Name: Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de lutilisation des Métazoaires organisme modèle C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Découvrez la propagation des protéines prions et leur toxicité chez C. elegans par microscopie à fluorescence et criblage ARN. Ces méthodes révèlent les mécanismes cellulaires impliqués dans les maladies neurodégénératives.

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Nous remercions Cindy Voisine et Yoko Shibata pour leur discussion utile et leurs commentaires critiques sur le manuscrit. Nous remercions le Laboratoire d’analyse à haut débit (HTAL) et l’Installation d’imagerie biologique (BIF) de l’Université Northwestern pour leur aide. Ce travail a été financé par des subventions des National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), de la Fondation médicale Ellison et de la Fondation Daniel F. et Ada L. Rice (à R.I.M.). C.I.N.-K. a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Surveillance transcellulaire épandage des protéines à prions comme par In Vivo imagerie time-lapse NOTE: Cultivez C. elegans de type sauvage (WT) (N2) et lignées transgéniques selon des méthodes standard et de contrôler attentivement la température de la culture 47. <ol><li> Générer des lignées transgéniques de C. elegans exprimant la protéine prion-like, marqués avec la protéine fluorescente rouge monomère (RDRF). Regardez cette vidéo qui montre comment utiliser la micro-injection 48. Pour plus de détails et les méthodes décrivant comment intégrer ces lignes extrachromosomiques, voir 49. </li><li> Préparer populations synchronisés par ponte ou de blanchiment selon les méthodes standard 50. <ol><li> Synchronisation par la ponte <ol><li> Transfert 10-20 adultes gravides sur une plaque et les laisser pondent des œufs pour les 1-2 heures. Retirer les adultes de la plaque et laisser la descendance grandir jusqu&#39;à l&#39;âge désiré. </li></ol></li> &lt;li&gt; Synchronisation par le blanchissement <ol><li> Recueillir une population non synchronisé des adultes gravides et de les blanchir avec une solution alcaline d&#39;hypochlorite (NaOH 250 mM et 1: 4 (v / v) la dilution d&#39;eau de Javel commerciale en H 2 O). Lavez les œufs deux fois (218 g pendant 1 min) avec le tampon M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, une mMMgSO 4 · 7H 2 O, ajoutez dH 2 O jusqu&#39;à 1 L). </li><li> Permettez-leur d&#39;éclore dans un tampon M9 avec agitation douce O / N à 20 ° C. le développement de Worm arrêtera au stade L1 en l&#39;absence d&#39;une source de nourriture, laissant une population synchronisée. Transfert N1 sur frais nématodes croissance médias (NGM) plaques ensemencées avec OP50 E. coli et bactéries permettent de développer la descendance jusqu&#39;à 47 l&#39;âge désiré. </li></ol></li></ol></li><li> Préparer tampons d&#39;agarose à 2% (en H 2 O) sur une lame de microscope 50 comme décrit. <ol><li> Préparer deux kmdiapositives croscope avec du ruban d&#39;étiquetage placé sur toute leur longueur à être utilisés comme entretoises. Placez tiers lame de microscope entre eux. </li><li> Dissoudre 2% d&#39;agarose en H 2 O et une pipette goutte sur la lame propre. </li><li> Placez quart diaporama perpendiculaire aux trois autres diapositives sur le dessus de la chute agar. Appuyez doucement sur pour aplatir le pad pour la même épaisseur que la bande d&#39;étiquetage. </li><li> Laissez sécher pendant 1 min avant de retirer les entretoises et en tirant doucement les lames dehors. Le pad agar se en tiendra à l&#39;un d&#39;eux. </li></ol></li><li> Introduire à la pipette 10 ul ~ anesthésique (2 lévamisole mM dans du tampon M9) sur le tampon et le transfert ~ 10 animaux en utilisant une pointe de fil de platine. Couvrir avec une lamelle (~ 22 x 22 mm) et de prendre des images dans une heure. </li><li> Alternativement, d&#39;acquérir des films sur une période de temps plus ou pour réduire davantage la possibilité de tout mouvement des animaux, utiliser une combinaison d&#39;anesthésique et le talon 51 immobilisation. <ol><li> Préparer 10% agatampons rose (dans du tampon M9) comme décrit 51 ajouter et vers solution à 3 ul de standards de taille de nanosphères (billes de polystyrène, de 100 nm) plus 3 ul d&#39;anesthésie (4 lévamisole mM dans du tampon M9). Couvrir délicatement avec une lamelle. Pour éviter la dessiccation, sceller la lamelle avec valap (mélange de quantités égales de la vaseline, de la lanoline, la cire de paraffine). </li></ol></li><li> Image en immobilisée vers l&#39;utilisation d&#39;un microscope confocal. NOTE: Les résultats sont obtenus en utilisant un disque Spinning AF microscope confocal équipé d&#39;une caméra EM-CCD et un logiciel Microscopie Automation &amp; Analyse d&#39;image tels que MetaMorph et décrivent les détails ci-dessous, mais d&#39;autres systèmes d&#39;imagerie confocale comparables peuvent également être utilisés. <ol><li> Utilisez l&#39;objectif 63X ou 100X / 1.4NA pétrole et placer la lame de microscope contenant des vers dans le support de lame de microscope. </li><li> Ouvrez le logiciel. Régler la puissance du laser et des filtres pour l&#39;imagerie mRFP. Utilisez le laser 561 nm à 10% de la puissance et l&#39;émission filtre&gt; 600 nm. </li><li&gt; Ouvrir &quot;MultiDimensional acquisition». Sous l&#39;onglet &quot;Principal&quot;, cochez les cases pour &quot;Timelapse» et «Run Journals&quot; (Hardware Auto Focus: off). </li><li> Sous l&#39;onglet &quot;Enregistrement&quot; sélectionner ou créer le dossier du répertoire où les fichiers doivent être sauvegardés. Attribuez un nom au fichier. </li><li> Sous l&#39;onglet &quot;Wave Longueur&quot; sélectionnez l&#39;éclairage approprié et ajuster l&#39;exposition et gain. Utiliser &quot;YokoQuad Red&quot; (ou un réglage d&#39;éclairage pour l&#39;imagerie mRFP équivalent) avec une exposition entre 100 et 300 ms et un gain de la caméra entre 100 et 300, en fonction de l&#39;échantillon individuel (évaluée en utilisant l&#39;image en direct). </li><li> Sous l&#39;onglet «Timelapse», sélectionnez «Nombre de points de temps&quot; = 301, &quot;Durée&quot; = 5 min et &quot;Durée / Intervalle&quot; = 1 sec. </li><li> Dans le cadre du &quot;Journaux&quot; Sélectionnez l&#39;onglet Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; et &quot;AFC retour à Z HOLD&quot;, Type: &amp;# 8220; spécial &quot;(deux fois), point de départ:&quot; Début de l&#39;heure le point &quot;et&quot; Fin de point de temps. &quot; Cette option de mise au point est important pour l&#39;image de la même section sur une période de temps plus longue. </li><li> Lorsque l&#39;installation est terminée, appuyez sur &quot;Acquérir&quot;. La vidéo timelapse est Safed sous forme de fichiers TIFF séparés. </li><li> Ouvrez tous les fichiers .tiff d&#39;une série de temps donné dans ImageJ. Allez à &quot;Image&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Images à Stacks&quot;. Eventuellement, régler la luminosité et le contraste, ajouter une barre de taille, etc. exporter le film dans &quot;Fichier&quot; → &quot;Enregistrer sous&quot; → &quot;AVI ...&quot; (pour un exemple, voir la vidéo 1 et 2 correspondant à la figure 1). </li></ol></li></ol> 2. Utilisation de capteurs pliants et Reporters stress d&#39;enquêter cellulaire autonome et non cellulaire autonome affecte sur protéostasie et toxicité <ol><li> Générer des lignées transgéniques qui coexprimer un capteur de pliage ou de stress reporter avec la protéine prion-like. Pour les méthodes sur la façon d&#39;établir des croix ou de générer des lignées transgéniques, voir 48,49,52. Voir le tableau 1 pour une liste de C. elegans souches qui peuvent être utilisées. </li><li> Préparer populations synchronisées d&#39;animaux transgéniques et de les cultiver jusqu&#39;à l&#39;âge désiré comme décrit ci-dessus (section 1.2) 50. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un stéréomicroscope, d&#39;examiner le phénotype du capteur respectif de pliage ou de stress reporter. <ol><li> Pour le capteur de pliage, de déterminer le nombre d&#39;animaux hébergeant agrégats de chaque jour après la synchronisation (pour un exemple, voir la figure 2E et F). </li><li> Pour le journaliste de stress, test si la co-expression des résultats de protéines prion-like dans une fluorescence accrue de la journaliste (pour un exemple, voir la figure 3). </li></ol></li></ol> 3. Écran d&#39;échelle du génome pour la répression de la toxicité induite Prion-en C. elegans<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figure 4. Représentation schématique du protocole de dépistage ARNi. Voir la section 3 du protocole pour une description détaillée des étapes individuelles. <ol><li> Synchronisation de C. vers elegans et le dédoublement de la bibliothèque de l&#39;ARNi <ol><li> Pour l&#39;écran ARNi, utiliser la bibliothèque Ahringer ARNi (ou la bibliothèque Vidal ARNi) 53,54. Rearray la bibliothèque de l&#39;ARNi 384 format bien d&#39;origine dans des plaques 96 puits en remplissant les plaques avec 100 ul de milieu LB-amp (50 ug / ml d&#39;ampicilline dans LB) supplémenté avec 10% de glycerol et inoculer en utilisant un réplicateur à 96 broches. Croître à 37 ° CO / N avec agitation et conserver à -80 ° C. </li><li> Maintenir C. elegans WT et lignées transgéniques à 20 ° C sur des plaques NGM ensemencées avec OP50 E. bactéries coli selon des procédés standard 47. </li><li>Synchronisez le domaine de prion transgénique et WT (contrôle) nématodes par le blanchiment (voir section 1.2). </li><li> Le même jour que les vers sont blanchies, préparer milieu LB additionné de 50 ug / ml d&#39;ampicilline. Utilisez un distributeur de réactif automatisée à distribuer (ou d&#39;une pipette manuelle) 65 pi des médias LB-ampères dans chaque puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Retirer 96 des plaques de bibliothèque Ahringer ARNi de -80 ° C et les amener à une hotte stérile avec des serviettes en papier. Immédiatement retirer le joint-bande en maintenant la plaque à l&#39;envers pendant plaques sont encore gelés, prenant soin d&#39;éviter la contamination de la glace à l&#39;extérieur des plaques. Reinvert les plaques et laissez-les décongeler pendant environ 30 min. </li><li> Trempez une stérile 96 broches réplicateur dans une plaque bibliothèque ARNi, puis dans une plaque LB-ampères frais. Utilisez un réplicateur frais stérile pour chaque plaque. Sceller toutes les plaques avec du papier adhésif et retourner les plaques de la bibliothèque à -80 ° C. Les réplicateurs peuvent être trempées dans l&#39;eau de Javel, rincées,et passé à l&#39;autoclave pour être utilisé à nouveau. </li><li> Permettre plaques ARNi doubles de croître O / N dans un incubateur réglé à 37 ° C et 300 rpm. Pour utiliser HT115 E. coli bactéries hébergeant le vecteur vide (L4440) comme témoin, se développent séparément dans un tube de culture puis pipeter 65 pi de la culture avec une pipette multicanaux en quart de deux plaques à 96 puits. </li></ol></li><li> Induction de la production bactérienne ARNdb et l&#39;ajout de vers <ol><li> Diluer isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration de 5 mM dans ddH 2 O. Utilisez un poste de travail automatisé avec une tête multicanal à distribuer (ou une pipette manuelle) 10 pi de IPTG dilué dans chaque puits des bactéries ARNi et les plaques de contrôle. Refermer et placer les plaques de nouveau dans l&#39;incubateur. Qu&#39;ils tremblent pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Alors que les bactéries sont tremblaient, préparer les vers. Mélanger le / ver suspension M9 bien, et la pipette un petit échantillon (~ 5-10 pi) sur une lame de microscope en verre. Compterle nombre de vers sous un stéréomicroscope et de calculer le nombre de vers par ul. </li><li> En utilisant une technique stérile, préparer une solution de M9 supplémenté (M9 +) avec les concentrations finales suivantes: 0,20 mg / ml d&#39;IPTG, 8,0 ug / Cholestérol ml, 50 pg / ml d&#39;ampicilline, 9,6 pg / ml de tetracycline, 0,0835 ug / ml de Fungizone, et 15 vers par 50 ul. <ol><li> Faire des solutions séparées pour le domaine de prion transgénique et les vers WT. Le volume final de la solution de ver M9 + nécessaire dépendra du nombre de plaques ARNi copiés (voir ci-dessous), plus ~ 30 ml de volume mort qui restera dans le réservoir, si un distributeur automatique est utilisé. </li></ol></li><li> Après l&#39;induction de 3 h de la production bactérienne ARN double brin, prendre les plaques de l&#39;incubateur et laisser refroidir à température ambiante (~ 30 minutes) pour éviter la chaleur soulignant les animaux. </li><li> Distribuer M9 + solution de ver transgénique de domaine prion de 50 ul à chaque puits des plaques ARNi et l&#39;une des plaques de lutte antivectorielle vides. FaireAssurez-vous de mélanger la solution à vis sans fin, avant chaque étape que les animaux ont tendance à sédimenter au fond du réservoir. </li><li> Distribuer vers WT dans la seconde plaque de commande. Laissez les plaques non scellées pour permettre l&#39;aération. Pour garder la culture liquide de se évaporer, empiler 4-5 plaques ensemble et enveloppez-les avec une serviette en papier humide et une feuille d&#39;aluminium. Incuber à 200 tours par minute à 20 ° C pendant 4 jours. </li></ol></li><li> Points NOTE: Après 4 jours dans l&#39;incubateur, les vers seront à la deuxième journée de l&#39;âge adulte et sont prêts à l&#39;écran. Laissez les animaux à se adapter à des conditions non secousse pendant 30 min avant de dépistage pour se assurer volée sans être dérangé. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un appareil Falcon 4M60 connecté à un ordinateur avec un moniteur, écran visuellement augmenté volée par rapport aux témoins traités domaine prion animaux transgéniques. </li><li> Dresser une liste de hits préliminaires pour confirmer utilisant wrMTrck (voir la section suivante). </li></ol></li></ol> 4. Confirmation de préliminaireVisites écran <ol><li> Motilité test sur des plaques solides <ol><li> Préparer des plaques NGM avec supplémenté avec 100 ug / ml d&#39;ampicilline, 12,5 ug / ml de tetracycline et 1 mM d&#39;IPTG, selon des procédés standard 47. Si possible, utilisez une machine en forme de plaque de coulée pour assurer toutes les plaques ont la même hauteur des médias, ce qui permettra un processus d&#39;acquisition vidéo plus simple. </li><li> Cultiver les différents clones d&#39;ARNi dans ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml d&#39;ampicilline, O / N à 37 ° C et 250 tours par minute. </li><li> Le lendemain, induisent l&#39;expression de l&#39;ARN double brin avec IPTG 1 mM pendant 3 heures. Ensemencer les plaques avec 150 pi de chaque clone bactérien ARNi, répartis dans une couche mince. Que les bactéries sèches pendant 2 jours à la température ambiante dans l&#39;obscurité. Préparer 3 plaques par ARNi clone. </li><li> Synchroniser la population du ver par blanchiment selon des méthodes standard 50 (voir section 1.2), et de laisser les œufs éclosent O / N dans des milieux M9. </li><li> Prélever un échantillon de la suspension de vis sans fin et déterminer le montant de nematodes par ul à la loupe binoculaire. Puis, une pipette le bon volume de M9 ainsi vers dans chaque plaque expérimentale de sorte qu&#39;il contient 25 à 30 vers L1. Cultivez les nématodes à 20 ° C pendant quatre jours jusqu&#39;à ce que les vers atteignent deux jours de l&#39;âge adulte. </li></ol></li><li> L&#39;analyse quantitative de ver motilité avec le plugin pour ImageJ wrMTrck REMARQUE: Les vidéos ont été enregistrés en utilisant un stéréomicroscope à un grossissement de 10X avec un Hamamatsu Orca-R2 appareil photo numérique C10600-10B et le logiciel d&#39;imagerie PCI simple Hamamatsu. <ol><li> Allumez l&#39;appareil photo et le logiciel d&#39;imagerie PCI simple. Cliquer sur &quot;direct&quot; pour permettre le réglage des conditions de formation d&#39;image. </li><li> Mettre en place les conditions vidéo comme suit: Gain = 0; Mode Voyant = haut; Indice de vitesse = 1; Binning = 2. Cliquez sur «Exposer Auto», puis ajuster les conditions d&#39;éclairage, le déplacement des miroirs de microscope et la luminosité et le contraste cadrans. REMARQUE: La vidéo doit avoir un contraste élevé sans être EXPOSED, de sorte que les animaux affichent comme des formes noires sur un fond clair. </li><li> Cliquez sur &quot;Scan Time&quot; et choisissez un dossier et un nom de fichier. Réglez &quot;Champ Delay&quot; à 20 ms et &quot;Arrêtez-vous à l&#39;heure&quot; à 30 sec. Appuyez sur &quot;Revoir Live&quot; pour choisir la zone de la plaque d&#39;enregistrer (où la plupart des vers sont). Appuyez sur la plaque 3 ou 4 fois sur la scène, rapidement confirmer sa position dans le champ de vision et appuyez sur &quot;Démarrer&quot;. </li><li> Après le film a fini d&#39;enregistrer, cliquez droit sur l&#39;image et choisissez &quot;Exporter Montage Séquence&quot; pour exporter le film d&#39;un format à un .cxd .avi. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des vidéos de la motilité <ol><li> Ouvrez le logiciel ImageJ, allez dans l&#39;onglet &quot;Plugins&quot;, puis &quot;wrmtrck&quot; et sélectionnez &quot;Batch wrMTrck&quot;. Sélectionnez le répertoire contenant tous les fichiers à analyser. </li><li> Dans la fenêtre de wrMTrck_Batch d&#39;entrée principale, charger les valeurs d&#39;entrée comme détaillé dans Figure 5C. Explication pour chacun des paramètres peut être trouvée dans les instructions qui accompagnent le plugin. Cliquez sur &quot;OK&quot; et laisser l&#39;analyse du mouvement terme. </li><li> Pour prendre soin des résultats et de confirmer que toutes les pistes sont détectées à partir réelle C. elegans et éliminer les artefacts, ouvrir chacun des fichiers .txt créés pour chaque film et de copier les informations dans un fichier de logiciel d&#39;analyse de données. Ouvrez les &quot;*&quot; _labels.zip fichiers créés et exécutez le résultat &quot;* _labels.tif&quot; pour vérifier et éliminer les pistes de vers de fausses manuellement. </li></ol></li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Les procédés décrits ici permettent d&#39;illustrer la propagation cellulaire et la toxicité de la cellule autonome et non autonome complexe de protéines prion-like. Nous avons récemment découvert que un domaine prion cytosolique agrégation sujette est repris dans des vésicules membranaires dans un processus d&#39;autophagie liés. Un sous-ensemble spécifique de ces vésicules transporte le domaine de prion dans et entre les cellules et les tissus 40. La clé pour contrôler leur mouvement dans l&#39;animal vivan...

Beaucoup de maladies neurodégénératives, dont la maladie d&#39;Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (PD), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), sont associés à des protéines d&#39;agrégation sujette et sont donc collectivement connus comme mauvais repliement des protéines troubles (PMD ). EST ou maladies à prions constituent une classe unique de PMD en ce qu&#39;ils peuvent être infectieux chez les humains et les animaux 1. Au niveau moléculaire, les prions répliquent par le recrutement et la conversion de monomère α-hélice riche PrP cellulaire codée par l&#39;hôte (PrP C) dans le pathologique β-feuille riche PrP Sc conformation 2,3. agrégats auto-propagation protéines ont également été identifiés dans les champignons, qui partagent des caractéristiques importantes des prions de mammifères 4,5. En outre, les prions de mammifères sont capables de se déplacer de cellule à cellule et infectent les cellules naïves 6,7. Alors que PMD OTHer que les EST ne sont pas infectieux, ils partagent un principe pathogène commun avec les maladies à prions 8,9. Bien que les protéines liées à chacun des PMD ne sont pas liés dans la structure ou la fonction, ils tous les agrégats de formulaire via un processus de cristallisation comme appelés nucléé ou la polymérisation ensemencées; ailleurs semences protéiques grandir en recrutant leurs isoformes solubles 2,10,11. L&#39;efficacité de l&#39;auto-propagation in vivo varie, en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, qui, avec d&#39;autres facteurs cellulaires tels que les chaperons moléculaires finalement déterminer les taux de nucléation agrégat, l&#39;ensemencement, la fragmentation et la diffusion de 12 à 15. Par conséquent, il doit exister un juste équilibre entre ces facteurs qui permet la propagation efficace de l&#39;agrégation des protéines. Cela pourrait aussi expliquer pourquoi seuls certains agrégats amyloïdogéniques abritent les caractéristiques d&#39;un prion, et donc tous les PMD sont infectieux. Prions semblent représenter l&#39;o &#39;top-interprètesfa large éventail d&#39;agrégats protéiques auto-réplication, qui en fait un outil puissant pour étudier PMD 8,13. Curieusement, la toxicité associée aux agrégats liés à la maladie a souvent un composant non cellulaire autonome 16,17. Cela signifie qu&#39;ils affectent des cellules voisines qui ne expriment pas le gène correspondant, par opposition à un effet strictement cellule autonome, ce qui implique que seules les cellules exprimant le gène présentent le phénotype spécifique. Cela a été démontré de façon convaincante par l&#39;expression spécifique d&#39;un tissu ou d&#39;abattre les protéines respectives dans de nombreux modèles de maladies neurodégénératives 18-26. Divers mécanismes ont été suggérés comme une base pour cette toxicité autonome non-cellule dans les PMD, y compris l&#39;approvisionnement en éléments nutritifs diminué, déséquilibre dans la signalisation neuronale, excitotoxicité du glutamate et neuroinflammation 16,27,28. En outre, un mouvement de prion comme des agrégats de maladies liées entre cellules MIGHt contribuer à cet aspect 29,30. Des preuves croissantes suggèrent que les protéines autres que les inclusions peuvent transmettre prions de cellule à cellule, ce qui peut expliquer la propagation de la caractéristique de la pathologie observée dans de nombreux PMD 30-36. Cependant, il n&#39;a pas encore été déterminé se il existe un lien de causalité évident entre le mouvement intercellulaire de protéines de la maladie et l&#39;effet toxique sur les cellules voisines. Par conséquent, une meilleure compréhension des voies cellulaires qui sous-tendent la transmission de cellule à cellule et la toxicité cellulaire non autonome est nécessaire et essentiel pour le développement de nouveaux produits thérapeutiques. Cependant, de nombreux aspects de prion-like facteurs d&#39;étalement et cellulaires qui influencent la transmission des protéines mal repliées de cellule à cellule dans métazoaires ne sont pas bien comprises, en particulier au niveau de organismal. Le nématode Caenorhabditis elegans a plusieurs avantages qui fournissent le potentiel de découvrir de nouvelles facettes de prion-like spreading chez les métazoaires 17. Il est transparent, ce qui permet le suivi in vivo de protéines par fluorescence marqués dans l&#39;organisme vivant. En outre, de nombreux processus cellulaires et physiologiques touchées par la maladie sont conservés des vers pour la santé humaine, et C. elegans est également prête à une grande variété de manipulations génétiques et les analyses moléculaires et biochimiques de 37 à 39. Exactement 959 cellules somatiques constituent l&#39;hermaphrodite adulte avec un plan de corps simple qui a encore plusieurs types de tissus distincts, y compris musculaires, les neurones et l&#39;intestin. Pour établir un nouveau modèle de prion en C. elegans, nous avons choisi d&#39;exprimer la glutamine exogène / asparagine bien caractérisés (Q / N) riche prion domaine NM de la protéine cytosolique levure prion Sup35, car il n&#39;y a pas de protéines prions endogènes connus vers 4,40. prions de levure ont été inestimables pour élucider les mécanismes de base de la réplication du prion 41-44. En outre, NM est le sapinst cytosolique protéine prion-like qui a été montré pour récapituler le cycle de vie complet d&#39;un prion dans la culture de cellules de mammifères 45,46. De même, lorsqu&#39;il est exprimé dans C. elegans, le domaine de prion Sup35 adoptée remarquablement bien aux différentes exigences pour la propagation dans les cellules de métazoaires par rapport à des cellules de levure et les principales caractéristiques exposées de la biologie du prion agrégation 40. NM a été associée à un phénotype toxique profonde, y compris la perturbation de l&#39;intégrité mitochondriale et l&#39;apparence de diverses vésicules autophagie liés au niveau cellulaire, ainsi que l&#39;arrestation embryonnaire et larvaire, retard de développement, et une perturbation généralisée de l&#39;environnement de repliement des protéines au niveau de organismal. Étonnamment, le domaine de prion cellulaire présente une toxicité cellulaire autonome et non autonome, affectant les tissus avoisinants, dans lequel le transgène ne est pas exprimé. En outre, le transport vésiculaire du domaine des prions dans et entre les cellules est surveillée en temps réel &lt;em&gt; in vivo 40. Nous décrivons ici comment examiner prion-like diffusion en C. elegans. Nous allons vous expliquer comment surveiller le transport intra et intercellulaire de vésicules contenant le domaine de prion utilisant time-lapse microscopie à fluorescence. Nous mettrons l&#39;accent sur l&#39;utilisation de capteurs de pliage tissu-spécifiques et exprimée de manière ubiquitaire journalistes de stress pour évaluer les effets cellulaires autonomes cellules autonomes et non sur la forme physique cellulaire. Enfin, nous allons décrire la procédure d&#39;un écran récemment effectué du génome grande interférence ARN (ARNi) pour identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par le prion. En combinaison, ces méthodes peuvent aider à démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire de protéines et de leur toxicité autonome non cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Réactif</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosphères taille étalons 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Lévamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer RNAi</td><td>library Source BioScience LifeSciences&nbsp ;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée Sorvall Legend XTR, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120<réplicateur 96 broches > VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td></td><td>Scionomix&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>HiGro agitateur à incubation haute capacité&nbsp ;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Distributeur de réactifs Multidrop Combi</td>Station de travail automatisée <td>Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44 shaker</td><td>Nouveau-Brunswick</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& action=produits& contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp ;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr> <tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDicône CCD numérique</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>Spinning Disc AF Microscope Confocal&nbsp ;</td><td>Appareil photo Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr> <tr><td>Falcon 4M60 »</td><td>Teledyne Dalsa&nbsp ;</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>Logiciel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopie Automatisation & Logiciel d’analyse d’images</td><td>Dispositifs</td><td></td> moléculaires <td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>Hamamatsu Logiciel d’analyse d’images SimplePCI Meyer</td><td>Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>wrMTrck plugin pour ImageJ</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>C. elegans souches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; rmIs323[myo-3p ::sup35(r2e2) ::rfp]</td><td>Laboratoire</td><td></td><td>Morimoto disponible auprès de notre laboratoire&nbsp ;</td></tr><tr><td>Voir le tableau 1 pour une source pour les souches du capteur de pliage et des rapporteurs</td><td></td><td></td><td></td> de contrainte</tr></tbody></table>

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des métazoaires organisme modèle<em&gt; c. elegans</em

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions sont des particules protéiques auto-propagées non conventionnelles, dépourvues de tout acide nucléique codant. Ces graines protéiques servent de modèles pour la conversion et la réplication de leur isoforme cellulaire bénigne. De plus en plus de preuves suggèrent que de nombreux agrégats de protéines peuvent agir comme des modèles d’autopropagation et corrompre le repliement des protéines apparentées. Bien que les agrégats puissent être fonctionnels dans certaines circonstances, ce processus conduit souvent à la perturbation de l’homéostasie des protéines cellulaires (protéostasie), conduisant finalement à des maladies dévastatrices telles que la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). Les mécanismes exacts de la propagation des prions et de la propagation intercellulaire des agrégats de protéines font encore l’objet d’études approfondies. Pour approfondir ces connaissances, un nouveau modèle de métazoaire chez Caenorhabditis elegans, pour l’expression du domaine prion de la protéine prion cytosolique de levure Sup35, a récemment été établi. Ce modèle de prion offre plusieurs avantages, car il permet une surveillance directe du domaine prion marqué par fluorescence chez les animaux vivants et facilite les approches génétiques. On décrit ici des méthodes pour étudier le comportement des agrégats de protéines et pour identifier les modificateurs de la toxicité induite par les prions à l’aide de C. elegans.

Suivi intercellulaire propagation de protéines prion-like in vivo par imagerie time-lapse Transgénique C. elegans lignes exprimant le domaine des prions sont particulièrement bien adaptées pour l&#39;analyse de certains aspects de protéines prions en forme, par exemple, la transmission de cellule à cellule et la toxicité non autonome cellulaire. La transparence des animaux permet un suivi de fluorescence protéines marquées au sein de l&#39;organism...

La propagation d’agrégats de protéines de type prion est récemment apparue comme étant impliquée dans de nombreuses maladies neurodégénératives. L’objectif de ce protocole est de décrire comment utiliser le nématode C. elegans comme système modèle pour surveiller la propagation des protéines et étudier les phénomènes de type prion.

Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

L’objectif général des expériences suivantes est d’examiner la propagation et la toxicité complexe des protéines de type PreOn en utilisant l’organisme modèle Metazoan C elegance. Ceci est réalisé en surveillant le transport intra et intracellulaire des vésicules contenant la protéine de type PreOn, à l’aide de la microscopie à fluorescence time-lapse. Ensuite, des capteurs de pliage spécifiques aux tissus et un stress exprimé partout.Les rapporteurs sont utilisés pour évaluer les effets autonomes cellulaires et non autonomes sur la fitness cellulaire. Ensuite, un criblage d’ARNi à l’échelle du génome est effectué afin d’identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par PreOn. Le tamis est réalisé en culture liquide en utilisant le battage comme indicateur de toxicité.Enfin, un plugin pour l’image J est utilisé pour quantifier le mouvement de l’élégance C en combinaison. Ces méthodes permettent de démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire des protéines de type PreOn et leur toxicité autonome non cellulaire. Après avoir préparé des lignes transgéniques synchronisées de contrôle de l’élégance de la mer et du domaine PreOn et des tampons 10 %agros, conformément au protocole de texte d’accompagnement, pipetez trois microlitres de 100 nanogrammes de billes de polystyrène et trois microlitres de quatre millimolaires de limassol dans le tampon agros.À l’aide d’un fil de platine, transférez les vers à l’âge souhaité d’une plaque dans la solution et utilisez une lamelle pour couvrir afin d’imager les vers au niveau subcellulaire. Placez une lame dans le support de lame de microscope d’un microscope confocal et utilisez un objectif à huile 63 x ou 100 x 1,4 NA. Ensuite, ouvrez METAMORPH et sélectionnez acquisition multidimensionnelle.Et sous l’onglet principal, cochez les cases Time Lapse et Run Journals. Sous l’onglet Sauvegarde, sélectionnez ou créez le dossier de répertoire pour l’enregistrement des fichiers et attribuez-leur un nom. Sous l’onglet Longueur d’onde, utilisez Yoko quad red ou un éclairage équivalent de l’imagerie MRFP et réglez l’exposition entre 100 et 300 millisecondes et le gain de la caméra entre 100 et 300. Ensuite, sous l’onglet Time lapse, définissez l’intervalle de temps sur une seconde, la durée sur cinq minutes et le nombre de points temporels sur 301.Sous l’onglet journaux. Pour le journal, sélectionnez Un ensemble FC, Z hold et A FC revenir à Z hold pour le type select special deux fois et pour le point initial, sélectionnez le début du point temporel et la fin du point temporel. Une fois la configuration terminée, appuyez sur Acquérir Après cette procédure, d’autres méthodes telles que les applications de suivi des particules peuvent être utilisées afin de mesurer les propriétés dynamiques des spécifications.Après avoir synchronisé les nématodes transgéniques et de type prion et copié les plaques de la bibliothèque d’ARNAI ingérent conformément au protocole texte, incuber des plaques d’ARNi dupliquées à 37 degrés Celsius et 300 tr/min pour utiliser la bactérie HT 15 E coli hébergeant le vecteur vide L 4 4 4 0 comme contrôle. Cultivez-le séparément dans un tube de culture, puis utilisez une pipette multicanaux pour transférer 65 microlitres de la culture dans un quart des puits de 2 96. Plaques à puits avec un poste de travail automatisé contenant une tête multicanaux distribuée.10 microlitres de cinq, millimolaire d’IPTG dilué dans chaque puits des bactéries ARNi et des plaques de contrôle. Refermez-les avant de les laisser incuber pendant trois heures pendant que les bactéries couvent. Mélangez des larves transgéniques de type sauvage et des larves transgéniques L one et un puits tampon M neuf et pipetez cinq à 10 microlitres sur un microscope en verre.Comptez les vers sur une diapositive et calculez le nombre de vers par microlitre. Après l’incubation bactérienne de trois heures, retirez les plaques de l’incubateur et laissez-les revenir à température ambiante pour éviter que la chaleur ne stresse les vers. Ensuite, complétez le tampon M nine avec du cholestérol IPTG et des antibiotiques selon le protocole textuel.Et ajoutez le volume approprié de solution de ver transgénique du domaine PreOn à une concentration finale de 15 vers par mélange de microlitres pour une répartition uniforme. Ensuite, versez 50 microlitres dans chaque puits des plaques ARNi et dans les puits de l’une des plaques de contrôle vectorielles vides. Versez une solution de vers de type sauvage dans la deuxième plaque de contrôle.Laissez ensuite toutes les plaques descellées pour permettre l’aération et empêcher la culture liquide de s’évaporer en empilant quatre à cinq assiettes ensemble, en les enveloppant d’une serviette en papier humide suivie d’une feuille d’aluminium. Incuber les plaques à 20 degrés Celsius et 200 tr/min pendant quatre jours. Pour les plaques, utilisez une caméra Falcon four M 60 connectée à un ordinateur avec un moniteur pour dépister visuellement l’augmentation de la raclée par rapport aux animaux transgéniques du domaine PreOn traités par contrôle.Le principal avantage de l’utilisation d’un poste de travail automatisé de manipulation de liquides pour distribuer les vers dans les plaques d’ARNi R est qu’il réduit considérablement la variabilité et le nombre de vers par puits. Pour effectuer un test de motilité sur des plaques solides et valider les clones d’ARNi candidats, les bactéries ARNi cultivent des bactéries ARNi pendant la nuit selon le protocole de texte. Ensuite, utilisez un IPTG millimolaire pour induire l’expression de l’ARN SD pendant trois heures.Utilisez 150 microlitres de chaque clone bactérien ARNi pour ensemencer les plaques NGM préalablement préparées, en les étalant en une fine couche. Laissez les bactéries sécher pendant deux jours à température ambiante dans l’obscurité sous un stéréomicroscope. Déterminer la quantité de vers synchronisés et de suspension comme décrit précédemment et ajouter 25 à 30 L d’une larve dans chaque plaque expérimentale.Incuber les nématodes à 20 degrés Celsius pendant quatre jours jusqu’à ce que les vers atteignent. Le deuxième jour de l’âge adulte, pour quantifier la motilité du ver, allumez la caméra et le logiciel d’imagerie PCI simple. Cliquez sur l’icône de l’appareil photo pour activer le réglage des conditions d’imagerie.Ensuite, configurez la condition d’imagerie comme suit. Réglez le gain sur zéro, le mode d’éclairage sur l’indice haute vitesse sur un et le binning sur deux. Ensuite, cliquez sur en direct et sur l’exposition automatique et ajustez les conditions d’éclairage en déplaçant les miroirs du microscope et les cadrans de luminosité et de contraste.Cliquez sur le temps, scannez et tapez dans un dossier et un nom de fichier définissez le champ Délai sur 20 millisecondes et Arrêt sur Temps sur 30 secondes. Appuyez sur la revue en direct afin de choisir la zone de la plaque à enregistrer. Tapotez ensuite la plaque trois ou quatre fois sur la scène.Confirmez rapidement sa position dans le champ de vision et appuyez sur Démarrer une fois l’enregistrement terminé : cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image et choisissez Exporter la séquence de montage pour exporter le film d’un format CXD vers un fichier A VI. Pour analyser les vidéos de motilité, ouvrez l’image J, choisissez l’onglet plugins, puis choisissez Worm Tracker et sélectionnez Worm Tracker batch, et sélectionnez le répertoire contenant tous les fichiers à analyser dans la fenêtre d’entrée principale de Worm Tracker batch chargez les valeurs d’entrée comme détaillé ici. Une explication de chacun des paramètres se trouve dans les instructions qui accompagnent le plugin.Cliquez sur OK et laissez l’analyse de mouvement s’exécuter. Enfin, pour conserver les résultats, confirmez que toutes les traces détectées proviennent de l’élégance réelle de la mer et éliminez les artefacts. Ouvrez les fichiers TXT créés pour chaque film et copiez les informations dans un fichier de logiciel d’analyse de données.Ouvrez les étiquettes des fichiers zip créés et exécutez les étiquettes TIFF résultantes pour vérifier et éliminer manuellement les fausses traces de vers. Yesper Peterson, un ancien postdoctorant dans le laboratoire, a eu l’idée du traqueur de vers comme substitut à notre évaluation manuelle de CL Elegance motil, qui est une lecture de la toxicité. Le traqueur de vers nous permet de faire ces expériences de manière automatisée, sans biais de l’utilisateur, tout en évaluant plus de conditions dans un laps de temps plus court à l’aide de l’imagerie en accéléré.L’appel d’offres a marqué R deux, E, deux, qui s’accumule dans les vésicules tubulaires, a été vu transporté à l’intérieur et entre les cellules par coex exprimant un capteur de repliement ou un rapporteur de stress. Avec la cellule protéique de type PreOn, les effets autonomes et non autonomes peuvent être évalués. L’expression de R deux E deux dans les cellules musculaires conduit à un début plus précoce de l’agrégation de Q 44 dans l’intestin, révélant que R deux E deux a des effets autonomes non cellulaires sur la protéostasie co-expression de R deux E deux Avec le SOD trois PGFP Le rapporteur de stress oxydatif transcriptionnel conduit à une régulation positive du rapporteur dans différents tissus, démontrant que le domaine PreOn induit une réponse au stress oxydatif non cellulaire de manière autonome en suivant le criblage de l’ensemble du génome.Ce film démontre que l’imagerie haute résolution et la visualisation sur l’écran de l’ordinateur permettent de filtrer un quart d’une plaque simultanément Une fois maîtrisés, ces protocoles de dépistage peuvent être réalisés en 12 tours de 25 plaques par session. Si deux séances sont effectuées par semaine, l’ensemble de la banque d’ARNi peut être dépisté dans un délai de six semaines. Le traqueur de vers a été utilisé pour quantifier la motilité de l’élégance C, comme on le voit ici.Worm Tracker convertit une vidéo originale en un format binaire et chaque ver se voit attribuer une piste. Les vidéos traitées peuvent être visionnées avec des pistes superposées pour éliminer manuellement tous les artefacts. Le paramètre Longueurs de corps par seconde se normalise pour les différences de taille potentielles. Nématodes.Cette méthode a permis d’identifier 35 suppresseurs de la toxicité induite par PreOn qui ont augmenté le phénotype de motilité à au moins 133 % et jusqu’à 256 % par rapport aux vers témoins traités. Lors de la location du traqueur de vers, il est important de ne pas oublier de vérifier manuellement l’obtention des traces de vers. Le logiciel fait un excellent travail d’identification des vers, mais il arrive que l’arrière-plan soit identifié par erreur comme étant celui d’un animal.Par conséquent, n’oubliez pas de vérifier vos vidéos après avoir exécuté un traqueur de vers sur celles-ci. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies neurodégénératives, telles que la capacité d’une certaine protéine de lien avec la maladie de se propager d’une cellule à l’autre, ou s’il existe un lien entre la transmission intercellulaire et la toxicité complexe de ces protéines. Enfants.

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Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

Cette vidéo montre la procédure d’imagerie in vivo de C. elegans exprimant des protéines de type prion marquées avec une protéine fluorescente rouge. Le protocole consiste à immobiliser les nématodes sur un tampon d’agarose pour une microscopie confocale en accéléré, révélant l’agrégation et le transport des protéines à l’intérieur et entre les cellules. Cette technique est cruciale pour étudier l’agrégation des protéines liées aux maladies neurodégénératives.

Imagerie time-lapse pour surveiller la propagation transcellulaire de protéines de type prion dans les nématodes transgéniques

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A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

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Caenorhabditis elegans comme système modèle pour la découverte de composés bioactifs contre la neurotoxicité médiée par les polyglutamines

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