Name: Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Découvrez la microscopie à force de sonde Kelvin pour cartographier le potentiel de surface des bactéries à l'échelle nanométrique. Cette méthode permet d'étudier l'adhérence microbienne sur différents substrats avec une précision inégalée.

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Les auteurs remercient sincèrement le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, le ministère de la Recherche et de l’Innovation de l’Ontario et la Fondation canadienne pour l’innovation pour le financement de cette étude.

1. Préparation de la verrerie et des cultures <ol><li> Avant de procéder à cette expérience, préparer la gélose au sang de mouton à 5% (SBA) des plaques pour la culture SARM. Incuber les plaques SBA pendant 24 heures à 37 ° C. Après ce temps, simples, des colonies bien isolées doivent être présents à être utilisé pour des inoculations ultérieures dans des milieux liquides. Magasin strié plaques SBA avec des colonies isolées à 4 ° C pendant 1 à 2 mois. REMARQUE: Les plaques de gélose au sang de mouton viennent dans les paquets déjà créés contenant entre 20 à 25 plaques sur la base du fabricant, et sont généralement constitués d&#39;une base de gélose trypticase soja avec addition de 5% en poids / sang de v moutons. </li><li> Ajouter 500 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) supplémenté avec 1% de glucose et 0,1% de NaCl. Après cela, collecter et nettoyer deux tubes à essai en verre. Si couvercles autoclavables sont pas disponibles pour des tubes à essai, utiliser du papier d&#39;aluminium comme un bouchon. Autoclave TSB et des tubes à essai avec une boîte de 1 ml embouts de pipette. </li><li> Sous une enceinte de biosécurité ou près d&#39;une Bunsen brûleur, pipette 5 ml de TSB préalablement autoclave dans des éprouvettes autoclave. Soyez attentif à ce que suffisamment de temps a été donné de laisser le BST et des tubes à essai refroidir à température ambiante. De 5% précédemment plaque SBA strié, inoculer une seule colonie dans 6 ml de bouillon TSB. L&#39;une contiendra SARM, et le second tube de test sera utilisé comme contrôle négatif pour assurer la stérilité. </li><li> Prenez des tubes à essai du BST inoculés et les placer dans un incubateur réciproque pendant 24 heures à 37 ° C et à 200 tpm. Après cette période, la croissance microbienne doit être apparent dans le tube à essai de SARM alors qu&#39;aucune croissance doit avoir eu lieu dans l&#39;éprouvette de contrôle. </li><li> Prélever 1 ml de culture de 24 h à la pipette dans 6 ml de TSB frais. Incuber à 37 ° C pendant 6 heures à 200 tours par minute. </li><li> Pipette 1 ml de sous-culture 6 h dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger 3 min à 850 x g. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml d&#39;H 2 O. désionisée Centrifugeuse, répéter, et remettre en suspension. </li></ol><ol><li> Prendre en acier inoxydable et les disques de l&#39;échantillon de l&#39;AFM d&#39;or (20 mm et 10 mm de diamètre, respectivement) et de nettoyer chaque côté avec 5 ml d&#39;eau désionisée 2 O. Tenez disques échantillons dans la main dominante avec une pince et utiliser la main sous-dominante à la pipette 5 ml de chaque côté de l&#39;échantillon disque. Après avoir lavé deux côtés, disques lieu de l&#39;échantillon dans un bêcher contenant 20 ml de H 2 O déminéralisée suivie par sonication pendant 1 min. </li><li> Après l&#39;utilisation des ultrasons pince pour retirer les disques de l&#39;échantillon du bécher. Placez les disques afin qu&#39;ils se penchent à un angle de 60 ° contre le bord d&#39;une boîte de Petri ouverte sur une serviette en papier. Utiliser le couvercle de la boîte de Petri pour couvrir les disques de séchage. Laissez sécher complètement avant disques procédure. Le temps de séchage peut varier entre 4-8 heures. </li><li> Une fois sec, utilisez une pince pour placer disques d&#39;échantillons dans une boîte de Petri. <ol><li> Eventuellement, fonctionnaliser les surfaces de disques de l&#39;échantillon de toutes matières (par exemple, le collagène, l&#39;acide hyaluronique, des nano-particules d&#39;argent, etc.). </li><li> Pour cette expérience, on utilise la poly-L-lysine pour revêtir la surface du substrat. Pour la poly-L-lysine fonctionnalisation, une pipette de 200 à 400 ul de 0,1% de poly-L-lysine (en H 2 O) sur des disques de l&#39;échantillon, et laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une boîte de Pétri. </li><li> Après 1 heure, utiliser une pince pour maintenir l&#39;échantillon disque, et laver avec 1 ml de H 2 O. déminéralisée Laisser sécher sur du papier absorbant comme décrit dans l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Prenez 2x cellules remises en suspension lavés et plaque de 200 à 400 pi sur des disques d&#39;échantillons dans une enceinte de sécurité biologique. Si les disques d&#39;échantillons sont revêtus de poly-L-lysine, incuber pendant 0,5 heures à température ambiante. </li><li> Après incubation de cellules sur les disques de l&#39;échantillon, laver disques échantillons doucement avec 1 ml de H 2 O. déminéralisée Laissez sécher une nuit avant de disques imagerie. </li></ol> 3. KPFM Imaging NOTE: Pour cette expérience,utiliser une série Agilent 5500 ILM-AFM. <ol><li> Pour commencer AFM, tourner sur l&#39;unité de l&#39;ordinateur avec le contrôleur HEB et MAC III de l&#39;AFM. Logiciel d&#39;imagerie Open AFM (par exemple, d&#39;Agilent PicoView). Veillez à sélectionner d&#39;abord ACAFM ou selon la désignation correcte est sur l&#39;AFM pour l&#39;imagerie en mode intermittent-contact. </li><li> En utilisant des pinces de l&#39;AFM dans la main dominante, et en maintenant le support du clip à ressort ouverte avec la main sous-dominante, placez un cantilever KPFM dans la pièce de tête. Soyez prudent lors de la manipulation et le transfert de la pièce de tête AFM à l&#39;AFM que cet appareil (au moins sur le 5500 ILM-AFM) contient l&#39;unité de cristal piézo fragile qui contrôle X, Y et directionnalités de numérisation Z. REMARQUE: Les cantilevers KPFM utilisés dans ce cas étaient Mikromasch conducteur DPE (à faible bruit) avec cantilevers fréquences de résonance moyenne de 80 kHz et de printemps constantes de 2,7 N / m. Cantilevers avec ces fréquences de résonance et les constantes de printemps ont été choisis en raison de leur facilité d&#39;utilisation.Cantilevers ayant des constantes de ressort et de plus grandes fréquences de résonance plus élevées peuvent également être utilisés pour l&#39;imagerie. </li><li> Charger soigneusement pièce de tête dans le AFM et brancher les fils appropriés (dans ce cas deux fils doivent être branché: la lumière laser et moteur de levage de la scène). </li><li> Aligner le laser sur la pointe du cantilever. Certaines unités contiennent une fonctionnalité de la caméra qui permet un alignement plus facile. Si la fonctionnalité de la caméra ne est pas présent sur l&#39;AFM, alignez sur la pointe cantilever comme décrit suivante: <ol><li> Tourner le bouton dans le sens horaire avant-arrière pour déplacer le laser overtop la puce en porte à faux. Lorsque le laser atteint la puce il sera bloqué et ne sera plus visible. Seulement tournez le bouton à quelques reprises. </li><li> Tournez le bouton avant-sens inverse des aiguilles jusqu&#39;à ce que le spot laser réapparaît. Le laser est maintenant au bord de la puce. </li><li> Tournez le bouton de gauche à droite pour positionner le laser sur le cantilever. Comme le laser passe au-dessus du cantilever il va disparaître et réapparaître in succession rapide. Le spot laser doit être visible dans le couvercle en verre dépoli, où l&#39;unité de photodiode tard asseoir. </li><li> Tournez le bouton avant vers l&#39;arrière vers la gauche pour déplacer le point en bas de la console vers la pointe jusqu&#39;à ce que la tache sur le verre dépoli disparaît. </li><li> Tourner l&#39;avant-à-dos dans le sens horaire que légèrement afin de positionner le laser de sorte qu&#39;il se trouve juste sur la pointe cantilever. Le spot laser réapparaîtra sur le verre dépoli. NOTE: Ce est la méthode de positionnement laser pour la plongée-pension cantilevers. Pour contreforts triangulaires, le processus d&#39;alignement diffère légèrement. </li></ol></li><li> Une fois que le laser est aligné, maintenez le moteur de levage d&#39;étape dans la position &quot;ouverte&quot; pendant 10 secondes afin d&#39;assurer suffisamment d&#39;espace entre le cantilever et de l&#39;échantillon lors de la fixation de l&#39;échantillon à l&#39;AFM. </li><li> Placez l&#39;échantillon sur la scène de l&#39;échantillon de KPFM. Rez de l&#39;échantillon en utilisant un fil de cuivre. Connecter les fils appropriés de l&#39;AFM à l&#39;étape de l&#39;échantillon. Connectez les sTage à l&#39;AFM. Dans la plupart des cas, la scène est maintenu en place grâce à des aimants. </li><li> Dans le logiciel de l&#39;AFM, syntonisez commencer le cantilever puis approche de la pointe cantilever à l&#39;échantillon. Assurez-vous que le temps de stabilisation est fixé à plus de 10 ms, et que les vitesses d&#39;approche ne dépasse pas 2,0 um / sec afin d&#39;éviter des dommages de pointe. </li><li> Une fois que l&#39;extrémité en porte à faux se trouve sur la surface de l&#39;échantillon, sélectionner une taille de la fenêtre de formation d&#39;image et la zone de formation d&#39;image idéale. Optimiser les gains I et P ainsi que le point de sorte que l&#39;imagerie topographique est optimisée de jeu en porte à faux. <ol><li> Une fois l&#39;imagerie topographique est optimisée, tourner sur le module KPFM (FM ou AM, ici, utiliser le mode FM). Il convient de noter que l&#39;imagerie KPFM est très difficile à l&#39;extérieur de 5 um fenêtre d&#39;imagerie x 5 pm. Aussi, pour l&#39;imagerie de KPFM optimale, utilisez une résolution 512 x 512 avec des vitesses de balayage lent (de 0,02 à 0,05 de lignes / sec). </li></ol></li><li> Pour les réglages FM-KPFM (non ACAFM paramètres), réglez le pour cent d&#39;entraînement entre 5 à 10%. Réglez le cantilever frequency comprise entre 1 - 5 kHz avec une largeur de bande de 2 kHz. Réglez I et P gains pour les réglages FM-KPFM à 0,3%. <ol><li> Variez la bande passante du signal et I et P gains entre les surfaces de l&#39;échantillon. Pour optimiser l&#39;imagerie de SP, ajuster encore la bande passante du signal et I et P gains pour obtenir des images optimales. La plage recommandée des gains I et P sont de 0,22 à 0,35%. </li></ol></li><li> Traiter et analyser les images recueillies KPFM aide d&#39;un logiciel de traitement post-image pour recueillir des données de SP. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

KPFM a été utilisé comme une nouvelle technique pour obtenir des données électriques de surface. Il a souvent été utilisé comme une méthode pour examiner la répartition de charge en chimie et n&#39;a que récemment commencé à appliquer pour l&#39;étude des systèmes biologiques sur le micro et nano-échelles. D&#39;après les données recueillies nous avons constaté que les microbes ne semblent pas attacher facilement pour nettoyer les surfaces en acier inoxydable et or, même après 3 heures d&#39;incubation statique. Surface...

Les biofilms produites sur les surfaces de l&#39;équipement et dans les plaies cutanées présentent un problème pour l&#39;industrie médicale que les biofilms sont récalcitrantes à l&#39;enlèvement et peuvent conduire à une augmentation des taux de transmission de la maladie et de la résistance aux antimicrobiens. L&#39;attachement est la première étape dans la formation de biofilm et est l&#39;étape la plus critique en raison de sa réversibilité 3.1. caractéristiques de la surface du substrat jouent un rôle crucial sur l&#39;attachement microbienne. On a montré que des facteurs tels que la dureté de surface, porosité, rugosité, et pour effectuer la fixation hydrophobicité microbienne; Cependant, peu d&#39;études sur le rôle de potentiel de surface de substrat (SP) sur l&#39;adhérence microbienne a été fait 4,5. Les surfaces chargées négativement empêcher la fixation de spores de Bacillus thuringiensis à mica, du silicium, de l&#39;or et 6. Les changements dans le potentiel de membrane cellulaire indiquent des changements dans l&#39;attachement et la motilité cellulaire 5,7. Il a été observé que hom électriquementsurfaces ogeneous plus facilement promouvoir microbienne adhérence 5. Caractérisation du potentiel de surface des bactéries à l&#39;échelle nanométrique peut fournir une nouvelle façon de comprendre la cinétique d&#39;adhérence des bactéries à diverses surfaces, et peut ainsi aider à l&#39;élaboration de stratégies anti-encrassement biologique. Contrairement à d&#39;autres méthodes utilisées pour caractériser les cinétiques électro de bactéries, telles que la diffusion électrophorétique de lumière, le potentiel zêta, et isoélectrique détermination du point, Kelvin microscopie à force de la sonde (KPFM) permet l&#39;examen de cellules individuelles au lieu de cultures entières 8-11. Cela est bénéfique quand on veut comparer cellule-cellule ou biofilm caractéristiques électriques avec une grande précision et de précision. KPFM est un module de microscopie à force atomique (AFM). AFM a été développé comme une conséquence directe de la microscope à effet tunnel (STM) 12. Les premières images publiées en utilisant STM ont été faites par Gerd Binnig et Heinrich Rorhrer en 1982 12 </sup&gt;. Leur invention a pu résoudre structures atomiques par balayage tramé une pointe conductrice forte sur une surface conductrice dans l&#39;air. Les implications de la réalisation des images haute résolution des biologistes qui ont rapidement tenté d&#39;utiliser STM images échantillons séchés de l&#39;ADN, des protéines et des virus 12 excité. STM peut aussi être fait dans les liquides à l&#39;aide de pointes de sonde spécialisés 13. Ceci a été démontré par Lindsay et al., Qui a utilisé STM et AFM de molécules d&#39;ADN d&#39;image dans HClO 4 mM et 10 dans l&#39;eau, sur des électrodes en or 13. KPFM a été démontrée pour déterminer les potentiels de surface des ADN et des protéines et analyse des biomolécules 25 interaction avec des ligands 26. KPFM fonctionne en mesurant la différence de potentiel de contact (CPD) entre une pointe d&#39;AFM cantilever conducteur et un échantillon idéalement conductrice (Figure 1, i) 14,15. Les échantillons ne doivent pas nécessairement être conducteur (ce est-sampl biologiques). L&#39;imagerie peut être effectuée sur le mica, le verre, et des surfaces de silicium (non conductrices) aussi longtemps que la surface non-conductrice est mince et il ya une matière conductrice sous-jacente 6,7. Le DPC est équivalente à la tension potentiel de surface et peut être décrit comme la différence dans les fonctions de travail entre la pointe (pointe de φ) et l&#39;échantillon (échantillon de φ), divisé par la charge de l&#39;électron négatif (- e). Quand une pointe AFM conducteur est amené à proximité d&#39;une surface de l&#39;échantillon (séparés par la distance d), une force électrostatique (F ES) est généré en raison de la différence des énergies de Fermi (figure 1, II, a) 15. À ce stade, les énergies à vide de la pointe et l&#39;échantillon (E v) sont en équilibre et alignés. Sur la pointe apportant plus près de la surface de l&#39;échantillon, la surface de la pointe et l&#39;échantillon entrent en contact électrique et d&#39;agir comme des condensateurs de plaques parallèles (Figure 1, ii, b </strong&gt;) 14,15. Au point, les énergies de Fermi de la surface de la pointe et l&#39;échantillon se alignent, atteignant un équilibre stationnaire (Figure 1, ii, b). La surface de la pointe et l&#39;échantillon sera prélevé et un DPC de V se former à cause d&#39;une différence de E fonctions de v et de travail. Un actes F es sur la zone de contact électrique en raison de la CPD formé de V. Cette force est ensuite annulé par l&#39;application d&#39;un courant continu V externe à l&#39;extrémité qui a la même grandeur que le CPD formé de V (figure 1, ii, c). Cette tension appliquée DC élimine charge de surface dans la zone de contact électrique, et la quantité de V DC nécessaire pour éliminer les es F de V CPD est égal à la différence dans les fonctions de travail entre le SAsurface de mple les pourboires 15. Il convient de noter que la fonction de travail de la pointe est connu et il est fourni par les fabricants. Dans toutes les méthodes de KPFM, une tension alternative (V AC, environ 100 à 500 mV) est également appliqué à la pointe afin de générer des forces électriques oscillants entre la pointe et l&#39;échantillon 14. Cette offre une meilleure résolution lors de la mesure des changements dans V CPD et / ou F es. À cet égard, les changements dans la fréquence ou l&#39;amplitude de l&#39;oscillation électrique peuvent être corrigées par V DC, et la surface cartes de potentiel peuvent être générés. Les données provenant des domaines spécifiques de ces cartes peuvent être analysés plus de fournir des informations sur les caractéristiques topographiques électriques spécifiques. KPFM peut fonctionner en trois modes: (1) Mode de levage, (2) le mode de modulation d&#39;amplitude (AM), et (3) la modulation de fréquence (FM) en mode 14,16. mode Ascenseur était la première incarnation de KPFM. Ascenseur mode se appuie sur une méthode en deux passes dans lequel une pointe oscille est traîné à travers la surface pour obtenir une image topographique. Pour la deuxième passe de la pointe est soulevé une distance préréglée dessus de l&#39;échantillon (de 10 à 100 nm) et numérisé en arrière à travers la même zone. En raison de ce procédé en deux passes, en mode de levage, et par rapport à AM- FM-KPFM, prend le plus long temps d&#39;acquisition d&#39;images. Augmenter la pointe loin de la surface assure que seul longue portée F es est mesurée. En outre, la diaphonie entre la topographie de surface et des mesures de potentiel est découplée au détriment de la résolution latérale et une sensibilité accrues. AM-KPFM améliore la résolution et la sensibilité latérale en utilisant deux fréquences pour mesurer simultanément la topographie de l&#39;échantillon et le potentiel de surface (de balayage en un seul passage) 14. Dans le mode AM, le cantilever est mécaniquement oscille, généralement 5% en dessous de la première fréquence de résonance (f 0), et oscille électriquement (trâce un AC V) à sa deuxième fréquence de résonance (f 1). Changements dans l&#39;amplitude de f 0 conduisent à la production de données topographiques, tandis que les changements dans l&#39;amplitude de f 1, en ​​raison de changements dans es F et V CPD, donnent données de mesure potentiels de surface. f 0 et f 1 du cantilever sont séparés par des fréquences importantes et les énergies qui signalent diaphonie est réduite au minimum 14. Le boîtier électronique de la tête (HEB) de l&#39;AFM sépare les deux signaux pour donner à la fois topographique et données de surface potentiels simultanément dans une analyse. FM-KPFM améliore la résolution encore plus loin que AM-KPFM sur des surfaces biologiques 14. FM-KPFM fonctionne différemment que AM-KPFM en ce qu&#39;elle mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques plutôt que force électrostatique (F ES) 15. Comme mode AM, le mode FM utilise deux fréquences et un singlmécanisme de balayage e-passe d&#39;obtenir des données topographiques et la surface potentiels simultanément 14. En mode FM, le cantilever est mécaniquement oscillait à f 0 et oscillait électriquement à une basse fréquence modifiée (f mod, généralement 1-5 kHz). Sur interactions électrostatiques, f 0 et f mod mix pour produire des bandes latérales f 0 ± f mod. Ces bandes latérales sont très sensibles aux variations de la force électrostatique, et peuvent être séparées de f 0 par l&#39;intermédiaire du HEB de l&#39;AFM. Depuis FM-KPFM mesure les changements dans les gradients de force électrostatiques, la forme sommet de conseils et de son entretien / l&#39;intégrité jouent un rôle critique dans l&#39;ensemble surface de résolution potentielle 14, 15. Surface résolution potentielle en utilisant les modes AM et FM sont de l&#39;ordre de 1 nm latéralement 14 -16. Il convient de noter que l&#39;imagerie KPFM peut être fait dans les liquides non polaires, et plus récemment, a été montré à faire (&lt;10 mm) des liquides polaires faiblement ionique (enKPFM modes en boucle ouverte qui ne nécessitent pas une rétroaction de polarisation, ce qui évite l&#39;application d&#39;une polarisation en courant continu), comme l&#39;eau MilliQ; Toutefois, l&#39;imagerie KPFM n&#39;a pas encore été fait sur ​​des cellules vivantes dans des solutions polaires 17-20. Défis supplémentaires associés à l&#39;imagerie de SP dans un liquide est que les solutions couramment utilisés pour les cellules de maintien (ce est à dire, le tampon phosphate salin) ont des concentrations élevées d&#39;ions mobiles, ce qui conduirait à des réactions de Faraday, la dynamique de la charge induite préjugés, et la diffusion d&#39;ions / redistribution 20. Ainsi, pour cette expérience, des mesures ont été prises à partir de cellules de SARM secs et morts sur acier inoxydable et or surfaces fonctionnalisés poly-L-lysine dans des conditions ambiantes. L&#39;imagerie peut être effectuée dans des conditions atmosphériques ou sous vide sur des échantillons biologiques qui ont été préalablement séchés ou immobilisées sur des surfaces 20. Conditions humides ont également été démontré que l&#39;incidence imagerie KPFM des surfaces 6. Dans cette étude, nous avons utilisé FM-KPFMAFM et d&#39;examiner le rôle de la SP sur la fixation du Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 (SARM) les surfaces en acier inoxydable et or fonctionnalisés poly-L-lysine. SARM a récemment valu le statut de multi-résistante (MDR) &quot;superbactérie&quot; en raison de sa résistance naturelle sélectionnée à de nombreux antibiotiques β-lactamines et les céphalosporines 21. Les infections à SARM sont maintenant plus difficile, difficile, et formidable pour traiter, conduisant à l&#39;utilisation des antimicrobiens plus sévères tels que la vancomycine ou oxazolidinones qui ont des niveaux plus élevés de toxicité chez l&#39;homme, et donc ne peut pas être utilisé comme traitements à long terme 22. L&#39;acier inoxydable a été choisi en raison de sa pertinence médicale et l&#39;utilisation commune comme matière dans les aiguilles hypodermiques, les bassines, les poignées de porte, des éviers, etc. L&#39;or a été utilisé comme un métal comparative. FM-KPFM a été utilisé pour examiner si microbienne SP de la membrane change lors de la fixation des substrats.

<table><tbody><tr><td>Microscope à force atomique 5500ILM</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>Disques d’échantillons métalliques AFM/STM</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Disques d’échantillonnage en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Sondes SPM conductrices DPE (Low-Noise)</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ :DPE-XSC11</td><td>Il y a 4 porte-à-faux revêtus de Pt par puce. Nous avons utilisé le porte-à-faux B pour les expériences.</td></tr><tr><td>PELCO Disques d’éprouvette métallique AFM/STM revêtus d’or</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Disques d’échantillons en or Logiciel</td></tr><tr><td>PicoView Agilent</td><td>Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM Logiciel d’imagerie au microscope à force atomique</td></tr><tr><td>Logiciel Pico Image Software (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Microscope à forces atomiques Logiciel de traitement post-image</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 Micro-centrifugeuse à grande vitesse</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Centrifugeuse utilisée dans les étapes de lavage des cellules pour séparer les cellules (granulés) du milieu</td></tr><tr><td>Gélose de soja trypticase avec 5 % de sang de mouton</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Plaques préfabriquées</td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Se présente sous forme de poudre sèche. Instructions sur la façon de faire venir sur le récipient.</td></tr></tbody></table>

surface de mesure potentielle de bactéries utilisant kelvin probe force microscopy

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

potentiel de surface est une caractéristique physique souvent négligé qui joue un rôle dominant dans l&#39;adhérence des micro-organismes à des surfaces de substrat. Kelvin microscopie à force de sonde (KPFM) est un module de microscopie à force atomique (AFM) qui permet de mesurer la différence de potentiel de contact entre les surfaces à l&#39;échelle nanométrique. La combinaison de KPFM avec AFM permet la génération simultanée de potentiel de surface et des cartes topographiques d&#39;échantillons biologiques telles que des cellules bactériennes. Ici, nous employons KPFM pour examiner les effets de potentiel de surface sur l&#39;adhésion microbienne des surfaces médicalement pertinents, tels que l&#39;acier inoxydable et or. Surface cartes potentiels ont révélé des différences de potentiel de surface pour les membranes microbiennes sur des substrats différents matériels. Un graphe étape hauteur a été généré pour montrer la différence de potentiel de surface à une zone frontière entre la surface du substrat et des micro-organismes. Les variations de potentiel de surface de la membrane cellulaire ont été liés au changements dans le métabolisme cellulaire et la motilité. Par conséquent, KPFM représente un outil puissant qui peut être utilisé pour examiner les changements de potentiel de surface de la membrane microbienne sur l&#39;adhérence à diverses surfaces de substrat. Dans cette étude, nous démontrons la procédure pour caractériser le potentiel de surface des cellules individuelles de Staphylococcus aureus résistant à la méticilline USA100 sur l&#39;acier inoxydable et l&#39;or en utilisant KPFM.

La capacité de mesurer SP utilisant KPFM repose sur le principe que tant la surface de l&#39;échantillon et la pointe de cantilever sont conducteurs dans une certaine mesure. Acier inoxydable et or ont agi comme des surfaces conductrices à laquelle SARM étaient attachés. KPFM images ont été prises de 15 cellules de SARM sur les deux faces avec 512 x 512 résolutions, et des zones de numérisation allant de 5 x 5 um à 10 um x 10. Balayage a été réalisé avec des vitesses de ligne allant de 0,02 lignes / s à 0,05 lignes / se...

Ici, nous présentons un protocole expliquant l’utilisation de la microscopie à force de sonde Kelvin comme outil pour générer des cartes de potentiel de surface à haute résolution à l’échelle nanométrique. Cet outil a été appliqué pour évaluer le rôle du potentiel de surface sur la capacité de liaison des microorganismes aux surfaces du substrat.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer les changements de charge de la membrane cellulaire après l'adhésion à différents substrats matériels. Cela est réalisé en cultivant les micro-organismes dans un milieu riche en nutriments afin d'augmenter leur nombre. Ensuite, les surfaces matérielles auxquelles les micro-organismes adhéreront sont nettoyées et fonctionnalisées pour optimiser les taux d'attachement microbien.Ensuite, les micro-organismes sont ensemencés sur divers substrats matériels afin de permettre l'imagerie par microscopie à force de sonde de Kelvin ou KPFM. Les résultats montrent que le type de matériau du substrat et sa charge intrinsèque influencent l'activité cellulaire, comme en témoignent les modifications de la charge de la membrane cellulaire et de l'adhérence cellulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'électrophorèse, la diffusion de la lumière et la détermination du point isoélectrique, est que la KPFM permet d'examiner la charge de cellules individuelles et de biofilms, plutôt que de cultures ou de colonies entières.Cela est avantageux lorsqu'on souhaite comparer de cellule à cellule ainsi que les caractéristiques électriques des biofilms avec une grande précision et exactitude. Pour commencer, préparez des boîtes de gélose au sang de mouton à 5 %, étalez les bactéries MRSA sur les boîtes préparées et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius afin d'obtenir des colonies bien isolées. Préparez 500 millilitres de bouillon de soja triptyque, supplémenté avec 1 % de glucose et 0,1 % de chlorure de sodium, stérilisez à l'autoclave, ainsi que deux tubes à essai en verre propres et une boîte de pipettes de un millilitre.Après avoir laissé refroidir le milieu et les tubes à essai sous une hotte de sécurité ou à proximité d'un bec Bunsen, pipeter six millilitres de TSB dans chaque tube à essai. À l'aide d'une des plaques préparées au préalable d'agar au sang de mouton, ensemencer une colonie isolée de SARM dans l'un des tubes. Utiliser le deuxième tube comme témoin négatif afin de garantir l'asepsie, puis incuber les tubes dans un incubateur agité pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 200 tr/min.Le tube de SARM doit présenter une croissance ou aucune croissance ne doit être observée dans le tube témoin. Ensuite, réalisez une sous-culture en utilisant un millilitre de la culture de 24 heures pour ensemencer six millilitres de bouillon nutritif trypticasé soja frais, puis incubez à 37 degrés Celsius et à 200 tr/min pendant six heures supplémentaires. Ensuite, pipetez un millilitre de la culture dans un tube afus et centrifugez à 850 ×g pendant trois minutes.Éliminez le surnageant et utilisez de l’eau déionisée pour laver le culot deux fois à l’aide de pinces tenues dans la main dominante. Tenez un disque d’échantillonnage en acier inoxydable de 20 millimètres et utilisez cinq millilitres d’eau déionisée pour nettoyer chaque face. Placez les disques propres dans un bécher contenant de l’eau déionisée et soniquez pendant une minute après la sonication.Utilisez la pince pour retirer les disques d'échantillon du bécher et placez-les selon un angle d'environ 60 degrés contre le bord d'une boîte de Petri ouverte, posée sur une serviette en papier. Pour un séchage complet, utilisez le couvercle de la boîte afin de recouvrir les disques en cours de séchage. Une fois secs, transférez le disque dans une boîte de Petri afin de fonctionnaliser la surface du disque. Ajoutez 200 à 400 microlitres de polyol lysine à 0,1 % sur les disques à l’aide d’une pipette, dans une cabine de sécurité biologique, puis incubez à température ambiante pendant une heure en tenant les disques avec la pince.Utilisez de l'eau déionisée pour les laver, comme démontré précédemment dans cette vidéo. Ensuite, déposez 200 à 400 microlitres de cellules remises en suspension, lavées deux fois, sur les disques-échantillons revêtus. Après une incubation à température ambiante pendant 30 minutes, rincez délicatement les disques avec un millilitre d'eau déionisée.Laissez sécher les disques toute la nuit avant l'imagerie afin de réaliser une imagerie par microscopie à force de sonde de Kelvin. Allumez l'ordinateur ainsi que le microscope à force atomique ou AFMs, le contrôleur HEB et MAC trois. Ouvrez un logiciel d'imagerie AFM tel que Ulence P ovu overview.Sélectionnez A-C-A-F-M ou la désignation correcte pour l'imagerie en mode contact intermittent. À l’aide d’une pince FM dans la main dominante et en tenant le support de clip à ressort ouvert de l’autre main, insérez délicatement le levier A-K-P-F-M dans la tête. Chargez soigneusement la tête dans l’A FM et connectez les fils de la lumière laser et du moteur de levage de la platine.Ensuite, alignez le laser sur l'extrémité du levier. Pour aligner le laser sur l'extrémité du levier, tournez le bouton de l'avant vers l'arrière dans le sens horaire plusieurs fois afin de déplacer le laser au-dessus de la puce du levier.Lorsque le laser atteint la puce, il sera bloqué et ne sera plus visible. Ensuite, tournez le bouton de l'avant vers l'arrière dans le sens inverse des aiguilles d'une montre jusqu'à ce que le point laser réapparaisse. Le laser se trouve maintenant sur le bord de la puce.Faites tourner le bouton de gauche à droite pour positionner le laser sur le levier. Lorsque le laser traverse le levier, il disparaîtra et réapparaîtra successivement de manière rapide. La tache laser doit être visible sur le couvercle en verre dépoli à l'endroit où l'unité de photodiode sera installée ultérieurement.Tournez le bouton de réglage avant-arrière dans le sens inverse des aiguilles d'une montre pour déplacer le point lumineux le long du levier vers l'extrémité, jusqu'à ce que le point sur le verre dépoli disparaisse. Tournez ensuite légèrement le bouton de réglage avant-arrière dans le sens des aiguilles d'une montre afin de positionner le laser juste au niveau de l'extrémité du levier ; le point lumineux réapparaîtra alors sur le verre dépoli. Une fois le laser aligné, maintenez le moteur de levée de la platine en position ouverte pendant 10 secondes afin de garantir un espace suffisant entre le levier et l'échantillon.Lors de la fixation de l'échantillon sur le MFA, placez maintenant l'échantillon sur le plateau de MFPK. Utilisez un fil de cuivre pour relier l'échantillon à la masse et connectez les fils appropriés du MFA au plateau de l'échantillon. Ensuite, connectez le plateau au MFA dans le logiciel du MFA.Veillez à ce que le temps de réglage ne dépasse pas 10 millisecondes et que les vitesses d'approche n'excèdent pas deux micromètres par seconde. Afin d'éviter d'endommager la pointe, réglez alors le levier et commencez à déplacer la pointe du levier vers l'échantillon. Une fois que la pointe du levier atteint la surface de l'échantillon, sélectionnez une taille de fenêtre d'imagerie et une zone d'imagerie idéale, puis optimisez les gains des yeux et de P ainsi que le point de consigne du levier afin d'optimiser l'imagerie topographique.Lorsque l'imagerie topographique est optimisée, activez le module KPFM en mode FM. Réglez la fenêtre d'imagerie sur cinq micromètres par cinq micromètres avec une résolution de 128 par 128 ou des vitesses de balayage lentes. Pour les paramètres KPFM en mode FM, réglez l'amplitude d'excitation entre 5 et 10 %. Réglez la fréquence d'excitation entre un et cinq kilohertz avec une largeur de bande de deux kilohertz.Réglez les gains des NPs de fer pour le F-M-K-P-F-M à 0,3 %. Après avoir acquis les images KPFM, utilisez un logiciel de traitement post-acquisition pour analyser les images et recueillir les données de SP selon les paramètres décrits dans cette démonstration vidéo. Des images KPFM ont été prises sur 15 cellules de SARM, sur des surfaces en acier inoxydable et en or. On montre ici les types d'images recueillies.Étant donné que la KPFM fonctionne à l'aide de deux fréquences, des images topographiques et des données électriques de la surface cellulaire ont été collectées simultanément. Des filtres thermiques ont été appliqués aux cartes de potentiel de surface afin de distinguer plus facilement les faibles variations du potentiel de surface. Sur ce graphique, les images ont été analysées pour déterminer le potentiel de surface de la membrane microbienne, puis utilisées afin de comparer la croissance sur différents substrats.Les analyses du potentiel de surface des substrats nus en acier inoxydable et en or ont montré des potentiels de surface globalement négatifs. Les disques en acier inoxydable et en or revêtus de polyol-lysine ont tous deux présenté un décalage vers des potentiels de surface positifs. Les potentiels membranaires des cellules de SARM variaient entre les surfaces en acier inoxydable et en or.Alors que l'acier inoxydable présente un potentiel de surface membranaire nettement plus positif pour les cellules par rapport aux cellules de SARM sur le substrat d'or, qui affichent des potentiels de surface négatifs. Afin de démontrer les capacités complètes de la microscopie de force potentielle en Kelvin (KPFM), un exemple de graphe de hauteur de marche de SARM sur acier inoxydable est présenté ici. Ce graphe montre la différence de potentiel de surface entre la surface du substrat et la membrane microbienne.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser la microscopie à force de sonde de Kelvin pour examiner les effets de la charge électrique sur l'attachement et l'activité des cellules microbiennes sur différentes surfaces de substrats matériels.

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