Name: Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez la technique de dynamic clamp in vitro sur neurones corticaux en utilisant la boîte à outils logicielle LCG. Cette méthode automatise les protocoles électrophysiologiques pour caractériser les cellules pyramidales du cortex somatosensoriel du rat et simuler des événements synaptiques excitateurs et inhibiteurs.

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Soutien financier de la Fondation flamande pour la recherche FWO (contrat n° 12C9112N à DL), du 7e programme-cadre de la Commission européenne (réseau Marie Curie « C7 », contrat n° 238214 ; ICT Future Emerging Technology « ENLIGHTENMENT », contrat n° 306502), le Programme Interuniversitaire des Pôles d’Attraction initié par la Politique scientifique belge (contrat n° IUAP-VII/20) et l’Université d’Anvers.

Le protocole décrit ici est conforme aux recommandations et directives du Comité d&#39;éthique du département de sciences biomédicales de l&#39;Université d&#39;Anvers. Ce protocole nécessite la préparation d&#39;un matériau non-sensible du cerveau de rats Wistar explantée mineurs, obtenu par des techniques d&#39;euthanasie approuvées. 1. Préparation Equipement <ol><li> Installer et configurer l&#39;acquisition de données et système de stimulation. <ol><li> Utilisation d&#39;un ordinateur personnel (PC) équipé d&#39;une carte d&#39;acquisition de données (DAQ) supporté par Comedi pour enregistrer et envoyer les signaux des tensions de commande analogiques à l&#39;amplificateur électrophysiologique. NOTE: Comedi est un module Linux et la bibliothèque qui prend en charge une multitude de cartes DAQ de fabricants les plus communs: visiter http://www.comedi.org pour plus d&#39;informations. </li><li> Dans le cas où un amplificateur patch clamp contrôlé par ordinateur est en cours d&#39;utilisation, employer un deuxième PC en plus de celle dédiée à l&#39;amplificateurcontrôle. REMARQUE: Alors que ce dernier peut exécuter un système d&#39;exploitation classique, le PC supplémentaire sera d&#39;exploitation en temps réel au moyen d&#39;un système d&#39;exploitation particulier. Dans ces conditions, il est commode d&#39;utiliser un seul moniteur, une souris et clavier connecté au PC supplémentaire, lors de la connexion par une application de bureau à distance à l&#39;ordinateur dédié. </li><li> Télécharger l&#39;image ISO du Live CD contenant un système d&#39;exploitation Linux en temps réel avec LCG préinstallés par http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso et le graver sur un CD ou USB vierge bâton &quot; . </li><li> Il suffit d&#39;insérer le CD dans le lecteur de l&#39;ordinateur contenant la carte DAQ et démarrer. Autrement, installez LCG de son référentiel de source en ligne sur un PC exécutant le système d&#39;exploitation Linux (par exemple, Debian ou Ubuntu). Consultez le manuel en ligne pour plus de détails sur la procédure d&#39;installation. Le manuel est disponible en ligne à http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf. </li><li> Amorçage à partir du CD live: this chargera automatiquement un système entièrement configuré. Pour ce faire, placez le LCG Live CD dans le lecteur de CD-ROM de votre ordinateur et de démarrer l&#39;ordinateur à partir du CD; sélectionnez le noyau temps réel (option par défaut) dès que le menu de démarrage apparaît et attendez que le système pour initialiser. </li><li> Calibrer la carte DAQ en tapant à l&#39;invite de commande: sudo comedi_calibrate ou sudo comedi_soft_calibrate selon que le conseil d&#39;acquisition de données prend en charge matériel ou logiciel d&#39;étalonnage, respectivement (utiliser la commande sudo comedi_board_info pour obtenir des informations sur la carte). </li><li> Réglez le convertisseur analogique-numérique et numérique-analogique facteurs de conversion approprié: cela nécessite d&#39;avoir accès au manuel de l&#39;amplificateur électrophysiologique cellulaire, et en particulier à ses caractéristiques sur ses facteurs de conversion. </li><li> Utilisez un éditeur de texte pour spécifier les valeurs numériques appropriées dans le fichier /home/user/.lcg-env, pour les variables d&#39;environnement AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOTE: Ils représentent l&#39;entrée (AI) et de sortie (AO) des gains pour pince de courant (CC) et la pince de tension (VC) des modes, et les facteurs de conversion entre les commandes de tension fournies par l&#39;ordinateur et le courant ou des tensions générées par l&#39;amplificateur respectivement. </li><li> Vous pouvez également utiliser le script fourni (LCG-find-conversion-facteurs LCG), de trouver les facteurs de conversion de son système. REMARQUE: Les valeurs calculées par lcg-trouver-conversion-facteurs sont des suppositions, qui dans certains cas sont nécessaires pour être numériquement tronqués ou arrondis pour refléter les valeurs exactes des facteurs de conversion. </li><li> Pour utiliser lcg-trouver-conversion-facteurs, de commencer par connecter la &quot;cellule modèle» qui est souvent achetée avec l&#39;amplificateur à la headstage correspondante. Ensuite, ouvrez un terminal sur la machine Linux sur lequel vous exécutez le Live CD et entrez la commande suivante à l&#39;invite du shell: lcconversion facteurs g-trouver--i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOTE: Dans les deux cas (ie, modification manuelle de /home/user/.lcg-env ou l&#39;utilisation de LCG-trouver-conversion-facteurs), fermer et ouvrir le terminal pour que les modifications prennent effet. </li><li> Si plusieurs headstages sont utilisés, définir les facteurs de conversion aux mêmes valeurs dans tous les canaux; si cela est impossible, consultez le manuel en ligne LCG à comprendre comment utiliser de multiples facteurs de conversion dans lcg-relance ou comment produire des fichiers de configuration qui mieux adaptés aux besoins de l&#39;utilisateur. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des tranches aiguë du cerveau cortex somatosensoriel <ol><li> Préparation des solutions pour l&#39;électrophysiologie. <ol><li> Préparation liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) en mélangeant (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26, glucose 25, CaCl2 2, MgCl2 et 1. Préparer 10x actions des solutions pour réduire lale temps de préparation, le jour de l&#39;expérience. Préparer 2 L, dont une sera utilisé pour la préparation des tranches et l&#39;autre pour l&#39;enregistrement. </li><li> Saturer la ACSF avec 95% O 2 et 5% de CO 2 pendant au moins 30 min avant le début de la procédure. </li><li> Pour les enregistrements en cours de serrage, utiliser une solution intracellulaire (ICS) contenant (en mM) 115 K-gluconate, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Préparer la solution dans de la glace et le filtrer avant le début des enregistrements pour éliminer le risque de colmatage de la pipette. </li></ol></li><li> l&#39;extraction du cerveau. <ol><li> Anesthésier l&#39;animal placer l&#39;animal dans une chambre d&#39;induction avec 4% d&#39;isoflurane et décapite rapidement à l&#39;aide d&#39;une guillotine ou grands ciseaux. </li><li> Couper la peau le long de la ligne médiane et faites-le glisser à l&#39;oreille. </li><li> Utilisation d&#39;une belle paire de ciseaux couper le crâne le long de la ligne médiane. Gardez la lame aussi près que possible de the surface de manière à minimiser les dommages au cerveau sous-jacent. Ouvrez le crâne avec une paire de pinces, utiliser une spatule pour couper le nerf optique et le tronc cérébral et doucement tomber le cerveau glacée ACSF. </li><li> Séparer le cervelet et les deux demi-sphères avec un scalpel (lame 24). </li><li> Retirer l&#39;excès d&#39;eau de l&#39;un des deux hémisphères et le coller sur une plate-forme inclinée en utilisant une goutte de colle. Rapidement ajouter quelques gouttes de l&#39;ACSF sur le cerveau et le transférer à la chambre de vibratome. NOTE: Lors de la préparation des tranches sagittal, l&#39;angle de la plate-forme est important pour éviter d&#39;endommager les dendrites des cellules pyramidales pendant la procédure de tranchage. </li></ol></li><li> Préparation des tranches. <ol><li> Placez la lame sur le cerveau et jeter les premiers 2,5 - 3 mm. Régler la vitesse et la fréquence de limiter les dommages à la surface de la tranche, tout en minimisant en même temps le temps nécessaire à la procédure de coupe. </li><li> Réglez l&#39;épaisseur de 300 μm et commencer à trancher. Une fois que la lame a dépassé le cortex, utiliser une lame de rasoir ou une aiguille recourbée à couper au-dessus de l&#39;hippocampe et sur les bords de la zone corticale d&#39;intérêt. </li><li> Placez les tranches dans une chambre d&#39;incubation multi-puits maintenus à 32-34 ° C. </li><li> Rétracter la lame et répétez les points 2.3.2 et 2.3.3 jusqu&#39;à 5 - 8 tranches sont coupées. Les meilleures tranches sont généralement ceux où les vaisseaux sanguins sont parallèles à la surface. </li><li> Incuber les tranches de 30 minutes après la dernière tranche est placée dans la chambre. </li></ol></li></ol> 3. patch-clamp enregistrements à partir de la couche 5 pyramidaux Neurones <ol><li> Placer une tranche dans la chambre d&#39;enregistrement et de recherche pour les cellules saines. Ces cellules ont généralement un contraste plus faible, un aspect lisse et ne sont pas gonflées. </li><li> Vérifier la tranche au microscope avec un grossissement de la lentille de 40X et recherche de cellules dans la couche 5, située à environ 600 à 1 000 um de la surface du cerveau. </li&gt; <li> Une fois qu&#39;une cellule est trouvée, la charge d&#39;un tiers de la micropipette avec ICS et placez-le dans le headstage. </li><li> Sur l&#39;ordinateur personnel utilisant le live CD ou le système pré-configuré exploitation Linux, lancer un shell de commande (par exemple, bash) et à son invite, tapez la commande lcg-zéro. Cela garantit que la carte DAQ ne conduit pas l&#39;amplificateur. </li><li> Appliquer 30 - 50 mbar de pression positive en appuyant sur le piston d&#39;une seringue commun, connecté par un tube sur le porte-pipette et, avec l&#39;aide du microscope, placer la pipette au-dessus d&#39;environ 100 um de la tranche. NOTE: Placez la pipette dans une position qui permet un accès direct à la cellule cible, de préférence en utilisant le mode de la micromanipulateur d&#39;approche. </li><li> Agissant sur les commandes de l&#39;amplificateur d&#39;électrophysiologie, ajuster le décalage de pipette et la sortie une impulsion de test (10 mV) en mode tension de serrage. </li><li> Réduire la pression de 10 - 30 mbar (en fonction de la taille de la pipette) en retirant lepiston de la seringue; approcher doucement la cellule et vérifier pour la formation d&#39;une fossette en observant l&#39;image sur l&#39;écran de la caméra vidéo. Surveiller l&#39;impulsion de test pour une augmentation de la résistance en tout temps, en regardant la forme du courant affiché sur l&#39;oscilloscope relié à l&#39;amplificateur d&#39;électrophysiologie (vous pouvez aussi utiliser le lcg-joint-test de commande pour contrôler la résistance de la pipette). </li><li> Relâchez la pression et si nécessaire, appliquer une pression négative douce à la pipette pour aider à la formation de joint lorsque vous remarquez une augmentation de la résistance à la pipette et la formation d&#39;une «fossette» sur la cellule. </li><li> Alors que les formes de phoques, de diminuer progressivement le potentiel de maintien de -70 mV. </li><li> Une fois que le joint d&#39;gigaohm a été obtenue, en sorte que le courant de maintien est compris entre 0 à 30 pA. Appliquer de courtes impulsions de pression négative (aspiration) pour rompre la membrane et établir la configuration de cellule entière. Alternativement, vous pouvez injecter des impulsions fortes et brèves de tension ( <em&gt;-à-dire, en utilisant la commande «ZAP» sur l&#39;amplificateur ou le maintien des cellules à très négatif) à la rupture de la membrane, en fonction de la préparation et la pipette en verre utilisé. </li><li> Passer en mode pince de courant et vérifiez que le potentiel de membrane de repos est typique d&#39;une cellule saine. Pour les neurones pyramidaux du cortex utilisant une solution à base de gluconate de potassium, cette valeur est généralement comprise entre -65 et -75 mV. </li></ol> 4. Caractérisation semi-automatique des propriétés de réponse électrique d&#39;un neurone <ol><li> Créez un répertoire pour stocker les données de l&#39;utilisateur. Pour ce faire, l&#39;emploi d&#39;un script inclus dans le LCG CD live qui crée des dossiers basés sur la date. Pour l&#39;utiliser, tapez à l&#39;invite de commande cd ~ / expériences lcg-créer-expérience-dossier -s psp, in_vivo_like Cela va créer un dossier où les données de cette cellule seront sauvegardés (et un «psp» et «in_vivo_like &#39;sous-dossiers) et il va imprimer son nom à la bornela fenêtre; il est également possible de stocker des informations supplémentaires telles que la résistance à la pipette et le type de cellule à l&#39;aide de ce script. </li><li> Changer répertoire pour le dossier nouvellement créé en utilisant la commande cd ~ / &lt;nom_dossier&gt; Le nom du dossier est celui affiché par la commande lcg-créer-expérience-dossier et aura l&#39;horodatage de la journée en cours (ie, l&#39;année-mois-jour), comme dans 20140331A01. </li><li> Assurez-vous que l&#39;amplificateur est réglé pour fonctionner en mode pince de courant, que les câbles sont connectés et la commande de tension externe de l&#39;amplificateur, si elle est présente, est activée. </li><li> Entrez la commande lcg-ecodeat l&#39;invite de commande. Cela appelle une série de commandes (à savoir lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampe, lcg-tau et LCG-étapes), utilisé pour caractériser les propriétés de réponse de base de la cellule. lcg-ecode exige que l&#39;utilisateur de spécifier deux paramètres: l&#39;amplitude du 1 ms long impulsion de courant utilisé pour susciter un seul pic dans la cellule, et l&#39;amplitude maximale de la RAM actuellep injecté dans la cellule à trouver son rhéobase. Utilisez la syntaxe de commande suivante: lcg-ecode --pulse amplitude X --ramp amplitude Y avec un choix des valeurs X et Y (en Pa) qui sont suffisantes pour rendre le feu de la cellule en réponse à une ms-1 et une longue impulsion d&#39;injection de courant continu, respectivement. NOTE: Ces protocoles nécessitent d&#39;effectuer l&#39;estimation numérique de le «noyau de l&#39;électrode» afin d&#39;utiliser la rémunération électrode active (AEC) 15. Une injection de courant bruyante est utilisée pour estimer le noyau et l&#39;utilisateur est invité à confirmer le nombre d&#39;échantillons qui composent le noyau. Voir 15 pour des informations détaillées sur la signification du noyau de l&#39;électrode et la façon de choisir le nombre d&#39;échantillons du noyau. </li></ol> 5. Injection de la conductance à travers simulées Synapses et Simulation de In Vivo -comme l&#39;activité de fond <ol><li> Injection des potentiels post-synaptiques excitateurs simulées <ol><li>Passez dans le répertoire où vous allez économiser l&#39;expérience suivante, en tapant la commande suivante à l&#39;invite de commande de la coque: cd psp / 01 </li><li> Copier un fichier de configuration LCG dans le répertoire courant et l&#39;ouvrir avec un éditeur de texte (Nano dans cet exemple) en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coquille (ce fichier de configuration exemple est inclus dans le code source et le live cd) : cp ~ / / src / lcg / configurations / epsp.xml locale nano epsp.xml NOTE: Ceci est tout simplement un fichier texte avec différentes entités connectées les unes aux autres. Pour plus de détails, voir la section des résultats représentatifs. </li><li> Si nécessaire modifier l&#39;inputChannel, outputChannel, l&#39;inputConversionFactor et outputConversionFactor dans ce fichier pour correspondre à la configuration de l&#39;utilisateur. </li><li> Calculer le noyau de l&#39;électrode nécessaire pour effectuer la compensation de l&#39;électrode active »la méthode utilisée par LCG pour effectuer seule électrode pince dynamique» en lançant la command lcg-kernel Cela incitera pour le nombre de points dans le noyau. Encore une fois, sélectionnez un nombre pour que le noyau de l&#39;électrode couvre la fin de la décroissance exponentielle queue. </li><li> Effectuer l&#39;expérience de serrage dynamique en utilisant la commande lcg-expérimenter epsp.xml -c </li><li> Dressez la liste des fichiers et de visualiser les résultats en utilisant la commande ls -l lcg-plot--f fichier dernière </li></ol></li><li> Injection des potentiels post-synaptiques inhibitrices simulées <ol><li> Créez un dossier et copiez le fichier de epsp.xml à elle en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coque: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Editez le fichier de configuration en utilisant un éditeur de texte: changer le potentiel d&#39;inversion synaptique et temps de montée et de déclin des constantes de la Exp2Synapse modèle de synapse à ce qui suit: paramètres&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8E-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;paramètres&gt; Quittez l&#39;éditeur de texte. </li><li> Calculer le noyau de l&#39;électrode et réaliser l&#39;expérience comme dans 5.1, en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coque: lcg-kernel lcg-expérimenter ipsp.xml -c </li><li> Dressez la liste des fichiers et de visualiser les résultats, en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coque: ls -l lcg-plot-fichier -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulation d&#39;vivo -comme activité de fond: <ol><li> Passez dans le répertoire où vous souhaitez enregistrer l&#39;expérience suivante, comme précédemment indiqué, en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coque: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Copiez le fichier de configuration du répertoire source LCG, en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coque: cp ~ / / src / lcg / configurations / in_vivo_like.xml locale nano in_vivo_like.xml <br /&gt; NOTE: Ce fichier est tout simplement la concaténation des précédents; deux processus de Poisson points qui génèrent des trains de potentiels, qui à son tour se nourrissent synapses modèles excitateurs et inhibiteurs, génèrent l&#39;activité de fond. </li><li> Ajustez les paramètres de configuration DAQ pour la configuration de l&#39;utilisateur, comme décrit au paragraphe 5.1.3 et quittez l&#39;éditeur. </li><li> Calculer le noyau de l&#39;électrode et réaliser l&#39;expérience comme dans 5.1, en tapant les commandes suivantes à l&#39;invite de commande de la coque: lcg-kernel lcg-expérimenter in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3 Les interrupteurs «-n 10» et «-i 3» indiquent que la stimulation doit être répété 10 fois à des intervalles de trois secondes. </li><li> Visualisez les traces premières à l&#39;aide de la commande suivante à l&#39;invite de commande de la coque: lcg-plot--f fichier tout </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce texte, un protocole complet pour la mise en œuvre en temps réel, en boucle fermée monocellulaires expériences électrophysiologiques ont été décrits, en utilisant la technique du patch clamp et une boîte à outils du logiciel développé récemment appelé LCG. Pour optimiser la qualité des enregistrements, il est crucial que la configuration de l&#39;enregistrement soit correctement mise à la terre, à l&#39;abri et sans vibration: ce qui garantit l&#39;accès à cellules entières stable et durable à la cellule, qui, av...

<html> Au cours des dernières années, l&#39;électrophysiologie cellulaire a évolué à partir du paradigme en boucle ouverte traditionnelle utilisée dans les expériences de tension et de serrage courant des protocoles en boucle fermée modernes. La technique en boucle fermée le plus connu est peut-être la pince dynamique 6,7, qui a permis l&#39;injection synthétique de canaux voltage-dépendants artificiels ion pour déterminer la tension de la membrane neuronale 8, l&#39;étude approfondie des effets de la non-déterministe vacillante sur canaux ioniques sur la dynamique de réponse neuronale 9, ainsi que la récréation in vitro de réaliste dans vivo- comme activité de fond synaptique 10. D&#39;autres paradigmes en boucle fermée qui ont été proposées comprennent la pince réactive 11, pour étudier in vitro la génération de l&#39;activité persistante auto-entretenue, et la réponse serrer 4,12, pour enquêter sur les mécanismes cellulaires de l&#39;excitabilité neuronale sous-jacente. ontenu &quot;&gt; Ici, nous décrivons un cadre puissant qui permet l&#39;application d&#39;une variété de boucle fermée protocoles électrophysiologiques dans le cadre d&#39;enregistrements patch clamp de cellules entières effectuées dans des tranches de cerveau aigus. Nous montrons comment enregistrer la tension de la membrane somatique au moyen d&#39;enregistrements de patch-clamp dans les neurones pyramidaux du cortex somatosensoriel de rats juvéniles et appliquer trois protocoles en boucle fermée à l&#39;aide de différents LCG, une boîte à outils de logiciels basés sur la ligne de commande développé dans le laboratoire de neurobiologie théorique et Neuroengineering. En bref, les protocoles décrits sont, d&#39;abord l&#39;injection automatique d&#39;une série de formes d&#39;onde pince de relance actuelles, pertinentes pour la caractérisation d&#39;un grand ensemble de propriétés des membranes actives et passives. Ceux-ci ont été suggérées pour capturer le phénotype électrophysiologique d&#39;une cellule en termes de ses propriétés de réponse à une série stéréotypée de formes d&#39;onde de relance. Connu comme le e-code d&#39;une cellule (par exemple, voir &amp; #160; 13,14), une telle collection de réponses électriques est utilisé par plusieurs laboratoires de classer objectivement neurones sur la base de leurs propriétés électriques. Cela comprend l&#39;analyse de la relation de transfert d&#39;entrée-sortie fixe (courbe FI), par une technique innovante qui consiste à boucle fermée, le contrôle en temps réel de la vitesse de mise à feu au moyen d&#39;un dispositif de commande (PID) proportionnel-intégral-dérivé , deuxième de la récréation vivo -comme activité réaliste de fond synaptique dans les préparations in vitro et 10, troisième la connexion artificielle en temps réel de deux neurones pyramidaux enregistrées simultanément au moyen d&#39;un interneurone GABAergique virtuel, qui est simulé par l&#39;ordinateur. En outre, LCG met en œuvre la technique dite électrode active rémunération (AEC) 15, qui permet la mise en œuvre des protocoles de serrage dynamiques en utilisant une seule électrode. Ceci permet de compenser les effets indésirables (artifacts) de l&#39;électrode d&#39;enregistrement qui se pose lorsqu&#39;il est utilisé pour délivrer des stimuli intracellulaires. La méthode est basée sur une estimation non paramétrique des caractéristiques électriques équivalentes du circuit d&#39;enregistrement. Les techniques et les protocoles expérimentaux décrits dans le présent document peuvent être facilement appliquées dans la tension en boucle ouverte conventionnelle et expériences de serrage actuels et peuvent être étendus à d&#39;autres préparations, comme extracellulaire 4,16 ou enregistrements intracellulaires in vivo 17,18. L&#39;assemblée attentive de la configuration pour le patch de cellules entières pince électrophysiologie est une étape très importante pour la stabilité, des enregistrements de haute qualité. Dans ce qui suit, nous supposons qu&#39;un tel dispositif expérimental est déjà disponible à l&#39;expérimentateur, et concentrons notre attention sur la description de l&#39;utilisation du LCG. Le lecteur est pointé à 19-22 pour obtenir des conseils supplémentaires sur l&#39;optimisation et le débogage.

<table><tbody><tr><td>Trancheuse de tissus</td><td>Leica</td><td>VT-1000S</td> Extracteur de <td></td></tr><tr><td>pipettes</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1,5/0,84 mm OD/ID, avec filament</td></tr><tr><td>Table d’isolation des vibrations</td><td>TMC</td><td>Série 20</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>DMLFS</td><td>40X</td></tr><tr><td>Objectif d’immersion</td><td>Manipulateurs Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateurs</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Contrôlé par ordinateur</td></tr><tr><td>Carte d’acquisition de données</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Pris en charge par Comedi Linux Pilotes</td></tr><tr><td>Ordinateur de bureau</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010 Tower</td> OS : oscilloscopes <td>Linux en temps réel</td></tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Pompe</td><td>Gibson</td><td>MINIPULS3</td><td>Utilisé avec R4 Tête de pompe (F117606)</td></tr><tr><td>Régulateur de température</td> Systèmes <td>multicanaux</td><td>TC02</td><td>PH01</td>Manomètre à canule de perfusion</tr><tr><td></td><td>Testo</td><td>510</td><td>Incubateur en option</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>ACSF, ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-Phosphocréatine</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux dynamics et au-delà

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Neurosciences expérimentales est témoin d&#39;un intérêt accru dans le développement et l&#39;application de nouveaux protocoles et souvent complexes, en boucle fermée, où le stimulus appliqué dépend en temps réel sur la réponse du système. Les applications récentes vont de la mise en œuvre de systèmes de réalité virtuelle pour étudier les réponses motrices à la fois chez la souris et chez le poisson zèbre 1 2, pour contrôler des crises après un AVC corticale en utilisant l&#39;optogénétique 3. Un des principaux avantages des techniques à boucle fermée réside dans la capacité de palpage caractéristiques dimensionnelles plus élevées qui ne sont pas directement accessibles ou qui dépendent de plusieurs variables, telles que l&#39;excitabilité neuronale 4 et la fiabilité, tout en maximisant le débit expérimentale. Dans cette contribution, et dans le contexte de l&#39;électrophysiologie cellulaire, nous décrivons comment appliquer une variété de protocoles en boucle fermée à l&#39;étude des propriétés des pyramidale neurones corticaux, rec réponseorded intracellulaire avec la technique de patch-clamp en tranches de cerveau aiguë du cortex somatosensoriel de jeunes rats. Comme aucun logiciel à code source disponible dans le commerce ou ouverte offre toutes les fonctionnalités nécessaires pour effectuer efficacement les expériences décrites ici, une nouvelle boîte à outils logicielle appelée LCG 5 a été développé, dont la structure modulaire optimise la réutilisation de code informatique et facilite la mise en œuvre de nouveaux paradigmes expérimentaux. formes d&#39;onde de stimulation sont spécifiées en utilisant une méta-description compacte et protocoles expérimentaux complets sont décrits dans les fichiers de configuration à base de texte. En outre, LCG dispose d&#39;une interface de ligne de commande qui est adapté à la répétition des essais et de l&#39;automatisation des protocoles expérimentaux.

Dans les sections précédentes, nous avons décrit comment utiliser le LCG de boîte à outils logiciels pour caractériser les propriétés électrophysiologiques des cellules pyramidales L5 et de recréer vivo -comme l&#39;activité synaptique dans une préparation de tranches. L&#39;utilisation d&#39;une interface de ligne de commande et le protocole semi-automatisé favoriser la reproductibilité et l&#39;efficacité de l&#39;expérience, ce qui peut avoir un grand impact sur le rendement et la qualité des donnée...

Les protocoles en boucle fermée sont de plus en plus répandus dans l’électrophysiologie moderne. Nous présentons une manière simple, polyvalente et peu coûteuse d’effectuer des protocoles électrophysiologiques complexes dans les neurones pyramidaux corticaux in vitro, à l’aide d’un ordinateur de bureau et d’une carte d’acquisition numérique.

Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de réaliser un clampage dynamique in vitro sur des neurones corticaux à l'aide de la boîte à outils logicielle librement disponible, LCG. Cette procédure s'effectue en préparant des tranches de cortex somatosensoriel de rat destinées à des enregistrements par électrode à patch sur les cellules paramétales. Dans un deuxième temps, une série de protocoles électrophysiologiques automatisés est appliquée à la cellule enregistrée, permettant une caractérisation standardisée de la cellule, utile pour les analyses ultérieures et les comparaisons entre types cellulaires.Ensuite, l'injection d'événements synaptiques excitateurs et inhibiteurs est simulée. Afin de recréer l'état de haute conductance subi par les neurones néocorticaux in vivo, les résultats montrent comment l'injection synaptique de fond module le gain des cellules corticales. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans la possibilité d'intégrer des enregistrements expérimentaux dans des protocoles plus complexes, par exemple en utilisant le résultat d'un protocole expérimental comme entrée pour un autre protocole.Cette méthode peut aider à standardiser les protocoles électrophysiologiques, accélérer l'analyse des données et ouvrir la voie au partage de données entre laboratoires. Bien que cette méthode ait été initialement développée pour les enregistrements de type patch CLA en conditions in vitro, elle peut également être utilisée aisément pour d'autres préparations expérimentales et protocoles, tels que les enregistrements patch in vivo, les enregistrements CLA ou les enregistrements accélérés avec des microélectrodes en réseaux. Après avoir extrait le cerveau de rat, éliminer le cervelet et séparer les deux hémisphères le long de la ligne médiane à l’aide d’un scalpel, retirer le liquide excédentaire d’un des hémisphères et le fixer sur une plateforme inclinée à l’aide d’une goutte de colle cyanoacrylate.Ensuite, ajoutez rapidement quelques gouttes de LCR au-dessus du cerveau et transférez-le dans la chambre Vibram. Retirez les 2,5 à 3 millimètres initiaux du tissu cérébral à l’aide d’une lame. Par la suite, ajustez la vitesse et la fréquence de découpe afin de limiter les dommages à la surface de la tranche.Ensuite, réglez l'épaisseur sur 300 micromètres et commencez la sectionnement. Une fois que la lame est passée au-delà du cortex, utilisez une lame de rasoir ou une aiguille courbée pour effectuer une incision au-dessus de l'hippocampe et aux bords de la région corticale d'intérêt. Par la suite, transférez les tranches dans une chambre d'incubation multi-puits à 36 degrés Celsius.Dans cette procédure, placez une tranche dans la chambre d'enregistrement avec l'objectif de 40 x. Recherchez des cellules saines dans la couche V, à une profondeur de 600 à 1000 micromètres sous la surface du cerveau. Ces cellules présentent généralement un contraste plus faible, un aspect lisse et ne sont pas gonflées.Une fois qu'une cellule saine est trouvée, chargez un tiers de la micropipette avec la solution intracellulaire. Ensuite, placez-la dans le support de tête sur le système d'exploitation Linux préconfiguré. Lancez une commande.Le shell ajoutera son invite. Saisissez cette commande pour vous assurer que la carte d'acquisition de données n'active pas l'amplificateur. Ensuite, appliquez une pression positive de 30 à 50 millibars en appuyant sur le piston de la seringue, qui est reliée au porte-pipette.Ensuite, placez la pipette à environ 100 micromètres au-dessus de la coupe et déplacez la pipette vers la cellule cible à l’aide du mode d’approche du micromanipulateur. Ajustez ensuite le décalage de la pipette sur l’amplificateur d’électrophysiologie et appliquez une impulsion témoin de 10 millivolts en mode de blocage de tension. Utilisez la commande LCG SEAL test pour surveiller la résistance de la pipette, puis réduisez la pression à 10 à 30 millibars en retirant le piston de la seringue.Approchez-vous délicatement de la cellule et vérifiez la formation d'un affaissement en observant l'image sur l'écran du moniteur de la caméra vidéo. En même temps, surveillez l'augmentation de la résistance provoquée par l'impulsion de test en regardant la forme d'onde du courant affichée sur le moniteur. Lorsqu'une augmentation de la résistance de la pipette et la formation d'un affaissement sur la cellule sont observées, relâchez immédiatement la pression et appliquez une pression négative douce sur la pipette pour favoriser la formation du scellement.Entre-temps, réduisez progressivement le potentiel de maintien à moins 70 millivolts. Appliquez une aspiration douce pour rompre la membrane cellulaire et établir la configuration en mode whole cell. Puis caractérisez la cellule en fonction de ses propriétés électriques.À l'aide de la commande LCGE. Voici le potentiel d'action moyen d'un neurone paramétal de la couche cinq enregistré avec un seuil de -50,5 millivolts. Cette figure montre la mesure des réponses passives aux courants hyperpolarisants.L'identification des propriétés actives de base de la cellule révèle que la cellule est un neurone à décharge régulière, et qu'il existe une adaptation minimale à l'injection de potentiels postsynaptiques excitateurs simulés. Passez au répertoire où sera enregistrée l'expérience suivante en tapant cette commande dans l'invite de commande du shell, au lieu d'agir sur les commandes matérielles classiques de l'amplificateur. Pour appliquer l'équilibrage de la pont et la compensation de la capacité, estimez le noyau de l'électrode nécessaire pour effectuer la compensation active de l'électrode en exécutant cette commande.Le noyau complet est la somme de deux composantes : un noyau d'électrode rapide et un noyau membranaire plus lent, qui donne lieu à la queue exponentielle observée dans le noyau complet. La première constitue un modèle non paramétrique de la pipette. Lors de l'injection de courant permettant de séparer les noyaux membranaire et d'électrode, la commande du noyau LCG invitera l'utilisateur à indiquer le nombre de points composant le noyau d'électrode rapide. Ensuite, sélectionnez un nombre tel que le noyau d'électrode couvre la fin de la queue de décroissance exponentielle.Ensuite, réalisez l'expérience de clampage dynamique en utilisant cette commande. Enfin, visualisez les résultats. Voici la reproduction d'une activité semblable à celle in vivo à l'aide du clampage dynamique.Les tracés rouges et bleus représentent respectivement la simulation de synapses excitatrices et inhibitrices. Voici les tracés de tension enregistrés à partir d’un neurone paramétal L5 soumis à un bombardement de courants post-synaptiques excitateurs ou inhibiteurs. Les courants injectés correspondants, excitateur, inhibiteur et total, sont affichés sur le graphique.Le graphique raster des potentiels d'action enregistrés au cours de 20 essais montre que le neurone peut être extrêmement fiable et précis en réponse au même stimulus. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des expériences de lampe dynamique à l'aide de la boîte à outils logicielle LCG, disponible gratuitement. Cette procédure peut être étendue à d'autres protocoles en boucle fermée afin d'étudier une grande variété de sujets, allant de l'excitabilité neuronale aux interactions complexes au sein des réseaux.

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