4 degrés Celsius dans une ultracentrifugeuse.Pour configurer l'appareil de fractionnement par gradient, commencez par allumer le spectrophotomètre. Ensuite, cliquez deux fois sur l'icône de dossier, puis deux fois sur la flèche de retour pour revenir à l'écran d'accueil et régler le collecteur de fractions sur la méthode PolyZone, afin de s'assurer que le robinet du collecteur de fractions est positionné sur le rejet. Cliquez sur la flèche pointant vers l'icône de corbeille, puis placez un ballon MIA de 250 millilitres contenant de l'eau distillée sous le tube de collecte des déchets.Choisissez maintenant les paramètres suivants sur l'enregistreur graphique : réglez le bouton de sensibilité pour positionner la lampe et les optiques, activez le filtre de bruit. Passez à 1,5 le bouton de séparation des pics sur arrêt, réglez la vitesse du tracé à 30 centimètres par heure, et mettez le bouton de réglage de la ligne de base, situé en haut de l'unité de spectrophotométrie, au maximum ouvert. Ensuite, insérez la seringue et son corps dans la pompe, puis utilisez les vis et la clé Allen fournies pour le fixer solidement en place.Utilisez la commande rev à vitesse rapide pour remplir la seringue avec la solution de chasse. Ensuite, placez la pompe en position verticale et utilisez la commande forward pour chasser l'air à travers le tube. Puis, installez un tube d'ultracentrifugeuse rempli d'eau libre d'ARNs dans le support, puis percez le tube avec la canule jusqu'à ce que les deux marques noires soient visibles.Le trou de distribution se trouve entre les deux repères. Démarrez la pompe à seringue en mode manuel avant à 6,0 millilitres par minute. Lorsque la solution de relave remplit le tiers du tube, passez à la vitesse variable avec un débit de 1,0 millilitre par minute.Maintenant, tournez le bouton de réglage du zéro sur le spectrophotomètre jusqu'à ce que la tension sur le graphique atteigne zéro. L'eau commence à sortir par le tube de rejet vers le flacon éluant. Ensuite, réglez la sensibilité souhaitée à 1,0 ua.Une fois la sensibilité réglée, appuyez sur le bouton de base également et tournez le bouton de décalage de l'enregistreur pour ajuster le réglage de la ligne de base à la marque de 10 % sur l'enregistreur graphique. Ensuite, une fois la ligne de base stable obtenue, mettez l'interrupteur de la pompe et le bouton de vitesse du graphique sur arrêt. Une fois la pompe arrêtée, basculez-la en position inverse pour récupérer la solution de traçage jusqu'à ce qu'elle atteigne la première marque sur la canule de piqûre.Ensuite, retirez le tube de centrifugeuse, dispersez les bulles éventuelles dans la canule à l’aide d’un peu de solution de chasse et éliminez toute trace d’eau résiduelle provenant éventuellement de la fuite de la cellule d’écoulement afin de fractionner le gradient. Puis, placez le tube de centrifugeuse contenant le gradient de saccharose dans le support et percez-le avec la canule. Placez ensuite dix microtubes de centrifugeuse de deux millilitres dans les positions deux à onze du plateau du collecteur de fractions, ainsi qu’un tube de récupération dans la position un, de sorte que les bouchons ne dépassent pas vers le haut.Régler le bouton de commande de la pompe sur manuel et le débit sur la pompe à seringue à 6,0 millilitres par minute. Ensuite, appuyer sur lecture du collecteur de fractions dès que le bras atteint le premier tube. Appuyer sur le bouton pause pour positionner le bras et ouvrir la vanne de distribution des fractions.Ensuite, utilisez la commande d'avancement pour démarrer la pompe et surveiller le stylo de l'enregistreur graphique. Lorsque le stylo commence à s'incliner vers le haut, indiquant que l'échantillon traverse la cellule d'écoulement, remplacez rapidement le tube de déchet par le tube numéro un. Puis, dès que la première goutte est collectée, passez rapidement les commandes sur démarrage à distance, arrêt et débit variable de 1,0 millilitre par minute, puis appuyez sur lecture pour permettre à l'interface du collecteur de fractions de recueillir des fractions d'un millilitre chaque minute.Enfin, une fois que la solution de suivi bleue entre dans le dernier tube, appuyez sur arrêt. Le profilage PolyZone est une technique essentielle permettant de démontrer l'implication spécifique du CD4 PD dans la traduction médiée par les IRA. Par exemple, dans cette expérience, des cellules HEC 293 ont été transfectées de manière transitoire afin de réduire les niveaux endogènes de PDC D quatre, puis soumises à une analyse de profilage PolyZone.La réduction des niveaux de PDC D quatre n'a pas altéré la traduction globale du gène, comme en témoigne l'absence de modifications du profil PolyZone. En comparant les cellules témoins SI et les cellules traitées par IPD CD quatre, la répartition des polysomes d'une variante non IRAs de XIAP est restée inchangée entre les cellules traitées et non traitées. En revanche, la répartition des polysomes des deux ARNm portant des IS, XIAP et BCL XL, a été significativement modifiée.En l'absence de PD CD4, la distribution de ces deux ARNm s'est déplacée vers les ribosomes lourds. Étant donné que cela n'est pas accompagné de changements dans les niveaux d'état stationnaire des ARNm de XIAP et de BCL XL, ces résultats démontrent une traduction accrue de XIAP et de BCL XL dans les cellules présentant des niveaux réduits de PDC D quatre, comme confirmé ultérieurement par immunotransfert. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer la traduction des ARNm en préparant une fraction de saccharose et en séparant les polysomes par ultracentrifugation.

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Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cet article décrit un protocole pour l'extraction de traduire les ribosomes des cellules eucaryotes. Une fois extraites, les ribosomes sont séparés en monosomes et polyribosomes par fractionnement sur gradient de saccharose pour permettre à différentes populations ribosomique pour être analysé. En tant que tel, cette méthode est le gold standard pour examiner la régulation de la traduction.

Eucaryotes Analyse du profil polyribosome

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La purification par affinité des ribosomes (TRAP) est capable de capturer la traduction spécifique du type cellulaire de l’ARNm. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédié à l’isolement de l’ARNm dans des populations cellulaires rares d’embryons de drosophile.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Ce protocole décrit une méthode simple pour extraire et fractionner les transcrits des tissus végétaux sur la base du nombre de ribosomes liés. Il permet une estimation globale de l’activité de traduction et la détermination de l’état de traduction d’ARNm spécifiques.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.

Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Découvrez le profilage des polysomes pour identifier les ARNm sélectivement traduits sous stress dans les cellules de mammifères. Cette méthode permet d'étudier la régulation de la traduction et l'adaptation cellulaire.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

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