Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

L’objectif général de l’expérience suivante est d’observer les changements de charge de la membrane cellulaire après l’adhérence à différents substrats matériels. Ceci est réalisé en cultivant les micro-organismes dans un milieu riche en nutriments pour augmenter leur nombre. Ensuite, les surfaces du matériau auxquelles les micro-organismes adhéreront sont nettoyées et fonctionnalisées pour des taux de fixation microbiens optimaux.

Ensuite, les micro-organismes sont plaqués sur les différents substrats du matériau pour permettre la microscopie à force de sonde Kelvin ou l’imagerie KPFM. Les résultats montrent que le type de substrat du matériau et sa charge inhérente ont un effet sur l’activité cellulaire, comme en témoignent les changements dans la charge de la membrane cellulaire et l’adhérence cellulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’électrophorétique, la diffusion de la lumière et la détermination du point isoélectrique est que la KPFM permet d’examiner la charge de cellules individuelles et de biofilms au lieu de cultures ou de colonies entières.

Ceci est avantageux lorsque l’on souhaite comparer les caractéristiques électriques d’une cellule à l’autre ainsi que les caractéristiques électriques du biofilm avec une exactitude et une précision élevées. Pour commencer, préparez des plaques de gélose au sang de mouton à 5 %, étalez les bactéries SARM sur les plaques préparées et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius pour générer des colonies uniques bien isolées. Préparez 500 millilitres de bouillon de soja triptyque, complété par un autoclave de 1 % de glucose et de chlorure de sodium de 0,1 %, ainsi que deux tubes à essai en verre propre et une boîte de pipettes d’un millilitre.

Après avoir laissé refroidir le milieu et les tubes à essai sous une enceinte de biosécurité ou à proximité d’un petit pain et d’un brûleur, pipetez six millilitres de TSB dans chaque tube à essai. À l’aide de l’une des plaques de gélose au sang de mouton préalablement préparées, inoculez une seule colonie de SARM dans l’un des tubes. Utilisez le deuxième tube comme témoin négatif pour assurer la stérilité : incubez les tubes dans un incubateur réciproque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 200 tr/min.

Le tube à SARM doit montrer une croissance ou rien n’aurait dû pousser dans le tube à essai témoin. Ensuite, créez une sous-culture en utilisant un millilitre de la culture de 24 heures pour inoculer six millilitres de bouillon de soja tryptique frais et incuber à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant six heures supplémentaires. Ensuite, pipetez un millilitre de la culture dans le tube afus et centrifugez à 850 fois G pendant trois minutes.

Retirez le supinate et utilisez de l’eau déminéralisée pour laver la pastille deux fois avec une pince dans la main dominante. Tenez un disque d’échantillonnage FM en acier inoxydable de 20 millimètres et utilisez cinq millilitres d’eau déminéralisée pour nettoyer chaque côté. Placez les disques propres dans un bécher d’eau déminéralisée et sonicez pendant une minute après la sonication.

Utilisez la pince pour retirer les disques d’échantillon du bécher et penchez-les à un angle d’environ 60 degrés contre le bord d’une boîte de Pétri ouverte sur une serviette en papier Pour sécher complètement, utilisez le couvercle de la boîte pour couvrir les disques de séchage. Une fois sec, transférez le disque dans une boîte de Pétri pour fonctionnaliser la surface du disque. Pipeter 200 à 400 microlitres de lysine polyol à 0,1 % sur les disques dans une enceinte de biosécurité et incuber à température ambiante pendant une heure à l’aide d’une pince pour maintenir les disques.

Utilisez de l’eau déminéralisée pour les laver comme démontré plus tôt dans cette vidéo. Plaque suivante, 200 à 400 microlitres de cellules remises en suspension qui ont été lavées deux fois sur les disques d’échantillonnage revêtus. Après avoir incubé la température ambiante pendant 30 minutes, utilisez doucement un millilitre d’eau déminéralisée pour laver les disques.

Laissez les disques sécher pendant la nuit avant d’effectuer l’imagerie par microscopie Kelvin Probe Force. Allumez l’ordinateur avec le microscope à force atomique ou les AFM, HEB et le contrôleur MAC trois. Ouvrez un logiciel d’imagerie A FM tel que Ulence P ovu viewview.

Sélectionnez A-C-A-F-M ou la désignation correcte pour l’imagerie en mode de contact intermittent. À l’aide d’une pince FM dans la main dominante et en tenant le support de clip à ressort ouvert dans l’autre main, placez soigneusement le porte-à-faux A-K-P-F-M dans la tête. Chargez soigneusement la têtière dans l’A FM et connectez les fils de la lumière laser et du moteur de levage de la scène.

Alignez ensuite le laser sur la pointe du cantilever. Pour aligner le laser sur la pointe du cantilever. Tournez le bouton de l’avant vers l’arrière dans le sens des aiguilles d’une montre plusieurs fois pour déplacer le laser sur le dessus de la puce en porte-à-faux.

Lorsque le laser atteindra la puce, celle-ci sera bloquée et ne sera plus visible. Tournez ensuite le bouton de l’avant vers l’arrière dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le spot laser réapparaisse. Le laser est maintenant sur le bord de la puce.

Tournez le bouton de gauche à droite pour positionner le laser sur le cantilever. Lorsque le laser passe au-dessus du porte-à-faux, il disparaît et réapparaît en succession rapide. Le spot laser doit être visible dans le couvercle en verre dépoli où l’unité de photodiode sera plus tard installée.

Tournez le bouton de l’avant vers l’arrière dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour déplacer le point vers le bas du porte-à-faux vers la pointe jusqu’à ce que le point sur le verre dépoli disparaisse. Tournez maintenant légèrement le bouton de l’avant vers l’arrière dans le sens des aiguilles d’une montre afin de positionner le laser de manière à ce qu’il repose juste sur la pointe en porte-à-faux, le point laser réapparaîtra sur le verre dépoli. Une fois le laser aligné, maintenez le moteur de levage de la platine en position ouverte pendant 10 secondes pour assurer un espace suffisant entre le cantilever et l’échantillon.

Lorsque vous fixez l’échantillon à l’A FM, placez maintenant l’échantillon sur la platine KPFM. Utilisez un fil de cuivre pour mettre l’échantillon à la terre et connectez les fils appropriés de l’A FM à l’étage d’échantillonnage. Connectez ensuite la platine à l’A FM dans le logiciel A FM.

Assurez-vous que le temps de réglage ne dépasse pas 10 millisecondes et que les vitesses d’approche ne dépassent pas deux microns par seconde. Afin d’éviter d’endommager la pointe, réglez ensuite le cantilever et commencez à déplacer la pointe du cantilever vers l’échantillon. Une fois que la pointe en porte-à-faux atteint la surface d’un échantillon, sélectionnez une taille de fenêtre d’imagerie et une zone d’imagerie idéale, optimisez les gains oculaires et P ainsi que le point de consigne en porte-à-faux afin d’optimiser l’imagerie topographique.

Lorsque l’imagerie topographique est optimisée, activez le module KPFM en mode FM. Réglez la fenêtre d’imagerie sur cinq microns par cinq microns avec une résolution de cinq 12 par cinq 12 ou des vitesses de balayage lentes. Pour les paramètres FM KPFM, réglez le disque entre cinq et 10 %Réglez la fréquence du disque entre un et cinq kilohertz avec une bande passante de deux kilohertz.

Réglez les gains NP du fer pour le F-M-K-P-F-M à 0,3 %Après avoir acquis des images KPFM, utilisez un logiciel de post-traitement d’imagerie pour analyser les images et collecter les données SP à l’aide des paramètres décrits dans cette vidéo de démonstration. Les images KPFM ont été prises sur 15 cellules SARM sur des surfaces en acier inoxydable et en or. Voici les types d’images collectées.

Comme KPFM fonctionne à double fréquence, des images topographiques et des données électriques de la surface de la cellule ont été collectées simultanément. Des filtres thermiques ont été appliqués sur les cartes de potentiel de surface afin de discerner plus facilement les petits changements de potentiel de surface. Dans ce graphique, les images ont été analysées pour déterminer le potentiel de surface de la membrane microbienne, puis utilisées pour comparer la croissance sur différents substrats.

Les balayages de potentiel de surface des substrats d’acier inoxydable nu et d’or nu ont montré des potentiels de surface négatifs globaux. L’acier inoxydable revêtu de lysine polyol et les disques d’or ont tous deux montré un décalage vers des potentiels de surface positifs. Les potentiels de membrane cellulaire du SARM variaient entre les surfaces en acier inoxydable et en or.

L’acier inoxydable présente un potentiel de surface membranaire positif significativement plus important pour les cellules par rapport aux cellules SARM sur le substrat d’or qui présentaient des potentiels de surface négatifs. Pour démontrer toutes les capacités de KPFM, un exemple de graphique de hauteur de pas de SARM sur l’acier inoxydable est présenté ici. Cela montre la différence de potentiel de surface entre la surface du substrat et la membrane microbienne.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie à force de sonde Kelvin pour examiner les effets de la charge électrique sur la fixation et l’activité des cellules microbiennes sur différentes surfaces de substrat de matériau.