Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

L’objectif général de l’expérience suivante est de distinguer les ARNm fortement et mal traduits par immobilisation et séparation des polyribosomes. Ceci est réalisé en ajoutant d’abord de la cyclo-heide aux cellules pour inhiber leur ribosome, leur translocation et la traduction de l’ARN. Dans un deuxième temps, les lysats des cellules traitées sont chargés sur un gradient de saccharose et une ultracentrifugeuse pour séparer les polyribosomes stockés en fonction de leurs masses.

Ensuite, le gradient est divisé en fractions égales pour séparer les transcrits fortement et mal traduits dans l’étape finale. R-T-Q-P-C-R est utilisé pour détecter la présence des ARNm d’intérêt dans chaque fraction. En fin de compte, le profilage des ribosomes peut être utilisé pour détecter des changements dans la traduction globale ainsi que la traduction spécifique de l’ARNm en réponse à des stress physiologiques et physiopathologiques distincts.

Le profilage PolyOne peut répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie moléculaire et cellulaire, telles que les ARNm sélectionnés, traduits lors d’un stress S, et comment cela permet aux cellules de s’adapter à ces conditions. La démonstration de cette procédure est la maman Dar d’un étudiant diplômé dans le laboratoire : Pour utiliser un fabricant de dégradés automatisé pour préparer un dégradé de saccharose, commencez par allumer le fabricant de dégradés et nivelez la plaque qui retiendra les dégradés lorsque la plaque sera nivelée. Cliquez sur OK.

Ensuite, pour sélectionner le programme de dégradé, ouvrez le menu grad et sélectionnez la liste. Cliquez sur SW 41, puis faites défiler la liste jusqu’à ce que le programme de 10 à 50 %de dégradé de 11 pas soit affiché et appuyez sur. Utiliser. Placez ensuite un tube ultracentrifuge conique SW 41 dans le bloc de marqueur et utilisez le marqueur de tube fin fourni pour tracer une ligne sur le tube le long de la marche supérieure du bloc.

Placez les tubes dans un support de montage sur une surface stable, puis fixez les deux canules fournies à deux seringues de 10 millilitres. Faites piper de haut en bas l’eau distillée chaude contenant des ARN dans la solution d’activation pour laver les seringues. Ensuite, après avoir éliminé toute trace d’eau, remplissez l’une des seringues avec 10 % de saccharose plus cyclo heide, et insérez la canule au fond du tube de l’ultracentrifugeuse.

Distribuez doucement la solution jusqu’à ce qu’elle dépasse juste le repère fait sur le tube. En prenant soin d’éviter les bulles. Remplissez ensuite l’autre seringue avec 50 % de saccharose plus du cyclo heide et nettoyez tout liquide supplémentaire du tube avec une lingette.

À l’aide de la canule, insérez doucement la solution de saccharose à 50 % dans le tube, en vous arrêtant lorsque la solution est au niveau du repère, puis retirez rapidement et en douceur la canule. La solution à 10 % de saccharose doit monter pour former un ménisque en haut du tube. Ensuite, inclinez légèrement le tube de l’ultracentrifugeuse pour déplacer les bulles d’air et insérez le capuchon à l’aide d’une micro-pipette pour éliminer tout excès de liquide dans le réservoir du bouchon.

Placez les tubes sur le générateur de dégradé, puis appuyez sur le bouton de course. Notez que la plaque s’inclinera à l’angle spécifié. Faites une pause de cinq secondes, puis les rotations pour former le dégradé commenceront.

Après environ deux minutes, la machine émettra un bip indiquant que la formation du gradient est terminée. Transférez doucement les tubes sur un support et retirez rapidement les capuchons lors d’un mouvement ascendant pour éviter de perturber la pente. Ensuite, chargez doucement 260 unités de lysat cellulaire préalablement préparé sur chaque gradient de saccharose, et faites tourner les tubes pendant une heure et demie à 260, 343 fois G et quatre degrés Celsius dans une ultracentrifugeuse.

Pour configurer l’instrument du système de fractionnement de gradient, commencez par allumer le spectrophotomètre. Ensuite, choisissez deux fois l’icône du dossier, puis deux fois la flèche de retour pour revenir à l’écran d’accueil et pour régler le collecteur de fractions sur la méthode PolyZone afin de vous assurer que la vanne du collecteur de fractions est réglée sur gaspiller. Cliquez sur la flèche pointant vers l’icône de la corbeille, puis placez une fiole MIA de 250 millilitres contenant de l’eau distillée sous le tube de collecte des déchets.

Sélectionnez maintenant les paramètres suivants sur l’enregistreur graphique : la molette de sensibilité pour régler la lampe et l’optique, le filtre de bruit. Passez à 1,5 le cadran du séparateur de pics pour désactiver la vitesse du graphique, composez à 30 centimètres par heure et à la ligne de base et ajustez le cadran sur le dessus de l’unité du spectrophotomètre à l’ouverture maximale. Placez ensuite la seringue et le corps dans la pompe et utilisez les vis fournies et la clé Alan pour la serrer en place.

Utilisez la commande rev à vitesse rapide pour remplir la seringue de solution de poursuite. Placez ensuite la pompe en position verticale et utilisez la commande avant pour chasser l’air à travers le tube. Ensuite, installez un tube d’ultracentrifugeuse rempli d’eau libre d’ARN dans le support, puis percez le tube avec la canule jusqu’à ce que les deux marques noires soient visibles.

Le trou de distribution se trouve entre les deux marques. Démarrez le tire-seringue en marche avant manuelle à 6,0 millilitres par minute. Lorsque la solution de chasse remplit un tiers du tube, passez à la vitesse variable avec un débit de 1,0 millilitres par minute.

Tournez maintenant le cadran de réglage de la ligne de base du spectrophotomètre jusqu’à ce que la tension sur le graphique soit à zéro. L’eau commencera à sortir du tube de déchets dans la fiole d’el Mya. Réglez ensuite la sensibilité souhaitée sur 1,0 au.

Lorsque la sensibilité a été ajustée, appuyez sur le bouton également de base et tournez le cadran de décalage de l’enregistreur pour régler le réglage de la ligne de base à 10 % sur l’enregistreur graphique. Ensuite, une fois que la ligne de base stable est atteinte, tournez l’interrupteur de la pompe et le cadran de vitesse du graphique sur OFF. Une fois la pompe éteinte, mettez-la en position de régime pour récupérer la solution de chasse jusqu’à ce qu’elle atteigne la première marque sur la canule de perçage.

Retirez ensuite le tube de centrifugation, dispersez les bulles dans la canule avec un peu de solution de chasse et nettoyez toute eau résiduelle qui aurait pu s’échapper de la cellule d’écoulement pour fractionner le gradient. Ensuite, installez le tube de centrifugation contenant le gradient de saccharose dans le support et percez le tube avec la canule. Ensuite, placez dix microtubes à centrifuger de deux millilitres dans le bac collecteur de fractions positions deux à 11 et un tube de taille en position un de sorte que les bouchons ne dépassent pas vers le haut.

Réglez le cadran de commande de la pompe sur manuel et le débit de la pompe à seringue sur 6,0 millilitres par minute. Appuyez ensuite sur play sur le collecteur de fractions dès que le bras atteint le premier tube. Appuyez sur le bouton pause pour positionner le bras et ouvrir la valve de distribution de fractions.

Utilisez ensuite la commande avant pour démarrer la pompe et surveiller le stylo de l’enregistreur graphique. Lorsque le stylo commence à dévier vers le haut, indiquant que l’échantillon passe à travers la cellule d’écoulement, remplacez rapidement le tube de déchets par le tube numéro un. Ensuite, lorsque la première goutte est collectée, basculez rapidement les commandes sur le démarrage à distance, l’arrêt et la variable 1,0 millilitres par minute et appuyez sur play pour permettre à l’interface du collecteur de fractions de collecter des fractions d’un millilitre toutes les minutes.

Enfin, une fois que la solution de chasse bleue est entrée dans le dernier tube, appuyez sur stop. Le profilage PolyZone est une technique clé pour démontrer l’implication spécifique de CD4 dans la traduction médiée par IRA. Par exemple, dans cette expérience, des cellules HEC 2 93 ont été transfectées transitoirement pour appauvrir les niveaux endogènes de PDC D quatre, puis soumises à une analyse de profil PolyZone.

La réduction des niveaux de PDC D quatre n’a pas altéré la traduction globale du gène, comme en témoigne l’absence de changements dans le profil PolyZone. En comparant le contrôle SI et les cellules traitées par la CD IPD, la distribution des polysomes d’une variante non IRA de XIAP était inchangée entre les cellules traitées et non traitées. En revanche, la distribution des polysomes des deux IS hébergeant les ARNm XIAP et BCL XL a été significativement modifiée.

En l’absence de CD4, la distribution de ces deux ARNm a été déplacée dans les ribosomes lourds. Comme cela ne s’accompagne pas de changements dans les niveaux d’état d’équilibre de l’ARNm XIAP et BCL XL, ces résultats démontrent l’amélioration de la traduction de XIAP et BCL XL dans les cellules avec des niveaux réduits de PDC D quatre, comme l’a confirmé la floraison occidentale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la traduction de l’ARNm en préparant la région du saccharose et en séparant les polysomes par ultracentrifugation.