Modélisation 3D de la ventricules latéraux et histologique Caractérisation des tissus périventriculaire chez les humains et les souris

L’objectif général des procédures suivantes est de fournir un moyen de permettre des enquêtes sur la cause et l’effet de la magaly ventriculaire et de mettre en évidence les techniques qui permettent d’étudier la santé du système ventriculaire et ses importantes fonctions de barrière et de filtration dans le cerveau. Ceci est réalisé en collectant soit des coupes coronales du cerveau de la souris, soit des IRM du cerveau humain pour générer des reconstructions 3D des ventricules et pour calculer les volumes des ventricules, comme une deuxième étape, le tissu post-mortem qui comprend des préparations en foss de la surface apicale des ventricules est coloré avec des anticorps spécifiques aux cellules pour révéler l’intégrité cellulaire de la muqueuse ventricule. Ensuite, un montage de l’organisation cellulaire à la surface entière du ventricule est préparé et rendu sur le modèle 3D du ventricule pour montrer les régions de gliose par rapport aux cellules d’appendice intactes.

Les résultats montrent des régions d’expansion ventricule basées sur une modélisation 3D longitudinale des ventricules et des zones où la couche cellulaire appendiculaire de la muqueuse venttriculaire n’est plus intacte, mais remplacée par des cicatrices gliales. En combinant les données de modélisation 3D avec les données immunohistochimiques, il est possible de générer une carte 3D spécifique à une région de la composition cellulaire de la muqueuse ventriculaire. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie ou au diagnostic des lésions cérébrales, des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer et du vieillissement normal, qui présentent toutes généralement un certain niveau d’expansion du ventricule et donc probablement une scoliose de la surface du ventricule.

Richard Wolffer fera la démonstration des procédures chez la souris et l’étudiant de premier cycle de nos procédures de laboratoire effectuées à l’aide de données IRM humaines et de tissus humains post-mortem sera démontré par yeun. Actuellement étudiante en médecine et Rebecca Chu, étudiante diplômée dans le laboratoire. Préparez les lames à imager en fixant, sectionnant, immunomarquant et montant le cerveau de la souris comme indiqué dans la partie écrite du protocole Pour commencer la procédure, pour tracer les ventricules latéraux de la souris, allumez le microscope à fluorescence droit et l’ordinateur, le microscope doit être équipé d’une platine automatisée et d’une caméra CCD numérique.

Lancez le logiciel de cartographie en mode fluorescence, ouvrez les options d’affichage pour charger les barres d’outils et les panneaux de piscine d’ancrage nécessaires au traçage. Cliquez ensuite sur options, affichez les options accessoires, puis sélectionnez les barres d’outils principale et marqueur dans le même menu. Sous les panneaux du pool d’ancrage, sélectionnez l’histogramme de la caméra, le contrôle multicanal, les paramètres de la caméra et l’acquisition d’images.

Identifiez le premier morceau de tissu contenant les ventricules latéraux en fonction de la forte fluorescence bêta S 100 qui marque les cellules de l’appendice. Revêtement du ventricule latéral. Orientez les hémisphères gauche et droit en identifiant la petite incision pratiquée lors de la section.

Créez maintenant un nouveau fichier de données et désignez un point de référence pour le mouvement de la scène en cliquant dans la fenêtre d’image au-dessus du ventricule latéral gauche. Conservez ce point de référence à un endroit cohérent par rapport aux ventricules latéraux à travers les fichiers de traçage. Pour faciliter l’importation de contours pour la reconstruction en série, sélectionnez le type de contour prédéfini approprié dans le menu déroulant des contours.

Utilisez une couleur unique pour chacun des tracés des ventricules latéraux gauche et droit. Cliquez maintenant le long de toute la surface apicale de la muqueuse de l’appendice pour tracer le contour du ventricule. Déplacez la fenêtre de traçage à l’aide des touches fléchées.

Après avoir tracé le contour, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Fermer le contour. Répétez le traçage pour le ventricule droit en utilisant une couleur différente. Ensuite, sélectionnez le marqueur approprié dans la barre d’outils des marqueurs sur la gauche, puis cliquez pour déposer un marqueur sur l’écran de traçage le long de la ligne médiane afin d’aider à aligner les contours de série pour la reconstruction 3D.

Répétez cette procédure pour faire un deuxième repère. Enregistrez les traces de tissu en sélectionnant Fichier Enregistrer le fichier de données sous et créez un nouveau dossier et un nouveau numéro de nom de fichier, les traces selon la convention, le numéro de diapositive, le tiret, le numéro de tissu pour une identification facile des traces à partir de coupes de série. Répétez ensuite la procédure qui vient d’être indiquée pour toutes les sections contenant un ventricule.

Pour effectuer la reconstruction 3D du ventricule latéral. Ouvrez le programme de reconstruction 3D. Cliquez ensuite sur le fichier Ouvrir et sélectionnez le fichier de contour de la première section de série de trace.

Importez tous les tracés de contour des ventricules gauche et droit, ainsi que tous les marqueurs ajoutés. Alignez les contours conformément aux instructions de la partie écrite du protocole. Sélectionnez ensuite tous les contours dans le panneau de gauche, puis cliquez sur le bouton de visualisation 3D pour afficher la reconstruction 3D finale.

Cette image montre une coupe coronale du cerveau d’une souris, y compris les ventricules latéraux délimités par des cellules d’appendice bêta-immunoréactives S 100. L’astérisque indique les ventricules latéraux. Les supports délimitent l’adhérence et la barre d’échelle représente 500 microns.

Les ventricules latéraux de la souris sont tracés comme des contours et disposés en sections de sous-segments. Les régions intraventriculaires sont éliminées de toute interférence avec l’analyse volumétrique. Cette image montre la reconstruction 3D finale des contours latéraux du ventricule.

La couleur jaune représente le contour de l’ensemble des volumes cérébraux couvrant la région d’intérêt contenant les ventricules latéraux. Vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer des reconstructions ventricules 3D de tissu cérébral tranché Corona Des protocoles sont répertoriés pour créer une reconstruction d’image 3D et une quantification volumétrique des ventricules latéraux et pour évaluer les changements volumétriques au fil du temps à l’aide de l’analyse de superposition longitudinale, il est important de noter cette cohérence dans la RM. La collecte de données R et le traitement post-acquisition sont des critères extrêmement importants pour l’inclusion d’ensembles de données. Pour effectuer la segmentation ventriculaire, ITK SNAP est utilisé pour segmenter les ventricules à partir d’images IRM pondérées T one haute résolution. Après avoir démarré le programme, ouvrez l’image en niveaux de gris, sélectionnez le fichier souhaité et ouvrez-le en tant que fichier astucieux.

Faites ensuite défiler chaque plan anatomique et notez les anomalies ventriculaires telles que les régions du nez, les cornes temporales grandes ou petites ou similaires. Ensuite, dans la boîte à outils principale, cliquez sur serpent, outil ROI. Ensuite, segmentez la 3D et sélectionnez l’option de région d’intensité.

Cliquez maintenant sur l’image de prétraitement et sélectionnez ci-dessus. Enregistrez l’intensité maximale à l’aide de la barre coulissante. Réglez ensuite le seuil sur 15 % d’intensité maximale et enregistrez cette valeur.

Cela devrait mettre en évidence le retour sur investissement en blanc. Réglez le paramètre de lissage sur 10. Cliquez sur OK.

Puis ensuite. Ensuite, ajoutez 10 à 12 bulles de petite taille deux à chaque ventricule. Deux dans la corne frontale antérieure, sept uniformément espacées le long de la surface supérieure du corps du ventricule latéral, une dans la corne occipitale et une dans la corne temporale du ventricule latéral.

Ensuite, sélectionnez les paramètres et réglez la force de courbure sur 0,4. Cliquez ensuite sur le symbole de lecture pour commencer l’évolution active des contours. Cliquez maintenant sur mettre à jour le maillage pour visualiser la surface.

Vérifiez ensuite la mise à jour automatique. Arrêtez le processus de segmentation lorsque toutes les zones du ventricule latéral sont incluses dans la région d’intérêt. Évitez d’inclure le troisième ventricule.

Enfin, cliquez sur Terminer et enregistrez les résultats de la segmentation dans un format de fichier astucieux. Pour obtenir le volume total du ventricule, sélectionnez la segmentation, le volume et les statistiques pour obtenir le volume total du ventricule à l’aide de l’étiquette de couleur définie. Dans ce segment, les zones d’intérêt longitudinales sont superposées à l’aide du logiciel mango pour démontrer qualitativement et quantitativement les changements du volume ventricule chez les sujets au fil du temps.

Après avoir ouvert le logiciel, cliquez sur ouvrir, ouvrez le fichier, chargez le fichier nifty précédemment enregistré. Une fois le fichier image chargé, cliquez sur Charger le fichier ROI et chargez le ROI du point temporel de référence en vert. Cliquez sur le fichier pour charger le retour sur investissement et chargez le deuxième point temporel du retour sur investissement en rouge.

Enregistrez la superposition longitudinale en sélectionnant Enregistrer le fichier ROI, attribuez à chaque image un nom de fichier selon la convention maintenant affichée à l’écran. Ensuite, ouvrez ITK snap. Rouvrez ensuite le retour sur investissement combiné en tant que fichier ROI combiné de chargement d’image en niveaux de gris en sélectionnant Charge de segmentation à partir du fichier ROI combiné d’image pour obtenir des données de volume longitudinales, exécutez le volume de segmentation et les statistiques suivants.

L’étiquette un rouge équivaut au volume d’expansion l’étiquette deux verte équivaut au volume de sténose l’étiquette trois bleue est égale au volume de base, en commençant par un hémisphère intact qui a été fixé dans de la formine à 10 % pendant un maximum de six semaines et rincé abondamment avec une tranche de PBS de 0,1 molaire, des coupes coronales de 1,5 centimètre d’épaisseur à travers tout l’hémisphère à l’aide d’un grand couteau à l’aide d’un scalpel microchirurgical. Disséquez la paroi du ventricule d’un centimètre de profondeur, en maintenant une section continue pour toute la paroi latérale, subdivisez la paroi au besoin pour créer des sections de taille appropriée pour la coloration. Bien entailler la section du côté opposé de la paroi du ventricule.

Pour identifier l’orientation inférieure supérieure, effectuez une immunochimie et montez les sections selon le protocole écrit. Sous une lunette de dissection, fixez le tissu à l’aide d’épingles avec un couteau à couteaux microchirurgicaux, créez une section uniformément mince de la paroi du ventricule latéral et montez un pénème de côté sur une lame Lorsque les lames sont complètement sèches, examinez les sections par microscopie confocale par immunofluorescence. Réglez le plan focal d’imagerie à la surface du ventricule tel que déterminé par l’utilisation de la bêta-caténine, un marqueur de l’adhérence apicale.

Protéines de jonction des cellules de l’appendice. Ensuite, délimitez les régions de couverture cellulaire d’appendice et d’astrogliose de surface en fonction de la coloration GFAP à la surface du ventricule pour documenter et monter toute la surface du ventricule. Utilisez des images superposées de toute la surface pour créer un montage d’images en série.

Ouvrez Adobe Photoshop et utilisez la mise en page interactive automatique pour sélectionner les images à superposer, en effectuant des ajustements manuels si nécessaire. Créez un nouveau calque pour tracer le montage afin de générer une représentation de dessin animé d’intact. En fonction de la couverture cellulaire ou de la surface du ventricule G, compilez toutes les coupes pour reconstruire la carte de la paroi venttriculaire et établissez un lien avec la région correspondante sur la reconstruction IRM.

Il s’agit ici de l’assemblage d’images IRM humaines. Le ventricule latéral a été défini comme la région d’intérêt en rouge. La reconstruction d’image 3D, comme illustré ici, permet une quantification volumétrique et une visualisation qualitative du ventricule latéral.

Cette image montre l’évaluation de l’expansion longitudinale du ventricule chez un patient âgé. Les IRM longitudinales de plusieurs points peuvent être alignées et superposées pour visualiser et quantifier l’expansion du volume ventricule chez les sujets au fil du temps. Ces trois dernières images montrent une évaluation immunohistochimique et une cartographie régionale de la surface du ventricule latéral humain. Ici.

Les zones de cellules de l’appendice intactes délimitées par la bêta-catine et la coloration présentent un aspect pavé comme indiqué par l’astérisque et sont délimitées par une ligne pointillée des régions d’astrogliose sur la surface du ventricule délimitées par la coloration GFAP. Des images confocales en série sont superposées pour générer un montage régional et tracées à l’aide d’Adobe Photoshop ou d’une représentation caricaturale de l’organisation cellulaire à la surface du ventricule. Cette image animée du montage est cartographiée à la surface du ventricule sur la reconstruction ventricule 3D correspondante basée sur l’IRM.

Comme indiqué, la couleur verte indique l’appendice intact et les zones rouges de la gliose. Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de conserver une documentation minutieuse de chaque échantillon de tissu afin d’effectuer une reconstruction en série et une cartographie de l’intégrité cellulaire. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la sous-segmentation des ventricules latéraux peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l’expansion spécifique à une région au fil du temps.