Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà

L’objectif global de l’expérience suivante est d’effectuer une pince dynamique in vitro dans les neurones corticaux à l’aide de la boîte à outils logicielle LCG disponible gratuitement. Ceci est réalisé en préparant des tranches de cortex somatosensoriel de rat pour des enregistrements de patch clamp à partir des cellules paramétalliques. Dans un deuxième temps, une série de protocoles électrophysiologiques automatisés est appliquée à la cellule enregistrée, ce qui fournit une caractérisation standard de la cellule qui sera utile pour les analyses et les comparaisons ultérieures entre les types de cellules.

Ensuite, l’injection d’événements synaptiques excitateurs et inhibiteurs est simulée. Afin de recréer l’état de conductivité élevée vécu par les neurones néocorticaux in vivo, les résultats montrent comment l’injection synaptique de fond module le gain des cellules corticales. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est la possibilité d’intégrer des enregistrements expérimentaux dans des flux de travail plus complexes en utilisant, par exemple, le résultat d’un protocole expérimental comme entrée d’un autre protocole.

Cette méthode peut aider à normaliser les protocoles électrophysiologiques, accélérer l’analyse des données et ouvrir la voie au partage des données entre les laboratoires. Bien que cette méthode ait été développée à l’origine pour les enregistrements CLA in vitro en gros, elle peut également être utilisée pour d’autres préparations et protocoles expérimentaux, tels que les enregistrements in vivo, les enregistrements CLA ou les enregistrements d’accélérateur avec micro pour arrays the race. Après avoir extrait le cerveau du rat, jetez le cervelet et séparez les deux hémisphères le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel, retirez l’excès de liquide de l’un des hémisphères et collez-le sur une plate-forme inclinée avec une goutte de super colle.

Ensuite, ajoutez rapidement quelques gouttes d’un LCR sur le cerveau et transférez-le dans la chambre Vibram. Retirez les premiers 2,5 à trois millimètres du tissu cérébral à l’aide d’une lame. Ensuite, ajustez la vitesse et la fréquence de tranchage afin de limiter les dommages à la surface de la tranche.

Ensuite, réglez l’épaisseur sur 300 micromètres et commencez à trancher. Une fois que la lame a dépassé le cortex, utilisez une lame de rasoir ou une aiguille pliée pour faire une coupe au-dessus de l’hippocampe et sur les bords de la zone corticale d’intérêt. Après cela, transférez les tranches dans une chambre d’incubation à plusieurs puits à 36 degrés Celsius.

Dans cette procédure, placez une tranche dans la chambre d’enregistrement avec la lentille de grossissement 40x. Recherchez des cellules saines dans la couche cinq et de 600 à 1000 micromètres. Sous la surface du cerveau, ces cellules ont généralement un contraste plus faible, un aspect lisse et ne sont pas enflées.

Une fois qu’une cellule saine est trouvée, chargez un tiers de la micro-pipette avec une solution intracellulaire. Ensuite, placez-le dans l’étage principal du système d’exploitation Linux préconfiguré. Lancez une commande.

Shell ajoute son invite. Tapez cette commande pour vous assurer que la carte d’acquisition de données ne pilote pas l’amplificateur. Appliquez ensuite 30 à 50 millibars de pression positive en appuyant sur le piston de la seringue, qui est relié au porte-pipette.

Ensuite, placez la pipette à environ 100 micromètres au-dessus de la tranche et déplacez la pipette vers la cellule cible en utilisant le mode d’approche du manipulateur micrométrique. Après cela, ajustez le décalage de la pipette sur l’amplificateur d’électrophysiologie et émettez une impulsion de test de 10 millivolts en mode pince de tension. À l’aide de la commande LCG SEAL, testez pour surveiller la résistance de la pipette, puis réduisez la pression à 10 à 30 millibars en retirant le piston de la seringue.

Approchez-vous doucement de la cellule et vérifiez la formation d’une fossette en observant l’image sur le moniteur de la caméra vidéo. Dans le même temps, surveillez une augmentation de la résistance évoquée par l’impulsion de test en regardant la forme d’onde actuelle affichée sur le moniteur. Lorsqu’il y a une augmentation de la résistance de la pipette et la formation d’une fossette sur la cellule, relâchez immédiatement la pression et appliquez une légère pression négative sur la pipette pour aider à la formation du joint.

Entre-temps, diminuez progressivement le potentiel de maintien à moins 70 millivolts. Appliquez une aspiration douce pour rompre la membrane cellulaire et établir la configuration complète de la cellule. Caractérisez ensuite la cellule en termes de propriétés électriques.

À l’aide de la commande LCGE code. Voici le potentiel d’action moyen d’un neurone paramétallique de couche cinq patché avec un seuil de moins 50,5 millivolts. Cette figure montre la mesure des réponses passives aux courants hyperpolarisants.

L’identification des propriétés actives de base de la cellule révèle que la cellule est un neurone à pointes régulières, et qu’il y a une adaptation minimale pour injecter un changement de potentiel excitateur post-synaptique simulé dans le répertoire où l’expérience suivante sera sauvegardée en tapant cette commande à l’invite de commande de la coquille. Au lieu d’agir sur les commandes matérielles conventionnelles de l’amplificateur. Pour appliquer l’équilibrage du pont et la compensation de capacité, estimez le noyau d’électrode nécessaire pour effectuer la compensation de l’électrode active en exécutant cette commande.

Le noyau complet est la somme de deux composants, un noyau d’électrode rapide et un noyau membranaire plus lent qui donne lieu à la queue exponentielle observée dans le noyau complet. Le premier constitue un modèle non paramétrique de la pipette Lors de l’injection de courant pour séparer les noyaux de membrane et d’électrode, la commande LCG kernel demandera à l’utilisateur le nombre de points qui composent le noyau d’électrode rapide. Ensuite, sélectionnez un nombre pour que le noyau de l’électrode recouvre l’extrémité de la queue de décroissance exponentielle.

Effectuez ensuite l’expérience de serrage dynamique à l’aide de cette commande. Enfin, visualisez les résultats. Voici la recréation d’une activité in vivo à l’aide d’une pince dynamique.

Les traces rouges et bleues représentent respectivement la simulation des synapses excitatrices et inhibitrices. Et voici les traces de tension enregistrées à partir d’un neurone paramétallique L cinq, qui a été soumis à un bombardement de courants post-synaptiques excitateurs ou inhibiteurs. Le courant excitant, inhibiteur et total correspondant injecté dans la cellule est indiqué dans le tableau.

Le tracé matriciel des pointes générées à travers 20 essais montre que le neurone peut être extrêmement fiable et précis en réponse à la même entrée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de lampe dynamique à l’aide de la boîte à outils logicielle disponible gratuitement. LCG. Cette procédure peut être étendue à d’autres protocoles en boucle fermée pour étudier une grande variété de sujets allant de l’excitabilité neuronale aux interactions complexes en réseau.