Électroporation d'effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules mammifères

L’objectif global de l’expérience suivante est d’introduire des protéines exogènes, potentiellement cytotoxiques, telles que des effecteurs bactériens, dans les cellules de mammifères afin d’étudier leurs effets et leur fonction. Ceci est réalisé en cultivant d’abord des cellules de mammifères dans des conditions de culture standard afin d’obtenir des cellules hôtes appropriées dans lesquelles introduire la protéine purifiée d’intérêt. Dans un deuxième temps, l’électroporation des cellules hôtes cultivées en présence d’un effecteur bactérien purifié est effectuée, ce qui permet à la protéine d’entrer et d’interagir avec les cellules hôtes.

Ensuite, une visualisation ou un autre test fonctionnel est effectué afin d’évaluer la localisation subcellulaire et la fonctionnalité de la protéine effectrice. Les résultats basés sur la microscopie confocale, les méthodes immunochimiques ou d’autres techniques d’analyse montrent la localisation des effecteurs bactériens fonctionnels à leurs emplacements subcellulaires attendus et la liaison à leurs partenaires d’interaction connus. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transsection ou la transduction, est que ce protocole est une approche rapide, simple et peu coûteuse pour surmonter la cytotoxicité potentielle.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des agents pathogènes, telles que la découverte ou la validation des fonctions des protéines effectrices bactériennes. Bien que cette méthode ait été utilisée pour mieux comprendre les protéines effectrices bactériennes, elle peut également être appliquée à d’autres protéines ou à de petites molécules. La visualisation du résultat est essentielle.

Depuis la colocalisation avec des caractéristiques cellulaires connues, vérifiez l’association subcellulaire attendue de la protéine électroporée pour commencer cette procédure. Transférez 400 microlitres de suspension cellulaire dans un vétérinaire pré-réfrigéré. Ajoutez ensuite 20 microgrammes de protéines sélectionnées pour atteindre une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre.

Effleurez doucement le vétérinaire environ 10 fois pour mélanger et pour éviter d’endommager les cellules. Après cela, séchez l’extérieur du Q Vet avec une serviette en papier pour éviter les arcs électriques dans l’électro. Placez l’échantillon dans l’électro et réglez-le à 0,3 kilovolts pendant 1,5 à 1,7 milliseconde immédiatement après l’électroporation.

Agitez doucement le qve environ 10 fois pour bien mélanger l’échantillon avant de procéder à la fixation et à la coloration immunofluorescente ou à la purification par affinité. Après quatre heures de récupération de l’électroporation, lavez les cellules avec du PBS stérile. Fixez ensuite les cellules dans du méthanol à 100 % pendant deux minutes à température ambiante.

Par la suite, lavez les cellules avec du PB S3 stérile plusieurs fois. Perméez les cellules avec 0,4 % de tritton X 100 dans du PBS pendant 15 minutes. Ajustez la longueur de perméable et la force de Triton X 100 en fonction de l’épitope et de l’emplacement de la protéine cible.

Bloquez ensuite les cellules avec 5 % de BSA dans du PBS pendant une heure à température ambiante. Après. Lavez-les trois fois avec du PBS. Ensuite, incubez-les avec l’anticorps primaire dans la solution de liaison d’anticorps pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un léger balancement le lendemain.

Lavez les cellules quatre fois de plus avec du PBS. Ensuite, incubez-les avec l’anticorps secondaire conjugué par fluorescence approprié dans la solution de liaison aux anticorps. Ajoutez d’autres colorants au besoin, tels que cinq micromolaires de germe de blé agglutinine ou WGA conjugué à Alexa 6 47 ou DPI pendant une heure à température ambiante et à l’abri de la lumière.

Ensuite, lavez les cellules avec du PBS cinq fois et stockez-les à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être imagées dans cette étape. Lavez les cellules électroporées deux fois avec quatre degrés Celsius PBS. Après quatre heures de récupération, faites ligouter les cellules avec un millilitre de tampon de lyse sur de la glace.

Grattez rapidement les cellules avec un policier en caoutchouc et rassemblez-les dans les tubes coniques. Puis poux les cellules par sonication et vortex vigoureux. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 10 000 fois.

Gravité pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour collecter les débris cellulaires et les agrégats insolubles et sauver le surnageant. Combinez un millilitre de lysat cellulaire électroporé clarifié avec 50 microlitres de suspension de résine strept in aros. Incuber le mélange à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec rotation d’un bout à l’autre pour capturer la protéine électroporée et les complexes associés via l’étiquette d’affinité peptidique de liaison strp havein.

Après cela, centrifugez l’échantillon à 2 500 fois la gravité pendant deux minutes et jetez le surnageant. Ensuite, lavez l’échantillon deux fois avec un millilitre de PBS. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de quatre tampons de chargement XLDS, 20 microlitres de H2O distillé et un microlitre de TCEP 0,5 molaire à l’échantillon, et laissez un peu de surnageant.

Chauffez l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, refroidissez-le sur de la glace pendant environ une minute. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 10 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

À la fin, prélever le surnageant pour le transfert Western avec les anticorps appropriés. Les cellules Hela ont été incubées ou électroporées avec 50 microgrammes par millilitre d’un effecteur salmonella marqué par affinité, GTGE et colorées avec un anti-marqueur effecteur anticorps dpi, un masque nucléaire et WGA Pour délimiter la limite cytosolique, les cellules hela incubées montrent une absence de fluorescence verte, indiquant un manque d’internalisation de GTGE. Il s’agit d’une photomicrographie représentative de la GTG électroporée, qui montre la protéine effectrice électroporée intracellulaire illustrée.

Voici le western blot pour détecter le partenaire d’interaction eucaryote sine thine protein kinase N one. Notez que la voie à l’extrême droite comprend deux cuvettes regroupées. Le signal d’un qve se fondait dans l’arrière-plan, mais pkn un était toujours enrichi au-dessus du manque de liaison observé dans le contrôle sans appât par microscopie confocale après électroporation avec 50 microgrammes par millilitre.

Les cellules hela de S sph one montrent la colocalisation entre pkn one et S SPH one. Ce chevauchement optique indique que l’effecteur et la protéine hôte sont suffisamment proches pour interagir physiquement. Le fait que l’interaction ait été démontrée pour la première fois dans le noyau offre un soutien supplémentaire que la protéine a été correctement trafiquée par l’hôte.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée de manière à haut débit. Pour étudier plusieurs protéines individuelles Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de déterminer empiriquement les meilleures conditions d’électroporation pour chaque type de cellule et cible protéique. Cette procédure peut vous permettre de multiplexer avec plusieurs protéines, de petites molécules ou une combinaison des deux pour mieux comprendre les processus cellulaires dans une variété de systèmes modèles.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont l’électroporation peut être utilisée pour introduire des macromolécules telles que des protéines dans les cellules de mammifères.