Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser un clampage dynamique in vitro sur des neurones corticaux à l'aide de la boîte à outils logicielle librement disponible, LCG. Cette procédure s'effectue en préparant des tranches de cortex somatosensoriel de rat destinées à des enregistrements par électrode à patch sur les cellules paramétales. Dans un deuxième temps, une série de protocoles électrophysiologiques automatisés est appliquée à la cellule enregistrée, permettant une caractérisation standardisée de la cellule, utile pour les analyses ultérieures et les comparaisons entre types cellulaires.

Ensuite, l'injection d'événements synaptiques excitateurs et inhibiteurs est simulée. Afin de recréer l'état de haute conductance subi par les neurones néocorticaux in vivo, les résultats montrent comment l'injection synaptique de fond module le gain des cellules corticales. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la possibilité d'intégrer des enregistrements expérimentaux dans des protocoles plus complexes, par exemple en utilisant le résultat d'un protocole expérimental comme entrée pour un autre protocole.

Cette méthode peut aider à standardiser les protocoles électrophysiologiques, accélérer l'analyse des données et ouvrir la voie au partage de données entre laboratoires. Bien que cette méthode ait été initialement développée pour les enregistrements de type patch CLA en conditions in vitro, elle peut également être utilisée aisément pour d'autres préparations expérimentales et protocoles, tels que les enregistrements patch in vivo, les enregistrements CLA ou les enregistrements accélérés avec des microélectrodes en réseaux. Après avoir extrait le cerveau de rat, éliminer le cervelet et séparer les deux hémisphères le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel, retirer le liquide excédentaire d’un des hémisphères et le fixer sur une plateforme inclinée à l’aide d’une goutte de colle cyanoacrylate.

Ensuite, ajoutez rapidement quelques gouttes de LCR au-dessus du cerveau et transférez-le dans la chambre Vibram. Retirez les 2,5 à 3 millimètres initiaux du tissu cérébral à l’aide d’une lame. Par la suite, ajustez la vitesse et la fréquence de découpe afin de limiter les dommages à la surface de la tranche.

Ensuite, réglez l'épaisseur sur 300 micromètres et commencez la sectionnement. Une fois que la lame est passée au-delà du cortex, utilisez une lame de rasoir ou une aiguille courbée pour effectuer une incision au-dessus de l'hippocampe et aux bords de la région corticale d'intérêt. Par la suite, transférez les tranches dans une chambre d'incubation multi-puits à 36 degrés Celsius.

Dans cette procédure, placez une tranche dans la chambre d'enregistrement avec l'objectif de 40 x. Recherchez des cellules saines dans la couche V, à une profondeur de 600 à 1000 micromètres sous la surface du cerveau. Ces cellules présentent généralement un contraste plus faible, un aspect lisse et ne sont pas gonflées.

Une fois qu'une cellule saine est trouvée, chargez un tiers de la micropipette avec la solution intracellulaire. Ensuite, placez-la dans le support de tête sur le système d'exploitation Linux préconfiguré. Lancez une commande.

Le shell ajoutera son invite. Saisissez cette commande pour vous assurer que la carte d'acquisition de données n'active pas l'amplificateur. Ensuite, appliquez une pression positive de 30 à 50 millibars en appuyant sur le piston de la seringue, qui est reliée au porte-pipette.

Ensuite, placez la pipette à environ 100 micromètres au-dessus de la coupe et déplacez la pipette vers la cellule cible à l’aide du mode d’approche du micromanipulateur. Ajustez ensuite le décalage de la pipette sur l’amplificateur d’électrophysiologie et appliquez une impulsion témoin de 10 millivolts en mode de blocage de tension. Utilisez la commande LCG SEAL test pour surveiller la résistance de la pipette, puis réduisez la pression à 10 à 30 millibars en retirant le piston de la seringue.

Approchez-vous délicatement de la cellule et vérifiez la formation d'un affaissement en observant l'image sur l'écran du moniteur de la caméra vidéo. En même temps, surveillez l'augmentation de la résistance provoquée par l'impulsion de test en regardant la forme d'onde du courant affichée sur le moniteur. Lorsqu'une augmentation de la résistance de la pipette et la formation d'un affaissement sur la cellule sont observées, relâchez immédiatement la pression et appliquez une pression négative douce sur la pipette pour favoriser la formation du scellement.

Entre-temps, réduisez progressivement le potentiel de maintien à moins 70 millivolts. Appliquez une aspiration douce pour rompre la membrane cellulaire et établir la configuration en mode whole cell. Puis caractérisez la cellule en fonction de ses propriétés électriques.

À l'aide de la commande LCGE. Voici le potentiel d'action moyen d'un neurone paramétal de la couche cinq enregistré avec un seuil de -50,5 millivolts. Cette figure montre la mesure des réponses passives aux courants hyperpolarisants.

L'identification des propriétés actives de base de la cellule révèle que la cellule est un neurone à décharge régulière, et qu'il existe une adaptation minimale à l'injection de potentiels postsynaptiques excitateurs simulés. Passez au répertoire où sera enregistrée l'expérience suivante en tapant cette commande dans l'invite de commande du shell, au lieu d'agir sur les commandes matérielles classiques de l'amplificateur. Pour appliquer l'équilibrage de la pont et la compensation de la capacité, estimez le noyau de l'électrode nécessaire pour effectuer la compensation active de l'électrode en exécutant cette commande.

Le noyau complet est la somme de deux composantes : un noyau d'électrode rapide et un noyau membranaire plus lent, qui donne lieu à la queue exponentielle observée dans le noyau complet. La première constitue un modèle non paramétrique de la pipette. Lors de l'injection de courant permettant de séparer les noyaux membranaire et d'électrode, la commande du noyau LCG invitera l'utilisateur à indiquer le nombre de points composant le noyau d'électrode rapide. Ensuite, sélectionnez un nombre tel que le noyau d'électrode couvre la fin de la queue de décroissance exponentielle.

Ensuite, réalisez l'expérience de clampage dynamique en utilisant cette commande. Enfin, visualisez les résultats. Voici la reproduction d'une activité semblable à celle in vivo à l'aide du clampage dynamique.

Les tracés rouges et bleus représentent respectivement la simulation de synapses excitatrices et inhibitrices. Voici les tracés de tension enregistrés à partir d’un neurone paramétal L5 soumis à un bombardement de courants post-synaptiques excitateurs ou inhibiteurs. Les courants injectés correspondants, excitateur, inhibiteur et total, sont affichés sur le graphique.

Le graphique raster des potentiels d'action enregistrés au cours de 20 essais montre que le neurone peut être extrêmement fiable et précis en réponse au même stimulus. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des expériences de lampe dynamique à l'aide de la boîte à outils logicielle LCG, disponible gratuitement. Cette procédure peut être étendue à d'autres protocoles en boucle fermée afin d'étudier une grande variété de sujets, allant de l'excitabilité neuronale aux interactions complexes au sein des réseaux.