Préparation et caractérisation des SDF-1α-chitosane-Sulfate de Dextran nanoparticules

L’objectif général de l’expérience suivante est de préparer et de caractériser des nanoparticules de SD F1 Alpha et de sulfate de dextran. La préparation des nanoparticules est réalisée en mélangeant d’abord le facteur de ralliement des cellules souches : le facteur dérivé des cellules stromales un alpha ou S df un alpha avec du sulfate de dextran pour permettre la liaison au glycane chargé négativement. Dans un deuxième temps, l’ozan, un glycane chargé positivement est ajouté au mélange, formant un complexe polyélectrolytique avec du sulfate de dextran.

Ensuite, du sulfate de zinc est ajouté afin de stabiliser les complexes avec des ponts de zinc. La particule résultante a un noyau dense entouré d’une coquille chargée négativement. Les particules sont ensuite mesurées pour leur taille et leur potentiel zêta, ainsi que pour le contenu et l’activité de S df un alpha dans les nanoparticules Le principal avantage des nanoparticules de glycane SDF un alpha est que le SDF one alpha incorporé est entièrement actif sans être libéré des particules.

Par conséquent, les particules pourraient être utiles pour servir de signal herminique stationnaire dans la thérapie par cellules souches. Pour commencer, préparez des solutions mères comme décrit dans le protocole textuel et stérilisez-les à travers des membranes filtrantes de 0,22 micron. Évaluer les niveaux d’endotoxines dans la solution préparée à l’aide d’un test de caillot de gel de lysat de cyte d’amibe ulu.

Assurez-vous que les niveaux sont inférieurs à 0,06 unité d’endotoxine par millilitre. Ensuite, à 0,18 millilitre d’eau ultrapure dans un flacon en verre de 1,5 millilitre contenant une barre d’agitation magnétique. Réglez la vitesse d’agitation à 800 tr/min, puis ajoutez 0,1 millilitre de sulfate de dextran à 1 % et remuez après deux minutes.

Ajouter 0,08 milligramme de SD F1 alpha et remuer pendant 20 minutes. Ajouter 0,33 millilitres de 0,1 % et remuer pendant cinq minutes. Modifiez la vitesse d’agitation au maximum et ajoutez lentement 0,1 millilitre de sulfate de zinc avec une seringue étanche au gaz.

Rétablissez la vitesse d’agitation à 800 tr/min et remuez pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 0,4 millilitre de mannitol à 15 % et remuez après cinq minutes. Transférez le mélange réactionnel dans un tube fuge de 1,5 millilitre et centrifugez-le à 16 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après la centrifugation, aspirez le surnageant et utilisez une pipette pour retirer la dernière goutte de liquide. Ajoutez lentement 0,2 millilitre de mannitol à 5 % et suspendez la pastille avec une seringue à aiguille de calibre 29 de 0,5 millilitre. Ajoutez ensuite un millilitre supplémentaire de manitol à 5 % avant de centrifuger.

Une seconde fois à 16 000 GS pendant 15 minutes. Après avoir répété le processus de centrifugation en suspension Resus, aspirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 0,2 millilitre de mannitol à 5 %. La taille des particules et le potentiel zêta sont analysés respectivement par diffusion dynamique de la lumière et diffusion électrophorétique de la lumière.

Pour commencer, sélectionnez une procédure de fonctionnement dans la liste SOP, qui contient des paramètres pour la mesure de la taille des particules par diffusion dynamique de la lumière. Comme indiqué dans le protocole textuel, diluez l’échantillon de particules alpha SD F1 avec de l’eau. Chargez ensuite 100 microlitres de l’échantillon dans un vétérinaire UV Q jetable tel qu’un Einor Q Vet.

Insérez le Q vet dans le support de cellule et attendez que le réglage de l’intensité atteigne son niveau optimal avant de commencer l’acquisition des données. Une fois la mesure terminée, enregistrez les résultats cumulés du diamètre et de l’indice de polydispersité. Faites la moyenne des résultats obtenus à partir de chacune des quatre lectures répétées et calculez l’écart-type pour la mesure du potentiel zêta par diffusion électrophorétique de la lumière.

Chargez 500 microlitres de l’échantillon de particules diluées dix fois dans la cellule d’écoulement. Sélectionnez une procédure de fonctionnement dans la liste des SOP de potentiel zêta, qui contient les paramètres de mesure répertoriés dans le protocole texte. Enregistrez les résultats du potentiel zêta.

Ensuite, faites la moyenne des résultats obtenus à partir de chacune des cinq lectures répétées et calculez l’écart-type. Chauffer les échantillons dilués de SD F1 alpha libre et lié aux particules dans un tampon d’échantillon à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Vortex les échantillons deux fois pendant les 10 minutes de chauffage afin de dissocier complètement les particules après refroidissement des échantillons à température ambiante pendant deux minutes, la centrifugeuse avait 10 000 G pendant 0,5 à une minute pour faire descendre le vortex de condensat d’eau à nouveau pour bien mélanger.

À ce stade, la solution de l’échantillon doit être claire et ne pas être accompagnée d’un précipité visible. Chargez ensuite 10 microlitres d’échantillon par puits dans un gel ESAL sulfate ou SDS de 4 à 20 % de sodium. Faites une électrophorèse à 200 volts pendant 20 minutes avant de colorer le gel avec une coloration aux protéines kumasi blue.

Examinez la densité de la bande protéique de SD F1 alpha à l’aide d’un imageur moléculaire et d’un logiciel d’analyse densitométrique. Calculez la quantité de S DF un alpha dans les particules par rapport à une courbe standard construite avec des étalons libres SDF un alpha pour effectuer le test de libération in vitro mélangeant des particules de glycanes alpha SD F1 avec un tampon de phosphate docos salin sans calcium et magnésium ou DPBS dans un rapport de un à un. Divisez la suspension de particules en aliquotes de 0,05 millilitre dans des tubes de 1,5 millilitre.

Chargez les échantillons au fond des tubes. Évitez d’introduire des bulles d’air ou de perturber la surface du liquide. Scellez le haut des tubes avec du paraform.

Faites ensuite pivoter les tubes à 37 degrés Celsius sur un mélangeur de microtubes rotatif. Prélever les aliquotes des tubes aux moments prévus et centrifuger immédiatement les échantillons à 16 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius après la centrifugation. Séparez les surnageants et les granulés.

Reconstituez ensuite le granulé avec 0,05 millilitre de DPBS. Une fois tous les échantillons prélevés, examinez les surnageants et les granulés sur un gel SDS. Comme précédemment, ce test mesure l’activité chimiotactique de S df.

Une interaction alpha de S df un alpha avec son récepteur provoque la migration de la cellule vers le gradient alpha SD F1. Pour commencer, diluer sous forme libre ou liée à des particules SD F1 alpha avec un tampon de migration en une dilution en série triple jusqu’aux concentrations finales énumérées dans le protocole de texte. Ajouter 0,6 millilitre de la solution diluée de SD F1 alpha dans un puits de la plaque à 24 puits pour le témoin négatif.

Faites de même pour le tampon de migration uniquement, puis ajoutez 0,57 millilitre de tampon de migration à un puits pour le contrôle de la cellule d’entrée. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, placez un insert de culture cellulaire perméable tel que transwell sur le puits inférieur, chargez 0,1 millilitre de cellules de jerk hat dans l’insert transwell.

Chargez ensuite 0,03 millilitre de cellules directement dans la commande de cellule d’entrée. Bien incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant deux heures dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, retirer les inserts de culture cellulaire.

Transférez les cellules qui ont migré vers les puits inférieurs dans un tube de polystyrène de quatre millilitres. Comptez les cellules migrées à l’aide d’un cytomètre en flux. Enfin, calculez la migration en pourcentage du nombre de cellules d’entrée après soustraction des nombres dans les contrôles négatifs.

Voici l’analyse de la mesure de la taille des particules de sulfate d’alpha dextran SD F1. Le résultat CUMUL montre que le diamètre hydrodynamique de la particule est de 671 nanomètres et que la polydispersité est de 0,24. Cette capture d’écran montre l’une des cinq mesures répétées du potentiel zêta des particules de sulfate d’ozan de brin SD F1 alpha DExT.

Le potentiel zêta est de moins 24,7 millivolts. La quantité de S df un alpha dans les particules de sulfate de dextran S df un alpha est estimée par électrophorèse sur gel SDS. Voici un gel SDS coloré au kumasi avec des échantillons de nanoparticules de contrôle de sulfate de dextran de souche alpha SD F1 alpha et de nanoparticules de kaizan de sulfate d’alpha dextran SD F1.

Une courbe standard est construite à partir de l’analyse de la densité des bandes SD F1 Alpha Le calcul de la courbe standard indique que la concentration S DF un alpha dans l’échantillon de nanoparticules SD un alpha est de 0,03 milligramme par millilitre. Pour déterminer le taux de libération in vitro de S DF 1 alpha à partir des nanoparticules, la quantité de S DF 1 alpha libérée dans le supernat et la quantité de sdf 1 alpha liée aux particules dans les pastilles a été déterminée par coloration kumasi d’un gel SDS suivie d’une analyse cytométrique. L’activité de la particule liée à la particule S DF un alpha est mesurée par un test de migration et, par rapport à cela, un SDF libre un alpha, comme indiqué ici.

Le SDF un alpha lié à la particule induisait la même quantité de migration qu’un f libre DF un alpha à toutes les concentrations mesurées. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la formulation des particules de protéine de glycane peut être modifiée. En fonction de l’application spécifique, d’autres protéines peuvent être incorporées et différentes formulations peuvent être utilisées pour faire varier la taille des particules.

Nous espérons que cette vidéo présentera les techniques de base en préparation de la collecte des nanoparticules, puis l’analyse fonctionnelle du SDF one alpha incorporé.