Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l'utilisation des Métazoaires organisme modèle

L’objectif général des expériences suivantes est d’examiner la propagation et la toxicité complexe des protéines de type PreOn en utilisant l’organisme modèle Metazoan C elegance. Ceci est réalisé en surveillant le transport intra et intracellulaire des vésicules contenant la protéine de type PreOn, à l’aide de la microscopie à fluorescence time-lapse. Ensuite, des capteurs de pliage spécifiques aux tissus et un stress exprimé partout.

Les rapporteurs sont utilisés pour évaluer les effets autonomes cellulaires et non autonomes sur la fitness cellulaire. Ensuite, un criblage d’ARNi à l’échelle du génome est effectué afin d’identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par PreOn. Le tamis est réalisé en culture liquide en utilisant le battage comme indicateur de toxicité.

Enfin, un plugin pour l’image J est utilisé pour quantifier le mouvement de l’élégance C en combinaison. Ces méthodes permettent de démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire des protéines de type PreOn et leur toxicité autonome non cellulaire. Après avoir préparé des lignes transgéniques synchronisées de contrôle de l’élégance de la mer et du domaine PreOn et des tampons 10 %agros, conformément au protocole de texte d’accompagnement, pipetez trois microlitres de 100 nanogrammes de billes de polystyrène et trois microlitres de quatre millimolaires de limassol dans le tampon agros.

À l’aide d’un fil de platine, transférez les vers à l’âge souhaité d’une plaque dans la solution et utilisez une lamelle pour couvrir afin d’imager les vers au niveau subcellulaire. Placez une lame dans le support de lame de microscope d’un microscope confocal et utilisez un objectif à huile 63 x ou 100 x 1,4 NA. Ensuite, ouvrez METAMORPH et sélectionnez acquisition multidimensionnelle.

Et sous l’onglet principal, cochez les cases Time Lapse et Run Journals. Sous l’onglet Sauvegarde, sélectionnez ou créez le dossier de répertoire pour l’enregistrement des fichiers et attribuez-leur un nom. Sous l’onglet Longueur d’onde, utilisez Yoko quad red ou un éclairage équivalent de l’imagerie MRFP et réglez l’exposition entre 100 et 300 millisecondes et le gain de la caméra entre 100 et 300. Ensuite, sous l’onglet Time lapse, définissez l’intervalle de temps sur une seconde, la durée sur cinq minutes et le nombre de points temporels sur 301.

Sous l’onglet journaux. Pour le journal, sélectionnez Un ensemble FC, Z hold et A FC revenir à Z hold pour le type select special deux fois et pour le point initial, sélectionnez le début du point temporel et la fin du point temporel. Une fois la configuration terminée, appuyez sur Acquérir Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les applications de suivi des particules peuvent être utilisées afin de mesurer les propriétés dynamiques des spécifications.

Après avoir synchronisé les nématodes transgéniques et de type prion et copié les plaques de la bibliothèque d’ARNAI ingérent conformément au protocole texte, incuber des plaques d’ARNi dupliquées à 37 degrés Celsius et 300 tr/min pour utiliser la bactérie HT 15 E coli hébergeant le vecteur vide L 4 4 4 0 comme contrôle. Cultivez-le séparément dans un tube de culture, puis utilisez une pipette multicanaux pour transférer 65 microlitres de la culture dans un quart des puits de 2 96. Plaques à puits avec un poste de travail automatisé contenant une tête multicanaux distribuée.

10 microlitres de cinq, millimolaire d’IPTG dilué dans chaque puits des bactéries ARNi et des plaques de contrôle. Refermez-les avant de les laisser incuber pendant trois heures pendant que les bactéries couvent. Mélangez des larves transgéniques de type sauvage et des larves transgéniques L one et un puits tampon M neuf et pipetez cinq à 10 microlitres sur un microscope en verre.

Comptez les vers sur une diapositive et calculez le nombre de vers par microlitre. Après l’incubation bactérienne de trois heures, retirez les plaques de l’incubateur et laissez-les revenir à température ambiante pour éviter que la chaleur ne stresse les vers. Ensuite, complétez le tampon M nine avec du cholestérol IPTG et des antibiotiques selon le protocole textuel.

Et ajoutez le volume approprié de solution de ver transgénique du domaine PreOn à une concentration finale de 15 vers par mélange de microlitres pour une répartition uniforme. Ensuite, versez 50 microlitres dans chaque puits des plaques ARNi et dans les puits de l’une des plaques de contrôle vectorielles vides. Versez une solution de vers de type sauvage dans la deuxième plaque de contrôle.

Laissez ensuite toutes les plaques descellées pour permettre l’aération et empêcher la culture liquide de s’évaporer en empilant quatre à cinq assiettes ensemble, en les enveloppant d’une serviette en papier humide suivie d’une feuille d’aluminium. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius et 200 tr/min pendant quatre jours. Pour les plaques, utilisez une caméra Falcon four M 60 connectée à un ordinateur avec un moniteur pour dépister visuellement l’augmentation de la raclée par rapport aux animaux transgéniques du domaine PreOn traités par contrôle.

Le principal avantage de l’utilisation d’un poste de travail automatisé de manipulation de liquides pour distribuer les vers dans les plaques d’ARNi R est qu’il réduit considérablement la variabilité et le nombre de vers par puits. Pour effectuer un test de motilité sur des plaques solides et valider les clones d’ARNi candidats, les bactéries ARNi cultivent des bactéries ARNi pendant la nuit selon le protocole de texte. Ensuite, utilisez un IPTG millimolaire pour induire l’expression de l’ARN SD pendant trois heures.

Utilisez 150 microlitres de chaque clone bactérien ARNi pour ensemencer les plaques NGM préalablement préparées, en les étalant en une fine couche. Laissez les bactéries sécher pendant deux jours à température ambiante dans l’obscurité sous un stéréomicroscope. Déterminer la quantité de vers synchronisés et de suspension comme décrit précédemment et ajouter 25 à 30 L d’une larve dans chaque plaque expérimentale.

Incuber les nématodes à 20 degrés Celsius pendant quatre jours jusqu’à ce que les vers atteignent. Le deuxième jour de l’âge adulte, pour quantifier la motilité du ver, allumez la caméra et le logiciel d’imagerie PCI simple. Cliquez sur l’icône de l’appareil photo pour activer le réglage des conditions d’imagerie.

Ensuite, configurez la condition d’imagerie comme suit. Réglez le gain sur zéro, le mode d’éclairage sur l’indice haute vitesse sur un et le binning sur deux. Ensuite, cliquez sur en direct et sur l’exposition automatique et ajustez les conditions d’éclairage en déplaçant les miroirs du microscope et les cadrans de luminosité et de contraste.

Cliquez sur le temps, scannez et tapez dans un dossier et un nom de fichier définissez le champ Délai sur 20 millisecondes et Arrêt sur Temps sur 30 secondes. Appuyez sur la revue en direct afin de choisir la zone de la plaque à enregistrer. Tapotez ensuite la plaque trois ou quatre fois sur la scène.

Confirmez rapidement sa position dans le champ de vision et appuyez sur Démarrer une fois l’enregistrement terminé : cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image et choisissez Exporter la séquence de montage pour exporter le film d’un format CXD vers un fichier A VI. Pour analyser les vidéos de motilité, ouvrez l’image J, choisissez l’onglet plugins, puis choisissez Worm Tracker et sélectionnez Worm Tracker batch, et sélectionnez le répertoire contenant tous les fichiers à analyser dans la fenêtre d’entrée principale de Worm Tracker batch chargez les valeurs d’entrée comme détaillé ici. Une explication de chacun des paramètres se trouve dans les instructions qui accompagnent le plugin.

Cliquez sur OK et laissez l’analyse de mouvement s’exécuter. Enfin, pour conserver les résultats, confirmez que toutes les traces détectées proviennent de l’élégance réelle de la mer et éliminez les artefacts. Ouvrez les fichiers TXT créés pour chaque film et copiez les informations dans un fichier de logiciel d’analyse de données.

Ouvrez les étiquettes des fichiers zip créés et exécutez les étiquettes TIFF résultantes pour vérifier et éliminer manuellement les fausses traces de vers. Yesper Peterson, un ancien postdoctorant dans le laboratoire, a eu l’idée du traqueur de vers comme substitut à notre évaluation manuelle de CL Elegance motil, qui est une lecture de la toxicité. Le traqueur de vers nous permet de faire ces expériences de manière automatisée, sans biais de l’utilisateur, tout en évaluant plus de conditions dans un laps de temps plus court à l’aide de l’imagerie en accéléré.

L’appel d’offres a marqué R deux, E, deux, qui s’accumule dans les vésicules tubulaires, a été vu transporté à l’intérieur et entre les cellules par coex exprimant un capteur de repliement ou un rapporteur de stress. Avec la cellule protéique de type PreOn, les effets autonomes et non autonomes peuvent être évalués. L’expression de R deux E deux dans les cellules musculaires conduit à un début plus précoce de l’agrégation de Q 44 dans l’intestin, révélant que R deux E deux a des effets autonomes non cellulaires sur la protéostasie co-expression de R deux E deux Avec le SOD trois PGFP Le rapporteur de stress oxydatif transcriptionnel conduit à une régulation positive du rapporteur dans différents tissus, démontrant que le domaine PreOn induit une réponse au stress oxydatif non cellulaire de manière autonome en suivant le criblage de l’ensemble du génome.

Ce film démontre que l’imagerie haute résolution et la visualisation sur l’écran de l’ordinateur permettent de filtrer un quart d’une plaque simultanément Une fois maîtrisés, ces protocoles de dépistage peuvent être réalisés en 12 tours de 25 plaques par session. Si deux séances sont effectuées par semaine, l’ensemble de la banque d’ARNi peut être dépisté dans un délai de six semaines. Le traqueur de vers a été utilisé pour quantifier la motilité de l’élégance C, comme on le voit ici.

Worm Tracker convertit une vidéo originale en un format binaire et chaque ver se voit attribuer une piste. Les vidéos traitées peuvent être visionnées avec des pistes superposées pour éliminer manuellement tous les artefacts. Le paramètre Longueurs de corps par seconde se normalise pour les différences de taille potentielles. Nématodes.

Cette méthode a permis d’identifier 35 suppresseurs de la toxicité induite par PreOn qui ont augmenté le phénotype de motilité à au moins 133 % et jusqu’à 256 % par rapport aux vers témoins traités. Lors de la location du traqueur de vers, il est important de ne pas oublier de vérifier manuellement l’obtention des traces de vers. Le logiciel fait un excellent travail d’identification des vers, mais il arrive que l’arrière-plan soit identifié par erreur comme étant celui d’un animal.

Par conséquent, n’oubliez pas de vérifier vos vidéos après avoir exécuté un traqueur de vers sur celles-ci. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies neurodégénératives, telles que la capacité d’une certaine protéine de lien avec la maladie de se propager d’une cellule à l’autre, ou s’il existe un lien entre la transmission intercellulaire et la toxicité complexe de ces protéines. Enfants.