Name: Calibré Forceps modèle de compression de la moelle épinière des blessures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Découvrez la méthode de compression de la moelle épinière chez la souris à l'aide de pinces calibrées. Cette technique chirurgicale délicate permet de générer des lésions reproductibles pour la recherche en neurosciences.

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Le financement de ce travail a été fourni par les Hôpitaux Shriners et les bourses du CRIEM à AMC et AM. Nous tenons également à remercier Plemel et al.7 Pour la conception et la publication du modèle de pince calibrée.

Toutes les procédures animales et les méthodes de protection des animaux doivent être approuvés par Institutional Animal Care and Usage Comité de l&#39;institution (IACUC). 1. Préparation chirurgicale <ol><li> Assemblez tous les outils chirurgicaux et des réactifs nécessaires: pinces, ciseaux Vana roungeurs, écarteur, scalpels, ciseaux, des sutures, des agrafes de la peau, Q-tips, une solution saline stérile, éponges chirurgicales, et isoflurane. Préparer et autoclave un pack complet d&#39;outils chirurgicaux avant la chirurgie. Si des opérations chirurgicales sur plus d&#39;une souris, et l&#39;autoclave préparer un paquet d&#39;outils par animal, ou une autoclave paquet d&#39;instruments chirurgicaux et stériliser avec un stérilisateur à outil entre dans des interventions chirurgicales. En général, un paquet d&#39;outils stérilisés peut être utilisé sur jusqu&#39;à 5 souris si un outil terilizer de billes de verre est utilisé pour nettoyer les outils entre-deux chirurgies (après cinq animaux les outils doivent être re-nettoyé et stérilisé avant utilisation). Se il vous plaît vérifier avec votre administrateur local pour IACUC institutisur les lignes directrices spécifiques. </li><li> Stériliser le champ opératoire avec 70% tampons imbibés d&#39;alcool isopropylique. Mettre en place des champs opératoires pour assurer un champ stérile est maintenue pendant la chirurgie. </li><li> Peser chaque souris avant la chirurgie. Administrer une dose de 0,05 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine, la voie sous-cutanée. </li><li> Anesthésier l&#39;animal par l&#39;administration d&#39;isoflurane à une dose de 4% dans la chambre d&#39;aspiration de la machine isoflurane. </li><li> Une fois que l&#39;animal est anesthésié, appliquer une pommade pour les yeux pour éviter la déshydratation, réglez l&#39;animal sur un coussin chauffant à 37 ° C, et de veiller à ce que la tête de la souris est correctement situé dans le cône d&#39;anesthésie. (Remarque: Utilisez une source de chauffage qui ne sera pas causer des brûlures thermiques, à savoir, une couverture de circulation d&#39;eau, bouteille d&#39;eau chaude, ou équivalent..) A ce stade, administrer une dose de 2% d&#39;isoflurane à l&#39;animal. </li><li> Raser la surface dorsale de la souris, à environ 1 cm autour de l&#39;emplacement d&#39;incision prévue. </li><li> Désinfecter l&#39;incision site par lavage avec 70% de tampons imbibés d&#39;alcool isopropylique, puis avec une solution d&#39;iode (10% de povidone-iode, de 1% d&#39;iode disponible). Répétez 3 fois. </li></ol> 2. Dorsale laminectomie <ol><li> Avant de faire une incision, se assurer que l&#39;animal est correctement anesthésié en vérifiant les réflexes à l&#39;aide de la méthode de pincement orteil ou queue. </li><li> Faire une incision le long de la colonne vertébrale dorsale avec un scalpel et la lame, puis vérifier les réflexes à nouveau. Cambrer le dos pour aider à bien visualiser des repères, tels que les frontières entre les vertèbres. </li><li> Couper à travers la peau. Insérez écarteur pour maintenir la peau et le fascia arrière de la moelle épinière. Vider le tissu de chaque côté de la moelle épinière pour exposer les muscles couvrant la colonne vertébrale. NOTE: Le chirurgien doit être familier avec les repères anatomiques. Par exemple, l&#39;angle inférieur de l&#39;omoplate correspond à T7. Le sommet de la courbe naturelle de la colonne vertébrale de la souris est T12 et peut être utilisé comme point de référence. </li><li> Avec péclairage Roper, déterminer l&#39;espace entre les vertèbres. Trouver l&#39;extrémité postérieure de T10 et couper les muscles et le fascia perpendiculaire à l&#39;espace disque intervertébral. Coupez juste assez pour exposer le processus et postérieure lamina épineuse de T10. </li><li> En utilisant une paire de fine pointe de Dumont # 5 pince, retirer une partie du tissu de la lame et apophyse épineuse pour exposer une petite tranche de la moelle épinière. Lorsque cela est nécessaire, utiliser une pince de tissu pour stabiliser la colonne vertébrale. </li><li> Effectuez la laminectomie en insérant un côté d&#39;une paire de petits ciseaux de Vana le long du côté dorsolatéral de la vertèbre et juste sous la lame. <ol><li> Faire de petites cisailles prudentes pour couper à travers le côté latéral de la lame vertébrale. Se assurer qu&#39;aucune pression ne est appliquée à la moelle épinière. </li><li> Répéter l&#39;opération sur l&#39;autre côté. </li><li> Appliquez une légère pression pour stopper le saignement si nécessaire avec un Q-tip ou une éponge chirurgicale, en prenant soin de ne pas appliquer une pression sur la moelle épinière. NOTE: Préparer la mousse de geltrempé dans une solution saline stérile dans le cas où les besoins de la coagulation à contrôler. </li><li> Une fois que les incisions ont été faites, soulevez la face dorsale de la vertèbre et effacer doucement toutes les pièces jointes de tissus. Utiliser les moyens appropriés pour contrôler les saignements si nécessaire. </li></ol></li></ol> 3. compression de la moelle épinière <ol><li> Utilisation roungeurs ou forceps laminectomie, en sorte que les côtés latéraux de la moelle épinière sont exempts d&#39;os vertébral de sorte que les pinces calibrées pour la blessure de compression peuvent situer de part et d&#39;autre de la moelle épinière. Les bras de la pince doivent être capables d&#39;être placés dans l&#39;espace épidural sur des côtés adjacents de la moelle épinière et les pointes de la pince doit être capable d&#39;atteindre le fond du canal vertébral. <ol><li> Assurez-vous que la visibilité de la moelle épinière est bon. </li></ol></li><li> Situer le Dumont # calibré 5 forceps approximativement au milieu du segment exposé de la moelle épinière. Rappelons que les bras de la forceps doit être placé dans l&#39;espace épidural sur les côtés adjacents et les conseils doit toucher le sol du canal vertébral pour générer blessures reproductibles. </li><li> Comprimer soigneusement la moelle épinière jusqu&#39;à ce que les entretoises relient. Maintenir en place pendant 15 sec. </li><li> Relâchez doucement la force de compression et retirer la pince calibrés de la moelle épinière. Une solution saline stérile doit être utilisé pour retrouver l&#39;homéostasie avant la plaie est fermée. </li></ol> 4. Blessure clôture <ol><li> Suturer soigneusement la couche de muscle dans la moelle épinière, en prenant soin de ne pas perturber ou appliquer une pression sur la moelle épinière. </li><li> Utilisez soit des sutures ou des agrafes pour fermer la peau sur la plaie. </li><li> Si vous utilisez gaz anesthésique, commencer à diminuer / désactiver l&#39;anesthésique. </li><li> Administrer 0,1 ml de sonneries lactate par 10 g de poids corporel pour aider compte de déshydratation au cours de la chirurgie et après la chirurgie lorsque l&#39;animal est léthargique et la récupération de la blessure. La solution doit être warmed à la température du corps avant l&#39;injection. </li><li> Placez la souris dans une cage sans literie. La cage doit reposer sur le dessus d&#39;un patin chauffant (comme décrit dans 1.1.5) d&#39;une manière qui permet à la moitié de la surface de la cage pour être sur le patin, tandis que l&#39;autre moitié est en appui sur une contre-RT, pour donner le options de climat souris une fois qu&#39;il est ambulatoire. Prenez soin de veiller à ce que la «cage de récupération&quot; est situé dans un environnement calme. Surveiller de près l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il a repris conscience, au moment où la souris peut être transféré à une cage régulière avec literie. </li></ol> 5. Soins post-opératoire <ol><li> Après la chirurgie, administrer une dose de 0,05 mg / kg de poids corporel buprénorphine sous-cutanée toutes les 12 h pour les 3 premiers jours après la chirurgie, puis au besoin pour gérer les symptômes de la douleur. </li><li> Administrer une dose de sonneries lactate (0,1 ml par 10 g de poids corporel sous-cutanée) pour les 3 premières - cinq jours après la chirurgie. Donnez cette dose si / quand l&#39;uniMAL commence à montrer des signes de déshydratation en dehors de cette période initiale. </li><li> Exprimer manuellement la vessie des animaux à l&#39;aide de la manoeuvre Crede deux fois par jour. Palper doucement l&#39;abdomen de l&#39;animal pour localiser la vessie, puis appliquer une pression à la baisse doux jusqu&#39;à ce que la vessie est vide. <ol><li> Si la vessie ne se vide pas ou l&#39;urine est sanglante ou trouble, administrer 50 mg / kg du poids corporel de Baytril à l&#39;animal par injection intrapéritonéale pendant 10 jours. </li></ol></li><li> Surveiller les animaux pour des signes de autophagie, la déshydratation et la perte de poids excessive (supérieure à 20% du poids corporel). Si un animal présente un de ces symptômes se il vous plaît consulter un vétérinaire immédiatement en ce qui concerne les options de traitement, ou euthanasier l&#39;animal d&#39;une manière humaine suivant les lignes directrices du IACUC. <ol><li> Étant donné que la mobilité peut être limitée à droite après la chirurgie, prendre les mesures nécessaires pour se assurer que les animaux ont accès à la nourriture et de l&#39;eau. Préemballés nourriture humide, ainsi qu&#39;unes hydrogel, peut être mis à la disposition des animaux dans ces cas. </li></ol></li></ol> 6. Évaluer les lésions tissulaires résultant de la compression des blessures <ol><li> Anesthésier animaux comme décrit dans les étapes 1.4 et 1.5. Contrôler la profondeur de l&#39;anesthésie par pincement de l&#39;orteil et le suivi des réflexes de clignotement de la cornée. Lorsque l&#39;animal est insensible aux stimuli, passez à l&#39;étape 6.2. </li><li> Effectuer une perfusion intracardiaque 10. <ol><li> Exposer la cavité thoracique et insérer une aiguille dans le ventricule gauche. Rincer fluides existants avec 20 - 30 ml de phosphate refroidie à la glace une solution saline tamponnée (PBS), suivi par 15 à 25 ml de glace-froid 4% de paraformaldehyde (PFA). </li></ol></li><li> Retirer la moelle épinière. <ol><li> Couper la dorsale de la peau à la moelle épinière et de déblayer tout excès de tissu entourant la longueur de la colonne vertébrale. </li><li> Accise colonne vertébrale et coupé tout tissu restant. Le niveau réel de la laminectomie et ie préjudice peut être confirmé par le comptage des nervures. </li><li> Utilisez des ciseaux et des pinces Vanna pour déplacer de petites sections de la colonne vertébrale dans une direction caudale à rostre. Continuer à couper jusqu&#39;à ce que le cordon est exposé suffisamment pour permettre l&#39;élimination sûre. Visualisation de l&#39;emplacement et de la découpe peut être facilitée par l&#39;utilisation d&#39;un stéréoscope. </li></ol></li><li> Placez le tissu de la moelle épinière dans 4% PFA. Permettre au tissu d&#39;après-fix dans cette solution pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Cryoprotect tissu par incubation dans 30% de saccharose pendant 24 heures à 4 ° C. </li><li> Incluez tissu dans octobre En bref, prendre le tissu de l&#39;incubation de saccharose à 30% et de supprimer tout excès de solution. Placez le tissu dans un cryomoule rempli d&#39;octobre et incuber pendant 1 h à 4 ° C. <ol><li> Éliminer les moisissures de 4 ° C, confirmer orientation directionnelle du tissu, mettez le moule dans un plat peu profond de 2-méthylbutane (pré-réfrigérée pendant 1 heure sur de la glace sèche) et laissez octobre se solidifier complètement. Gardez sur glace sèche si vous utilisez immédiatement ou store à -80 ° C. </li></ol></li><li> Coupez le tissu en 20 sections um sagittal l&#39;aide d&#39;un cryostat. Mont tissus directement sur diapositives. Stocker à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Effectuer hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) tache. <ol><li> Brièvement, réhydrater le tissu (5 min, deux fois), tache avec hématoxyline (2,5 min), et laver avec de l&#39;eau (1 min, 2 fois). </li><li> Incuber dans un tissu 50%, puis 70% d&#39;éthanol (3 min à chaque fois), de la teinture avec de l&#39;éosine (45 sec), et déshydrater par incubation à 90% (5 s), 95% (5 s), 100% d&#39;éthanol (2 min) et l&#39;isopropanol (2 min). </li><li> Effacer avec du xylène (5 min, 3 fois). REMARQUE: coloration H &amp; E varie en fonction de l&#39;épaisseur du tissu et des conditions spécifiques. Par conséquent, la normalisation est nécessaire avant de procéder à des échantillons de tissus expérimentaux. </li></ol></li><li> Couvrir le tissu avec une mince bande de Permount (~ 100 um) et lamelle. Appuyez sur tous les côtés de la lamelle pour assurer une bonne distribution de fluide. Laissez sécher diapositives O / N. </li><li> Visualize coupes de tissus en utilisant un microscope et images de capture numérique en utilisant le logiciel d&#39;accompagnement. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le choix d&#39;un modèle SCI est important dans la conception des expériences pour déterminer l&#39;efficacité des traitements pour des cas humains de SCI. Ces expériences ont besoin d&#39;un modèle animal qui est hautement reproductible pour limiter la variabilité qui peut entraîner des données non concluants. Ils devraient également être de la pertinence clinique d&#39;évaluer avec précision la condition humaine, ils sont la modélisation. A cet effet, le choix d&#39;une blessure à la compression ou contondante sur une transection est plus pertinent cliniquement 3. Cependant, percuteurs et des appareils de chute de poids pour les blessures de contusion nécessitent l&#39;utilisation de machines coûteux et compliqué. En revanche, le modèle de pince calibrée de SCI utilise des pinces qui sont faciles à assembler à partir de matériaux de laboratoire communs modifiée, et de l&#39;opération ne nécessite qu&#39;une seule étape supplémentaire après une laminectomie dorsale standard pour exposer la moelle épinière. Cependant, un inconvénient de cette méthode est que la force de compression est toujours appliquée latéralement plutôt que le dos, commeest le plus souvent vu dans les cas cliniques humains de SCI 9, et les blessures de compression généré en utilisant la méthode affecte une plus grande mesure de rostrale-caudale de tissu que les modèles de 1,2 contusion. Ce modèle a été démontrée par les concepteurs de la technique, et nous, pour générer reproductible SCI 7,11, et est bien adapté à la taille de la souris. En outre, ce modèle de lésion permet aux animaux pour être évalués après chirurgie et thérapeutiques des traitements utilisant une multitude de tests comportementaux, tels que le Basso échelle de souris pour Locomotion et le test de cheveux de von Frey, pour vérifier que d&#39;une cohorte d&#39;animaux partagent la même gravité des blessures et les déficits neurologiques 7,11-13. Ces mêmes techniques peuvent aussi être utilisées pour évaluer l&#39;efficacité des traitements administrés aux animaux au cours d&#39;études d&#39;investigation, répondant aux critères généraux pour les modèles animaux utilisés pour évaluer les thérapies SCI 2,7. Procédé de production de la pince calibrées pour le modèle de blessure est simple et peut être réalisée avec une variété de différentes méthodes. Nous avons utilisé la méthode d&#39;espacement 11, tel que publié par Plemel 7, et nous avons également modifié pince à l&#39;aide d&#39;une petite vis, qui non seulement fournit une méthode plus facile pour créer le dispositif de compression, mais permet également de polyvalence dans le réglage de la largeur de la compression finale, des bénéficier pour des études comparatives. La gamme d&#39;options dans la création de la pince est presque illimitée, tant que l&#39;entretoise (s) fournissent un moyen stables de toujours fermer la pince à la même distance et peut résister à l&#39;autoclavage et la stérilisation. Les méthodes chirurgicales décrites au sein de cette vidéo sont hautement reproductibles entre les utilisateurs, mais il est nécessaire que l&#39;on prenne soin lors de l&#39;exécution de la laminectomie et suture de l&#39;animal après la procédure a été effectuée de telle sorte que la moelle épinière ne souffre pas de forces de compression supplémentaires qui peuvent augmenter la gravité des blessures et confondre les expériences futures. </p&gt; Avec une formation adéquate et la pratique, le modèle de pince calibrée de blessure de compression est bien adapté pour effectuer SCI chez les souris qui imitent cas cliniques observés chez les humains 2,3,7. En raison de la facilité de création forceps, production de souris à des degrés de gravité variables blessure peut être facilement effectuée. Ce sera d&#39;une grande utilité pour l&#39;observation des effets génétiques sur SCI des degrés de gravité chez les souris transgéniques différentes ainsi que l&#39;évaluation de l&#39;efficacité des transplantations de cellules souches chez la souris. La majorité des études dans la littérature ont été réalisées sur des rats en raison de leur taille, ce qui rend généralement plus facile à réaliser chirurgies. Cependant la méthode publiée par Plemel et al. 7 et décrit par nous dans cette vidéo devrait permettre SCI doit être effectuée sur des souris avec une grande facilité et la reproductibilité.

Les modèles animaux de SCI sont des outils précieux pour évaluer l&#39;efficacité des paradigmes thérapeutiques visant à atténuer les dommages à la suite d&#39;un traumatisme à la moelle épinière. Par nécessité expérimentale, ces modèles doivent fournir déficits reproductibles dans locomoteur et comportements sensoriels, être réglables pour produire des blessures de gravité différente, et démontrent que la gravité des blessures en corrélation avec le degré de déficit neurologique observé. Il existe trois principaux types de SCI avec des caractéristiques distinctes de blessures: transection, contusion, et une compression. En bref, une lésion de la transection est une lacération de la moelle épinière, une blessure par contusion provient d&#39;une mémoire, la force de contact appliquée sur la face dorsale de la moelle épinière et une lésion de la compression se produit lorsqu&#39;une force préjudiciable est appliquée à la moelle épinière, et peut également être appelé lésion par écrasement 2. Complete blessures de transection sont cliniquement rare chez les humains 3, tandis que la contusion und blessures de compression sont plus courants. La blessure de compression produit un résultat similaire à ce qu&#39;on trouve dans SCI humaine provoquée par, par exemple, la compression de la tumeur ou d&#39;autres forces de compression nuisibles, et peut être effectuée en utilisant un simple ensemble d&#39;outils. Contusion et de compression blessures sont similaires en ce qu&#39;ils sont une force de compression et les deux ont des caractéristiques pathologiques similaires, tels que la désorganisation cytoarchitectoniques, et évoquent des réponses endogènes similaires à 1,4 blessures. Le modèle de lésion par contusion applique habituellement cette force à la moelle épinière dorsale au moyen d&#39;un appareil spécial d&#39;une manière similaire aux cas humains de SCI résultant d&#39;une impaction de la colonne vertébrale 2,5,6. En revanche, les blessures de compression peuvent être produits par une variété de procédés à appliquer une force latérale ou dorsale. Méthodes d&#39;une blessure de compression comprennent des pinces 7, de clips anévrisme calibrés 2, ou en plaçant un poids directement sur ​​la moelle épinière 8. Un avantage de laclips anévrisme est qu&#39;ils sont capables de fournir différentes quantités de force 9. La méthode d&#39;ajout de poids à la surface dorsale de la moelle épinière juste 8 nécessite le poids à être mis en place pendant 10 minutes, ce qui augmente considérablement la durée de la chirurgie et entraîne des incohérences en raison de placement du poids et du mouvement en raison de la respiration de la animal. En raison de la petite taille de la souris, animaux situant dans des appareils spécialisés conçus pour une utilisation chez les rats, comme percuteurs pour blessures de contusion, peut être difficile, voire entraîner des blessures incompatibles 7. Cependant, les souris sont disponibles dans une large gamme de souches transgéniques, à la différence des animaux plus grands tels que des rats ou des lapins qui sont très utiles pour la recherche SCI. La méthode Plemel de l&#39;aide de pinces calibrées pour comprimer la moelle épinière génère une SCI reproductible avec un haut degré de corrélation entre la gravité des blessures et le déficit neurologique 7. Ce modèle SCI chirurgicale estgénéré en utilisant une paire de forceps No. 5 Dumont modifiés pour être maintenues écartées à une distance définie par l&#39;une résine époxy de métal ou d&#39;une autre obstruction pour empêcher la fermeture complète. Cet espacement ingénierie assure que la pince sera toujours à proximité d&#39;une certaine largeur dans plusieurs chirurgies et par différents utilisateurs. L&#39;avantage du procédé est que les Plemel matériaux pour produire la pince calibrés peuvent être facilement achetés et assemblés en laboratoire sans avoir besoin d&#39;équipement spécialisé. Ces pinces peuvent résister à de multiples tours de l&#39;autoclave et la stérilisation, et l&#39;absence d&#39;un appareil encombrant séparée rationalise chirurgies. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;utilisation chirurgicale d&#39;une paire de pinces calibrées sur la moelle épinière de souris pour générer une blessure à la compression. Nous abordons également des préoccupations particulières liées aux soins de la moelle épinière des animaux blessés de laboratoire pour améliorer leur qualité de vie post-opératoire et réduire la mortalité.

<table><tbody><tr><td>Machine à isoflurane</td><td>Smiths Medical PM, Inc</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Phoenix Pharmaceutical</td><td>NDC : 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Seiler Precision Microscopes</td><td>SSI 202/402</td><td></td></tr><tr><td>Germinator-500 (stérilisateur d’outils)</td><td>Thomas Scientific</td><td>3885A20</td><td></td></tr><tr><td>Puralube (pommade pour les yeux)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel (#11)</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; 08-914B</td><td></td></tr><tr><td>Écarteur (Colibri)</td><td>Outils de science fine</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson roungeur</td><td>Outils de science fine</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vanna (Castroviejo) Roboz</td><td></td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus</td><td>Outils de science fine 11029-14</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à laminectomie (Dumont #2)</td><td>Outils de science fine</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Agrafeuse</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Agrafes (pinces pour blessures)</td><td>Reflex7</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles (30 G x &frac12 ;)</td><td>BD Biomedical</td><td>Seringue 305106</td><td></td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>BD Biomedical</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacine)</td><td>Bayer</td><td>NADA 140-913</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex (buprénorphine)</td><td>Cardinal Health</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr></tbody></table>

calibré forceps modèle de compression de la moelle épinière des blessures

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

blessures de compression de la moelle épinière de souris sont précieux modèles animaux pour l&#39;étude des lésions de la moelle épinière (SCI) et la thérapie régénérative moelle. Le modèle de pince calibrée de blessure de compression est une pratique, à faible coût, et de modèle animal très reproductible pour SCI. Nous avons utilisé une paire de pinces modifiés conformément à la méthode publiée par Plemel et al. (2008) pour comprimer latéralement la moelle épinière jusqu&#39;à une distance de 0,35 mm. Dans cette vidéo, nous allons démontrer une laminectomie dorsale pour exposer la moelle épinière, suivie d&#39;une compression de la moelle épinière avec la pince modifiés. Dans la vidéo, nous allons également aborder les questions liées aux soins des animaux de laboratoire paraplégiques. Ce modèle de lésion produit des souris qui présentent une insuffisance dans la sensation, ainsi que la fonction des membres postérieurs locomotrice réduite. En outre, ce procédé produit des aberrations de blessure cohérentes dans la pathologie de la SCI, comme déterminé par des procédés immunohistochimiques. Après avoir vu cette video, les téléspectateurs doivent être en mesure de déterminer les fournitures et les méthodes nécessaires à la production de diverses gravités SCI chez la souris pour les études sur SCI et / ou des traitements visant à atténuer la dépréciation après une blessure.

Nous avons effectué une laminectomie sur 12 des souris (25-30 grammes) tels que décrits ci-dessus, suivie par les compressions de la moelle épinière à 0,25 mm (n = 4), 0,35 mm (n = 4) et 0,55 mm (n = 4). Nous avons sacrifié les animaux à trois (n = 6) et sept (n = 6) jours après la lésion par perfusion intracardiaque. La moelle épinière a été retiré de la colonne vertébrale, et le tissu a été préparé et traité comme décrit ci-dessus. Images de l&#39;ensemble de la moelle épinière ont été prises avec un microscope numérique Leica EZ4 et des logiciels d&#39;accompagnement. Images des sections de la moelle épinière ont été prises à 2X agrandissement à l&#39;aide d&#39;un microscope numérique Olympus et le logiciel d&#39;accompagnement. Nous avons trouvé que la compression de la moelle épinière produit une blessure avec l&#39;épicentre à l&#39;endroit de la compression (figure 1). Les effets de la blessure se étendent plusieurs millimètres dans les directions rostrale et caudale. La gravité de la lésion augmente lorsque la distance entre les entretoises diminué (0,25 mm&gt; 0,35 mm&gt;0,55 mm, figure 2). Trois jours après la compression y avait du sang à l&#39;épicentre de la blessure et les régions environnantes qui ne était pas présent 7 jours après une blessure. Les 0,25 mm et 0,35 mm compressions produire une cavité, mais pas le modèle de 0,55 mm. Après 7 jours, la dorsale et ventrale substance blanche largement diminué en taille à l&#39;épicentre, l&#39;organisation gris affaire a été très déformé, et la cavitation était persistante. Ces altérations cytoarchitectonical sont convertis en moteur et modifications sensorielles dans le comportement des animaux évalués au moyen de tests appropriés tels que l&#39;Basso échelle de souris pour locomotrice Fonction et les cheveux et de chlorure d&#39;éthyle essais von Frey pour la fonction sensorielle que nous avons démontré dans les publications précédentes 8. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Des images représentatives de la moelle épinière intacte avant et afblessures ter. (A) de la moelle épinière intacte. (B) de la moelle épinière après compression 0,35 mm. Les flèches indiquent la frontière de blessure. Asterisk identifie également épicentre de blessures. D = Dorsale, L = latéral. Barre d&#39;échelle:. 0,50 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" width="650" /> Figure 2. Des images représentatives de moelle épinière de souris avant et après la blessure de compression à différentes largeurs de compression. (A) de la section sagittale du contrôle de la moelle épinière. (B) de la section coronale au épicentre d&#39;un 0,35 mm SCI 7 jours blessures poste de compression (dpi). (C, E, G) sections sagittales de la moelle épinière 3 dpi à une largeur de 0,25 , la moelle épinière ou 0,35 0,55 mm. (D, F, H) coupe sagittale de H &amp; E teintés 7 dpi pour une largeur de 0,25, 0,35 ou 0,55 mm. Asterisk identifie également épicentre de blessures. Toutes les sections colorées avec H &amp; E. D = Dorsale, L = latéral. Barre d&#39;échelle:. 1,25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les modèles de lésions de la moelle épinière doivent être hautement reproductibles. Nous démontrons que le modèle de compression par forceps calibré des lésions de la moelle épinière est une méthode chirurgicale facile à utiliser pour générer des lésions reproductibles de la moelle épinière murine.

Calibré Forceps modèle de compression de la moelle épinière des blessures

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de démontrer les étapes nécessaires pour induire une lésion de compression de la moelle épinière reproductible chez la souris à l'aide de forceps étalonnés. Cela est réalisé en retirant délicatement les couches cutanée et musculaire recouvrant la colonne vertébrale et en identifiant la vertèbre cible appropriée. Ensuite, une laminectomie est pratiquée sur les vertèbres ciblées afin d'exposer la moelle épinière, puis des forceps étalonnés sont utilisés pour provoquer la lésion de la moelle épinière.Les résultats illustrent l'ampleur des lésions au sein du tissu de la moelle épinière après une compression de la moelle épinière, en utilisant des techniques histochimiques. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés. Vous réalisez une procédure très délicate sur un petit animal, avec une marge d'erreur minime.Il s'agit d'un tissu sensible, et vous pourriez accidentellement provoquer une blessure plus grave que prévue ; il est donc conseillé de vous entraîner au préalable. Pour vous préparer à l'intervention chirurgicale, rassemblez les éléments suivants : instruments chirurgicaux et réactifs, pinces, ciseaux de type van, lames de scalpel URS, fils de rétraction, agrafes cutanées, cotons-tiges, solution saline stérile, compresses chirurgicales et isoflurane, utilisé en association avec un appareil d'anesthésie. Stérilisez les instruments au moyen d'un autoclave pour une seule intervention chirurgicale, et utilisez un stérilisateur d'instruments pour les désinfecter entre chaque intervention. Utilisez de l'alcool isopropylique à 70 % pour désinfecter le champ opératoire et mettez en place des champs opératoires afin de garantir le maintien d'un champ stérile pendant l'intervention.Après avoir pesé chaque souris avant la chirurgie, administrer une dose de 0,05 milligrammes par kilogramme de poids corporel de buprénorphine par voie sous-cutanée une fois l'animal anesthésié, selon le protocole indiqué dans le texte, appliquer un onguent sur les yeux pour prévenir la déshydratation et raser la surface dorsale de la souris sur environ un centimètre autour de l'emplacement prévu pour l'incision. Pour désinfecter le site d'incision, utiliser une solution d'iode suivie d'alcool isopropylique à 70 %. Répéter l'opération trois fois avant de commencer la chirurgie.Tout d'abord, effectuez une pression sur l'orteil ou sur la queue pour évaluer les réflexes. S'ils sont absents, utilisez un scalpel pour pratiquer une incision le long de la colonne dorsale, en coupant la peau.Insérez le rétracteur pour écarter la peau de la moelle épinière. Vérifiez à nouveau les réflexes. Ensuite, éliminez les tissus situés de chaque côté de la moelle épinière afin d'exposer les muscles recouvrant la colonne vertébrale ; cambrer le dos pour visualiser correctement des repères anatomiques tels que les limites entre les vertèbres.Les repères suivants doivent être visibles : l'angle inférieur de l'omoplate, qui correspond à T7, et le sommet de la courbure naturelle de la moelle épinière de la souris au niveau de T12, avec un éclairage adéquat. Déterminez l'espace entre les vertèbres.Ensuite, repérez l'extrémité postérieure de T10 et sectionnez suffisamment les muscles et le fascia perpendiculairement à l'espace disque intervertébral pour exposer l'apophyse épineuse et la lame postérieure de T10 à l'aide d'une pince fine de type Dumont numéro cinq. Retirez une partie des tissus recouvrant la lame et l'apophyse épineuse afin de mettre à nu une petite portion de la moelle épinière. Si nécessaire, utilisez une pince à tissus pour stabiliser la colonne vertébrale.Ensuite, réalisez la laminectomie en insérant un côté d'une paire de ciseaux VNA de petite taille le long du côté latéral dorsal de la vertèbre, juste sous la lame. Effectuez ensuite de petites incisions précises pour couper le côté latéral gauche de la lame vertébrale. Répétez l'opération de l'autre côté.S'assurer qu'aucune pression n'est appliquée sur la moelle épinière avec un coton-tige ou une compresse chirurgicale. Exercer une pression douce pour arrêter les saignements si nécessaire. Prendre soin de ne pas exercer de pression sur la moelle épinière.Une fois les incisions effectuées, soulevez la partie dorsale de la vertèbre et retirez délicatement toutes les attaches tissulaires. Utilisez des moyens appropriés pour contrôler les saignements si nécessaire. À l’aide de pinces adéquates ou de pinces à laminectomie, assurez-vous que les côtés latéraux de la moelle épinière soient dégagés de l’os vertébral afin que les pinces calibrées pour la lésion par compression puissent être correctement positionnées de chaque côté de la moelle épinière.Placez maintenant la pince Dumont étalonnée n°5 approximativement au milieu du segment exposé de la moelle épinière, les branches de la pince se situant dans l'espace épidural et les pointes touchant le plancher du canal vertébral. Compressez soigneusement la moelle épinière jusqu'à ce que les entretoises se mettent en place, puis maintenez cette position pendant 15 secondes.Ensuite, relâchez doucement la force compressive et retirez la pince calibrée de la moelle épinière. Appliquez du sérum physiologique stérile pour rétablir l'homéostasie et suturer soigneusement la couche musculaire au-dessus de la moelle épinière, en prenant soin de ne pas perturber ni exercer de pression sur celle-ci.Utilisez soit des sutures, soit des agrafes pour fermer la peau au-dessus de la plaie. Administrez un millilitre de solution de Ringer lactaté par 10 grammes de poids corporel pour aider à lutter contre la déshydratation. Avant de placer la souris dans une cage sans litière sur un tapis chauffant réglé à environ 37 degrés Celsius.Dans un environnement calme, surveillez attentivement l'animal jusqu'à ce qu'il reprenne connaissance. Ensuite, transférez-le dans une cage ordinaire avec de la litière pour les trois premiers jours suivant la chirurgie, administrez une dose de 0,05 milligrammes par kilogramme de poids corporel de buprénorphine par voie sous-cutanée toutes les 12 heures, puis selon les besoins pour soulager les symptômes de douleur deux fois par jour. Utilisez la manœuvre prescrite pour exprimer manuellement la vessie de l'animal en palpant doucement l'abdomen de l'animal afin de localiser la vessie et en appliquant une pression douce vers le bas jusqu'à ce que la vessie soit vide.En raison de la mobilité réduite de l'animal juste après la chirurgie, prenez les mesures nécessaires pour lui permettre d'accéder à la nourriture et à l'eau en fournissant de la nourriture humide et de l'hydrogel. Reportez-vous au protocole écrit pour évaluer les lésions tissulaires après laminectomie et compressions de la moelle épinière au point à 25 millimètres. Les points à 35 millimètres ou à 55 millimètres ont été réalisés sur 12 souris, qui ont été sacrifiées à trois ou sept jours post-lésion par perfusion intracardiaque, comme indiqué ici.La compression de la moelle épinière provoque des lésions dont l'épicentre se situe au niveau de la compression, et les effets de la lésion s'étendent sur plusieurs millimètres dans les directions rostrale et caudale. Cette figure montre que la gravité des lésions augmente lorsque la distance entre les entretoises diminue. Par exemple, les compressions de 25 millimètres et de 35 millimètres ont produit une cavité qui n'était pas observée dans le modèle de 55 millimètres ; trois jours après la compression, du sang était présent à l'épicentre de la lésion ainsi que dans les régions environnantes, mais il n'était plus détectable sept jours après la lésion. Au bout de sept jours, la substance blanche dorsale et ventrale avait fortement diminué en taille à l'épicentre.L'organisation de la substance grise était fortement altérée et la cavitation persistante, comme cela avait été démontré précédemment ; l'architectonique cyto prédispose à des troubles moteurs et sensoriels dans le comportement animal, évalués à l'aide de l'échelle de locomotion besso pour la fonction motrice, ainsi que des tests au poil von Frey et au chlorure d'éthyle pour la fonction sensorielle. Après cette procédure, vous pouvez réaliser d'autres méthodes, telles que la transplantation directe de cellules ou l'injection d'autres réactifs thérapeutiques dans la moelle épinière, afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si une thérapie particulière peut améliorer le pronostic après une lésion médullaire.

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