Name: Préparation et caractérisation des SDF-1α-chitosane-Sulfate de Dextran nanoparticules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Découvrez la préparation et la caractérisation de nanoparticules SDF-1α-chitosane-sulfate de dextran pour la thérapie cellulaire. Cette méthode évalue la taille, le potentiel zêta et l'activité biologique du facteur d'homing.

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Ce travail a été financé par des subventions du NIH: HL671795, HL048743 et HL108630.

1. Préparation de SDF-1α Glycan nanoparticules En raison de la fin de la livraison in vivo, stériliser tous les récipients, pipettes et embouts utilisés dans la préparation. <ol><li> Préparer les solutions d&#39;achat d&#39;actions suivantes dans UltraPure Eau: 1% de sulfate de dextran; 1 M NaOH (stérile filtrée par une membrane PES); 0,1% de chitosane à 0,2% d&#39;acide acétique glacial (0,8 filtre à travers des filtres de 0,22 um et de façon consécutive et ajuster le pH à 5,5 avec du NaOH après); ZnSO 4 0,1 M; 15% de mannitol; et 0,92 mg / ml SDF-1α (stockée en aliquotes à 80 ° C, et maintenu à 4 ° C, une fois décongelés). </li><li> Stériliser les solutions mères de 0,22 um membranes filtrantes. Évaluer les niveaux d&#39;endotoxines dans la solution préparée avec dosage lysat d&#39;amibocytes de limule (LAL) gel de caillot. Veiller à ce que les niveaux sont &lt;0,06 EU / ml. </li><li> Ajouter 0,18 ml UltraPure eau pour un flacon en verre de 1,5 ml contenant une barre d&#39;agitation magnétique. Réglez la vitesse d&#39;agitation à 800 tpm. Ajouter 0,1 ml 1%le sulfate de dextrane et agiter pendant 2 min. Ajouter 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml SDF-1α solution) et agiter pendant 20 min. </li><li> Ajouter 0,33 ml 0,1% goutte à goutte de chitosane et remuer pendant 5 min. Modifier la vitesse d&#39;agitation au maximum et ajouter 0,1 ml de 0,1 M de ZnSO 4 lentement avec une seringue 0,1 ml (plus de 1 min). </li><li> La vitesse d&#39;agitation revenir à 800 tpm et remuer pendant 30 min. Ajouter 0,4 ml 15% de mannitol et remuer pendant 5 min. Transférer le mélange réactionnel dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. Remarque: La présence de mannitol facilite la remise en suspension des particules après centrifugation. En fonction de la compacité de la pastille, la concentration en mannitol peut varier de 0% à 5%. Remise en suspension des particules après chaque centrifugation est essentielle pour éviter des agrégats dans la suspension finale. </li><li> Aspirer le surnageant et utiliser une pipette pour enlever la dernière goutte de liquide lentement. Ajouter 0,2 ml 5% de mannitol. Suspendre le culot avec 0,5 ml, 29 G neeseringue dle. Ajouter 1 ml 5% de mannitol. Centrifuger à 16 000 g pendant 15 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.6. </li><li> Aspirer le surnageant. Reprendre le culot dans 0,2 ml 5% de mannitol. Conservez la suspension de particules à 4 ° C. Remarque: La suspension de particules peut également être conservé congelé à -80 ° C ou lyophilisé. Dont 5% de mannitol dans la suspension est essentiel pour empêcher l&#39;agrégation des particules après congélation et décongélation ou après lyophilisation et réhydratation. Le mannitol peut être éliminé par centrifugation de la suspension après le stockage. </li></ol> 2. Mesure de la taille des particules et potentiel Zeta La taille des particules et le potentiel zêta sont analysées par diffusion de lumière dynamique et électrophorétique diffusion de la lumière, respectivement, avec un analyseur de particules indiqué dans la liste de matériaux. <ol><li> Définissez les paramètres suivants pour la mesure de la taille des particules: temps d&#39;accumulation: 70; Répéter fois: 4; Température: 25 ° C;Diluant: eau; réglage de l&#39;intensité: auto. </li><li> Diluer l&#39;échantillon SDF-1α-DS-CS avec de l&#39;eau (10 dilution). Charger 100 pl de l&#39;échantillon dans une cuvette UV jetable tel qu&#39;une cuvette Eppendorf. Insérer la cuve dans le porte-cellule. Attendez que le réglage de l&#39;intensité pour atteindre &quot;Optimum&quot; (~ 10 000 cps). Lancer l&#39;acquisition de données. </li><li> Une fois la mesure terminée, enregistrer les résultats de cumulants diamètre (nm) et l&#39;indice de polydispersité. La moyenne des résultats obtenus à partir de chacune des quatre lectures répétées et calculer l&#39;écart-type. </li><li> Charge 500 ul de l&#39;échantillon de particules dilué 10 fois à une cellule d&#39;écoulement pour la mesure du potentiel zêta. Définissez les paramètres suivants pour la mesure: temps d&#39;accumulation: 10; Répéter fois: 5; Température: 25 ° C; Diluant: eau; réglage de l&#39;intensité: auto. Consigner les résultats de la potentiel zêta (mV). Moyenne, le résultat obtenu par chacune des cinq lectures répétées, et calculer la norme deviation. </li></ol> 3. Quantification des SDF-1α dans les particules <ol><li> Diluer forme libre SDF-1α à des concentrations de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 et 0,05 mg / ml dans un tampon d&#39;échantillon Laemmli 1.3x. Diluer 6 pi échantillons SDF-1α-DS-CS avec 40 ul 1.3x tampon d&#39;échantillon Laemmli. (Préparer 4x Laemmli stocks tampon contenant 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% de SDS, 40% de glycérol, 0,05 mg / ml de bleu de bromophénol, et 8% de 2-mercaptoéthanol. Divisez la solution mère dans de petites fractions et de garder à -20 ° C à usage unique.) </li><li> Chauffer les échantillons à 100 ° C pendant 10 min. Vortex les échantillons deux fois (chacun pendant 10 secondes à la vitesse maximale) pendant le temps de chauffage de 10 min pour dissocier les particules complètement. Refroidir les échantillons à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 10 000 g pendant 0,5 à 1 min pour faire baisser le condensat de l&#39;eau. Vortex à nouveau pour bien mélanger. Remarque: À ce stade, la solution de l&#39;échantillon doit être clair sans précipité visible présente. </li><li> Charge 10 &amp;# 181; l &#39;échantillon / puits d&#39;un gel de SDS à 4-20%. Exécutez électrophorèse à 200 V pendant 20 min. Colorer le gel avec Coomassie protéines bleuissement. </li><li> Examiner la densité de la bande de protéine de SDF-1α en utilisant un logiciel d&#39;imagerie et d&#39;analyse de densitométrie moléculaire. Calculer la quantité de SDF-1α dans les particules contre une courbe standard construite aux normes SDF-1α gratuits. </li></ol> 4. Dosage de libération in vitro <ol><li> Mélanger des particules de glycane SDF-1α avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium et magnésium (D-PBS) à un rapport 1: 1 (v / v). </li><li> Divisez la suspension de particules dans 0,05 ml aliquotes dans 1,5 ml tubes. Charger les échantillons au fond des tubes. Éviter l&#39;introduction de bulles d&#39;air ou de troubler la surface du liquide. Sceller le haut des tubes avec du parafilm. Remarque: Ce faisant, le liquide reste au fond lors de la rotation de haut en bas sur le mélangeur ultérieur du tube. </li><li> Tournez les tubes à 37 ans &amp;# 176; C sur une rotation Micro-Tube Mixer. Enlever des parties aliquotes des tubes aux moments désignés et centrifuger les échantillons immédiatement à 16 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Séparer les surnageants et granulés, et reconstituer le culot avec 0,05 ml de D-PBS. Conserver les échantillons à -20 ° C. Après que tous les échantillons sont prélevés, examiner les surnageants et culots sur un gel de SDS comme décrit ci-dessus. </li></ol> 5. Migration Assay Ce test mesure l&#39;activité chimiotactique des SDF-1α. Interaction de SDF-1α avec son récepteur (CXCR4) sur la surface de la cellule provoque la migration de la cellule en direction du gradient SDF-1α. Dans ce dosage, les cellules sont chargées dans un puits supérieur (séparés par une membrane semi-perméable à partir d&#39;un puits inférieur) solution SDF-1α et dans une bien moindre. <ol><li> Diluer SDF-1α (libre ou liée à la particule forme) avec le tampon de migration (milieu RPMI-1640 contenant 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin) dans un trois-fold dilution en série à des concentrations finales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, et 0,05 ng / ml. </li><li> Ajouter 0,6 ml de la solution SDF-1α dilué ou tampon de migration uniquement (contrôle négatif) à un puits dans la plaque de 24 puits. Ajouter 0,57 ml de tampon de migration vers un puits (contrôle de la cellule d&#39;entrée). Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Placer un perméable insert de culture cellulaire tel que Transwell (taille des pores 5 um, diamètre 6,5 mm) au-dessus du puits inférieur. Charge 0,1 ml des cellules de Jurkat (5 × 10 5) dans l&#39;insert Transwell. Chargez 0,03 ml de cellules directement à la commande de cellules d&#39;entrée ainsi. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 heures dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Retirez les inserts Transwell. Transférer les cellules qui ont migré vers les puits inférieurs à un tube 4 ml de polystyrène. Comptez le nombre de cellules ayant migré avec un cytomètre de flux. </li><li> Calculer la migration en pourcentage du nombre de cellules d&#39;entrée (nombre de cellules dans le contrôle de la cellule d&#39;entrée et x 100/30) après soustraction des nombres dans negative contrôles (cellules ayant migré dans les puits contenant tampon de migration uniquement). </li></ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
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<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Comme mentionné ci-dessus, les nanoparticules DS-CS sont formés par neutralisation de la charge entre le polyanion (DS) et de polycation (CS) molécules. Étant donné que l&#39;interaction de charge se produit facilement pendant la collision moléculaire, la concentration des solutions de polymère et la vitesse d&#39;agitation au cours du mélange est critique pour la taille des particules résultantes. Une tendance générale est que plus dilué DS et CS solutions 15 et le résultat de la vitesse d&#39;agitation plus...

Sulfate de dextran (DS) et le chitosan (CS) sont des polysaccharides avec plusieurs groupes sulfate chargés négativement substitués (dans DS) ou des groupes aminés chargés positivement (désacétylés CS). Lorsqu&#39;il est mélangé à une solution aqueuse, les deux polysaccharides forment des complexes polyélectrolytiques par des interactions électrostatiques. Les complexes résultants peuvent former de gros agrégats qui seront phases séparées de la solution aqueuse (précipités), ou de petites particules qui sont dispersables dans l&#39;eau (colloïdes). Les conditions spécifiques qui contribuent à ces résultats ont été largement étudiées et ont été résumés et illustrés en détail dans une étude récente 1. Parmi ces conditions, deux conditions de base pour la production de particules dispersibles dans l&#39;eau sont les polymères de charges opposées doivent 1) ont une masse molaire sensiblement différente; et 2) être mélangés dans un rapport non stoechiométrique. Ces conditions permettront aux segments polymères complexés charge neutre produites par la chargeneutralisation de séparer et de former le noyau de la particule, et le polymère en excès pour former la coque externe 1. Les particules glycanes décrites dans ce protocole sont destinés à une administration pulmonaire, et sont conçus pour être nette chargé négativement, et de dimensions nanométriques. La charge de surface négative réduit la probabilité d&#39;absorption cellulaire des particules 2,3. Les particules de dimension nanométrique de faciliter le passage à travers les voies aériennes distales. Pour atteindre cet objectif, la quantité de DS utilisé dans cette préparation est supérieure à CS (rapport pondéral 3: 1); et de haute masse moléculaire DS (moyenne en poids MW 500 000) et de faible poids moléculaire CS (gamme de 50 à 190 MW kDa, 75-85% désacétylé) sont utilisés. SDF-1α est un facteur de ralliement de cellules souches, qui exerce la fonction de référencement à travers son activité chimiotactique. SDF-1α joue un rôle important dans la prise d&#39;origine et le maintien des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, et dans le recrutement de progecellules Nitor à tissus périphériques à la réparation des lésions de 4,5. SDF-1α a un site de liaison à l&#39;héparine dans la séquence de la protéine, ce qui permet à la protéine de se lier à l&#39;héparine / sulfate d&#39;héparane, former des dimères, être protégés contre la protéase (CD26 / DPPIV) inactivation, et d&#39;interagir avec des cellules cibles par l&#39;intermédiaire des récepteurs de surface cellulaire 6-8. DS a des propriétés structurelles similaires à celles de l&#39;héparine / héparane-sulfate; Ainsi, la liaison du SDF-1α pour DS serait similaire à celui de ses ligands polymères naturels. Dans le protocole suivant, nous décrivons la préparation de nanoparticules SDF-1α-DS-CS. Les procédures représentent l&#39;une des formules qui ont été précédemment étudiés 9. Le protocole est à l&#39;origine adapté d&#39;une enquête de nanoparticules VEGF-DS-CS 10. Une petite préparation à grande échelle est décrite, qui peut être facilement mise à l&#39;échelle avec les mêmes solutions d&#39;achat d&#39;actions et les conditions de préparation. Après la préparation, les particules sont caractérisées by examiner leur taille, le potentiel zêta, degré d&#39;incorporation SDF-1α, in vitro temps de libération, et l&#39;activité du SDF-1α incorporé.

<table><tbody><tr><td>Sulfate de dextran</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosane, faible poids moléculaire</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de zinc heptahydraté</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Eau UltraPure&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha ;</td><td>Préparé selon la référence 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, membrane PES 0,22&nbsp ; &#956 ; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Micro-barres d’agitation magnétiques (2&nbsp ; x&nbsp ; 7&nbsp ; mm)</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Kit de flacons en verre ; SUN-SRi</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de particules Delsa Nano C&nbsp ;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash ; 20 % Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Bleu Teinture Protéinée Sans Danger</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Imageur moléculaire VersaDoc MP 4000 Système</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Supports perméables</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Cytomètre</td><td>en flux BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus kit</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et caractérisation des sdf-1α-chitosane-sulfate de dextran nanoparticules

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

<classe p='jove_content'>Le chitosane (CS) et le sulfate de dextran (DS) sont des polysaccharides chargés (glycanes), qui forment des nanoparticules à base de complexes polyélectrolytiques lorsqu’ils sont mélangés dans des conditions appropriées. Les nanoparticules de glycane sont des vecteurs utiles pour les facteurs protéiques, qui facilitent l’administration in vivo des protéines et maintiennent leur rétention dans le tissu ciblé. Les complexes polyélectrolytiques glycanes sont également idéaux pour l’administration de protéines, car l’incorporation est effectuée dans une solution aqueuse, ce qui réduit la probabilité d’inactivation des protéines. Les protéines avec un site de liaison à l’héparine adhèrent facilement au sulfate de dextran et sont, à leur tour, stabilisées par la liaison. Ces particules sont également moins inflammatoires et toxiques lorsqu’elles sont délivrées in vivo. Dans le protocole décrit ci-dessous, le SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), un facteur de retour des cellules souches, est d’abord mélangé et incubé avec du sulfate de dextran. Le chitosane est ajouté au mélange pour former des complexes de polyélectrolytes, suivi de sulfate de zinc pour stabiliser les complexes avec des ponts de zinc. La taille (diamètre) et la charge de surface (potentiel zêta) des particules SDF-1α-DS-CS résultantes sont mesurées. La quantité de SDF-1α incorporée est déterminée, suivie de mesures de son taux de libération in vitro et de son activité chimiotactique sous forme liée aux particules.

La taille et le potentiel zéta des particules SDF-1α-DS-CS préparés sont déterminées avec un analyseur de particules. La figure 1 montre l&#39;analyse de la mesure de la taille. A partir des résultats obtenus à partir des cumulants quatre mesures répétées, le diamètre hydrodynamique moyen des particules SDF-1α-DS-CS est 661 ± 8,2 (nm) et la polydispersité est de 0,23 ± 0,02. Le résultat de la mesure du potentiel zêta est représenté sur la Figure 2. A partir des cinq mesures répétées, le...

L’objectif de ce protocole est d’incorporer SDF-1α, un facteur de guidage des cellules souches, dans des nanoparticules de sulfate-chitosane de dextran. Les particules résultantes sont mesurées pour leur taille et leur potentiel zêta, ainsi que pour le contenu, l’activité et le taux de libération in vitro de SDF-1α à partir des nanoparticules.

Préparation et caractérisation des SDF-1α-chitosane-Sulfate de Dextran nanoparticules

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de préparer et de caractériser des nanoparticules de SD F1 Alpha Chias et de sulfate de dextrane. La préparation des nanoparticules est réalisée en mélangeant d'abord le facteur d'adressage des cellules souches, le facteur stromal dérivé un alpha ou S df un alpha, avec du sulfate de dextrane afin de permettre la liaison au glycan chargé négativement. Dans une deuxième étape, l'ozan, un glycan chargé positivement, est ajouté au mélange, formant un complexe polyélectrolytique avec le sulfate de dextrane.Ensuite, du sulfate de zinc est ajouté afin de stabiliser les complexes grâce à des ponts de zinc. La particule obtenue possède un cœur dense entouré par une couche négativement chargée. La taille et le potentiel zêta des particules sont ensuite mesurés, ainsi que la teneur et l'activité de S df one alpha dans les nanoparticules. Le principal avantage des nanoparticules glycaniques SDF one alpha est que la SDF one alpha incorporée est entièrement active sans être libérée des particules.Par conséquent, les particules pourraient être utiles comme signal hermine stationnaire dans la thérapie par cellules souches. Pour commencer, préparez des solutions mères comme décrit dans le protocole écrit et stérilisez-les à l’aide de membranes filtrantes de 0,22 micron. Évaluez les niveaux d’endotoxines dans la solution préparée à l’aide du test de coagulation au lysat de cellules d’ameuba ulu.Veillez à ce que les niveaux soient inférieurs à 0,06 unité d'endotoxine par millilitre. Ensuite, ajoutez 0,18 millilitre d'eau ultrapure dans un flacon en verre de 1,5 millilitre contenant une barre d'agitation magnétique. Réglez la vitesse d'agitation à 800 tr/min, puis ajoutez 0,1 millilitre de sulfate de dextrane à 1 % et mélangez pendant deux minutes.Ajouter 0,08 milligramme de SD F1 alpha et agiter pendant 20 minutes. Ajouter goutte à goutte 0,33 millilitre de 0,1 % tizen et agiter pendant cinq minutes. Changer la vitesse d'agitation à la valeur maximale et ajouter lentement 0,1 millilitre de sulfate de zinc à l'aide d'une seringue étanche aux gaz.Ramener la vitesse d'agitation à 800 tr/min et agiter pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 0,4 millilitre de mannitol à 15 % et agiter après cinq minutes. Transférer le mélange réactionnel dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre et centrifuger à 16 000 g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après la centrifugation, aspirez le surnageant et utilisez une pipette pour éliminer la dernière goutte de liquide. Ajoutez lentement 0,2 millilitre de mannitol à 5 % et resuspendez le culot à l’aide d’une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille de calibre 29. Ajoutez ensuite un millilitre supplémentaire de mannitol à 5 % avant de procéder à la centrifugation.Une seconde fois à 16 000 ×g pendant 15 minutes. Après avoir répété la centrifugation de la suspension de resuspension, aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans 0,2 millilitre de mannitol à 5 %. La taille des particules et le potentiel zêta sont analysés respectivement par diffusion dynamique de la lumière et diffusion électrophorétique de la lumière.Pour commencer, sélectionnez une procédure opérationnelle dans la liste des POP, qui contient les paramètres pour la mesure de la taille des particules par diffusion dynamique de la lumière. Comme indiqué dans le protocole textuel, diluez l'échantillon de particules alpha SD F1 avec de l'eau. Ensuite, chargez 100 microlitres de l'échantillon dans une cuve UV jetable Q Vet, telle qu'une Einor Q Vet.Insérez la cuvette Q dans le porte-échantillon et attendez que l'ajustement de l'intensité atteigne l'optimum avant de commencer l'acquisition des données. Une fois la mesure terminée, enregistrez les résultats cumulés de diamètre et d'indice de polydispersité. Faites la moyenne des résultats obtenus à partir des quatre lectures répétées et calculez l'écart type pour la mesure du potentiel zêta par diffusion de la lumière électrophorétique.Chargez 500 microlitres de l'échantillon de particules dilué dix fois dans la cellule d'écoulement. Sélectionnez un protocole opératoire dans la liste des procédures normalisées pour le potentiel zêta, qui contient les paramètres de mesure indiqués dans le protocole écrit. Enregistrez les résultats du potentiel zêta.Ensuite, faites la moyenne des résultats obtenus à partir des cinq lectures répétées et calculez l'écart type. Chauffez les échantillons dilués d'alpha SD F1 libre et liée aux particules dans du tampon d'échantillonnage laly à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Vortexez les échantillons deux fois pendant le chauffage de 10 minutes afin de dissocier complètement les particules ; après refroidissement des échantillons à température ambiante pendant deux minutes, centrifugez à 10 000 ×g pendant 0,5 à une minute pour faire tomber le condensat d'eau, puis vortexez à nouveau pour bien mélanger.À ce stade, la solution d'échantillon doit être limpide, sans précipité visible. Ensuite, charger 10 microlitres d'échantillon par puits sur un gel de sulfate SDS (ESAL) au sodium de 4 à 20 %. Faire migrer l'électrophorèse à 200 volts pendant 20 minutes avant de colorer le gel avec la coloration protéique au bleu kumasi.Examinez la densité des bandes protéiques de SDF1α à l’aide d’un imageur moléculaire et d’un logiciel d’analyse de densitométrie. Calculez la quantité de SDF1α dans les particules en vous appuyant sur une courbe standard établie à l’aide d’étalons libres de SDF1α afin de réaliser le test de libération in vitro : mélangez les particules de glycanes de SDF1α avec du tampon salin phosphate docos (DPBS) sans calcium ni magnésium, ou du DPBS, selon un rapport un pour un. Répartissez la suspension de particules en aliquots de 0,05 millilitre dans des tubes de 1,5 millilitre.Chargez les échantillons jusqu'au fond des tubes. Évitez d'introduire des bulles d'air ou de perturber la surface du liquide. Scellez le haut des tubes avec du paraform.Ensuite, faire tourner les tubes à 37 degrés Celsius sur un mélangeur rotatif pour microtubes. Prélever des aliquotes des tubes aux moments indiqués et centrifuger immédiatement les échantillons à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Séparer les surnageants et les culots.Ensuite, reconstituez le culot avec 0,05 millilitre de DPBS. Une fois tous les échantillons recueillis, analysez les surnageants et les culots sur un gel SDS. Comme précédemment, ce test mesure l'activité chimiotactique de S df.Une interaction alpha de S df une alpha avec son récepteur provoque la migration de la cellule vers le gradient de SD F1 alpha. Commencez par diluer la forme libre ou liée à des particules de SD F1 alpha avec du tampon de migration selon des dilutions sérielles par trois jusqu'aux concentrations finales indiquées dans le protocole du texte. Ajoutez 0,6 millilitre de la solution de SD F1 alpha diluée dans une cavité de la plaque 24 puits pour le témoin négatif.Procédez de la même manière pour le tampon de migration, puis ajoutez 0,57 millilitre de tampon de migration dans un puits pour le témoin de cellules d'entrée. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez un insert perméable pour culture cellulaire, tel qu'un transwell, au-dessus du puits inférieur, et chargez 0,1 millilitre de cellules jerk hat dans l'insert transwell.Ensuite, chargez directement 0,03 millilitres de cellules dans la commande d'entrée des cellules. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, retirez les inserts de culture cellulaire.Transférez les cellules ayant migré vers les puits inférieurs dans un tube en polystyrène de quatre millilitres. Comptez les cellules migrées à l’aide d’un cytomètre en flux. Calculez enfin la migration en pourcentage du nombre initial de cellules, après soustraction des valeurs obtenues dans les contrôles négatifs.On voit ici l'analyse de la mesure de la taille des particules de dextrane sulfate SD F1 alpha ozan. Le résultat CUMUL indique un diamètre hydrodynamique des particules de 671 nanomètres et une polydispersité de 0,24. Cette capture d'écran montre l'une des cinq mesures répétées du potentiel zêta des particules de dextrane sulfate SD F1 alpha ozan.Le potentiel zêta est de -24,7 millivolts. La quantité de S df un alpha dans les particules de S df un alpha sulfate de dextrane ozan est estimée par électrophorèse sur gel SDS. On observe ici un gel SDS coloré au kumasi, avec des étalons de SDF1 alpha, un nanoparticule témoin de sulfate de dextrane kaizan et des échantillons de nanoparticules de SDF1 alpha sulfate de dextrane kaizan chargés.Une courbe standard est établie à partir de l'analyse de densité des bandes du standard SD F1 Alpha. Le calcul de la concentration à partir de la courbe standard indique que la concentration de SDF un alpha dans l'échantillon de nanoparticules de SDF un alpha est de 0,03 milligramme par millilitre. Pour déterminer le taux de libération in vitro de SDF un alpha à partir des nanoparticules, la quantité de SDF un alpha libérée dans le surnageant et la quantité de SDF un alpha liée aux particules dans les culots a été déterminée par coloration au kumasi d'un gel SDS suivie d'une analyse cytométrique. L'activité de SDF un alpha liée aux particules est mesurée par un test de migration et comparée à celle de SDF un alpha libre, comme illustré ici.La migration induite par le SDF-1α lié aux particules atteint le même niveau que celle provoquée par le SDF-1α libre à toutes les concentrations mesurées. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la formulation des particules glycanes-protéines peut être modifiée. Selon l'application spécifique, d'autres protéines peuvent être incorporées et différentes formulations peuvent être utilisées pour faire varier la taille des particules.Nous espérons que cette vidéo a démontré les techniques de base permettant de préparer la collecte de nanoparticules, puis d'effectuer l'analyse fonctionnelle de la SDF-1α incorporée.

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