Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

L’objectif global de l’expérience suivante est d’isoler des cellules musculaires purifiées à partir de biopsies musculaires de patients humains et de les immortaliser pour des études en aval. Ceci est réalisé en pesant, hachant et digérant d’abord le tissu collecté pour dissocier les cellules mononucléées. Dans un deuxième temps, les cellules myogéniques sont purifiées des cellules non myogéniques par des faits.

Ensuite, les cellules myogéniques sont infectées à la fois par CDK quatre et par H tourt pour générer des cellules immortalisées. Les résultats montrent que les cellules musculaires vivantes dérivées de patients peuvent être développées sur plusieurs passages et différenciées en fonction des tests de fusion cellulaire, de la présence de myotubes à contractions et de l’expression de marqueurs myogéniques. Les implications de cette technique vont au-delà du diagnostic des maladies musculaires, car elle peut potentiellement fournir un nombre illimité de cellules myogéniques pour le criblage de médicaments ou d’autres applications en aval où un grand nombre de cellules est nécessaire.

Je ferai une démonstration de la procédure avec Jerome Robbin, un boursier postdoctoral du laboratoire du Dr Woody Wright à Dallas. Commencez par dissocier la biopsie musculaire pour purifier les cellules myogéniques. Tout d’abord, dans une cagoule de biosécurité de culture tissulaire, enregistrez la masse de la biopsie musculaire.

Ensuite, dans un plat de 10 centimètres, utilisez des scalpels stériles pour hacher le tissu en morceaux finement hachés. Ajoutez quelques gouttes d’un X-H-B-S-S pour que le tissu ne se dessèche pas par gramme de tissu. Ajouter 3,5 millilitres de pâte à disque deux et 3,5 millilitres de solutions de collagénase D.

Mélangez ensuite les cellules à l’aide d’une pipette de 25 millilitres et transférez la plaque dans un incubateur toutes les 15 minutes. Mélangez les cellules avec une pipette de cinq millilitres dans les 90 minutes. Il devrait y avoir une dissociation complète des tissus.

Une fois le tissu dissocié, ajoutez deux volumes de milieu de croissance et filtrez-le à travers une passoire de 100 microns. Prélever le filtrat dans un tube de 50 millilitres. Granulez les cellules du filtrat à 329 G pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, remettez les cellules en suspension dans HBSS avec 0,5 % BS, A, et comptez-les. Ajustez le volume pour obtenir 1 million de cellules par 100 microlitres. Réserver une aliquote de 250 000 cellules comme témoin non coloré et deux aliquotes similaires pour les témoins à coloration unique.

Tous ces éléments sont nécessaires à l’analyse par fax. Maintenant, colorez les cellules avec cinq microlitres d’anticorps anti-CD 56 par million de cellules et incubez tous les échantillons sur de la glace pendant une demi-heure. Ensuite, lavez rapidement les échantillons avec 10 millilitres de HBSS.

Ensuite, granulez les cellules comme avant, mais à quatre degrés Celsius après que les cellules ont été granulées, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un X-H-B-S-S à 5 millions de cellules par millilitre. Ajoutez ensuite de l’iodure de propidium à une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Purifiez maintenant les cellules myogéniques positives au CD 56 des cellules non myogéniques en utilisant les faits suivant la plaque de purification.

Les cellules myogéniques à 50 000 par puits dans six plaques de puits recouvertes d’une culture de gélatine à 0,1 %, les cellules jusqu’à ce qu’elles soient attachées, puis les infectent avec le virus pour la lignée cellulaire immortelle. Dans le protocole textuel, il y a un examen supplémentaire de la façon de purifier et de cultiver les fibroblastes dermiques comme décrit dans le protocole textuel. Préparez les cellules phoenix tropic après les avoir incubées pendant la nuit avec le mélange plasmidique PolyJet.

Nourrir les cellules fraîches, moyennes, composées de quatre parties de DME M1, d’une partie de milieu, de 1 99 et de 10 % de sérum de veau. Préparez également des emballages inotropes. PA trois cellules 17 dans une plaque à six puits avec environ 400 000 PA trois cellules 17 par puits.

12 heures plus tard, collectez le virus contenant du surnageant sur les cellules tropicales de Phoenix et faites-le passer à travers un filtre de 0,45 micron. Ensuite, utilisez un millilitre de surnageant pour infecter les cellules PA trois 17 et cultivez-les pendant la nuit. Le lendemain, sélectionner une lignée cellulaire productrice de virus à partir de l’AP trois 17 cellules en appliquant des antibiotiques à raison de 0,5 milligramme par millilitre au milieu lorsque les cellules sont proches de la co-fluidité, prélever le surnageant sur les cellules trois fois à des intervalles de 12 heures.

Filtrez les collections après chaque récolte. Le filtrat est le surnageant viral en activité. Divisez-le en un millilitre. Aliquotes.

Réservez quelques aliquotes pour une utilisation immédiate. Les aliquotes supplémentaires peuvent être stockées à moins 80 degrés Celsius, mais perdront 50 % d’efficacité à chaque cycle de congélation et de dégel. Prenez note que tout au long du processus, l’équipement qui a touché les particules virales doit être lavé à l’eau de Javel avant d’être jeté dans la poubelle.

Pour stocker de manière permanente la lignée cellulaire stable productrice de virus PA 3 17, congelez les cellules dans du sérum 10 % DMSO 90 % et stockez-les à moins 150 degrés Celsius dans chaque puits de cellules purifiées par fax. Dans une assiette à six puits, ajoutez 400 microlitres de surnageant viral fraîchement produit. Laissez deux puits sans virus comme témoins.

Incuber l’assiette pendant la nuit et le lendemain, changez le milieu dans chaque puits en 2,5 millilitres de milieu musculaire frais. Assurez-vous de jeter les milieux et les pipettes qui contiennent des particules virales dans le récipient d’eau de Javel. Laissez les cellules incuber dans le milieu musculaire frais pendant trois jours.

Sélectionnez ensuite les cellules pour la résistance aux antibiotiques en utilisant 400 microgrammes de néomycine par millilitre pour l’infection à CDK quatre, ou 300 microgrammes d’hygromycine par millilitre pour la télomérase humaine. Infection par transcriptase inverse pendant une semaine ou deux. Maintenez les cellules dans des conditions sélectives jusqu’à ce que les cellules et les puits de contrôle soient tous morts.

Passez toujours les cellules avant qu’elles ne deviennent confluentes, même pendant la sélection lorsqu’elles atteignent 60 à 80 % de fluidité Co, utilisez une solution EDTA à 0,05 % pour collecter et passer les cellules. Passez les cellules dans des boîtes de 10 centimètres avec du myoblaste frais, un milieu avec des antibiotiques. Ensemencez d’abord les cellules à une très faible densité de trois à 500 par boîte de 10 centimètres.

Maintenez les cellules dans ces boîtes pendant environ deux semaines jusqu’à ce que de petites colonies de 10 à 20 cellules se forment lorsque les petites colonies sont évidentes. Retirez la plupart du support en ne laissant qu’une fine pellicule de support pour empêcher les cellules de se dessécher. Maintenant, trempez un côté d’un anneau de clonage dans de la graisse silicone sous vide et l’anneau sur un clone souhaité.

Mettez un anneau différent autour de chaque clone souhaité dans chaque anneau. Ajoutez quelques gouttes de solution de trypsine EDTA. Lorsque les cellules sont arrondies, utilisez un microscope pour aspirer soigneusement chaque boule de cellules dans une pointe de pipette de 200 microlitres.

Transférez les billes de cellules dans les puits de la plus petite plaque multipuits disponible. Développez ensuite chaque clone si nécessaire pour éviter la co-fluidité. En utilisant le protocole décrit, les cellules myogéniques ont été isolées avec des fibroblastes, des cellules adipogènes et peut-être des cellules immunitaires, puis purifiées par des faits.

Les cellules ont ensuite été immortalisées comme décrit à l’aide de virus exprimant la kinase dépendante de la cycline quatre, la CDK quatre et la télomérase humaine à transcriptase inverse h turt. Il était crucial de maintenir les paraboles en dessous de la co-fluidité à chaque étape, car elles pouvaient entrer dans le programme de différenciation et former des myotubes en comparant la formation et la contraction des myotubes dans les cellules de contrôle non immortalisées et les cellules immortalisées. Aucune différence n’a été observée.

L’immortalité de la lignée cellulaire a été confirmée en mesurant la longueur des télomères et l’activité des télomères. L’immortalité était également évidente dans les courbes de croissance cellulaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier les cellules musculaires primaires de la biopsie du patient.

Immortaliser le myoblaste primaire et isoler et sélectionner des clones myogéniques immortels. N’oubliez pas que le travail avec le virus nécessite l’utilisation d’une culture tissulaire spécifique et d’un système de ventilation sécurisé. De plus, tout ce qui est impliqué dans la manipulation du virus, comme les pipettes, les embouts, les plats, les seringues et les filtres, doit être blanchi pour éviter toute contamination indésirable.

Les particules virales peuvent être dangereuses et des précautions doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.