Name: Microdissection laser - une démonstration de lisolement de la dopamine neurones individuels et de lEspace ventrale tegmentale entière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Découvrez la microdissection laser pour isoler des neurones dopaminergiques individuels de l'aire tegmentale ventrale. Cette méthode combine immunohistochimie et LCM pour préserver l'intégrité de l'ARN en vue d'analyses moléculaires de haute qualité.

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Ce travail a été financé par l’Institut national de la santé mentale (1R15MH084209 - 01A1), l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R21NS058375-01A2) et la National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

LCM est une technique puissante pour la dissection des populations distinctes de cellules ou de tissu à partir de régions de coupes de tissus sur une lame de microscope et l&#39;isolation ultérieure de l&#39;ARN, micro-ARN, l&#39;ADN et les protéines. L&#39;utilisation de LCM en combinaison avec l&#39;analyse en utilisant des technologies à haut débit tels que la puce à ADN, suivant le séquençage de l&#39;ARN de production, l&#39;analyse épigénétique de l&#39;ADN et la protéomique est de plus en plus fréquent que la sensibilité de ces techniques se améliore et la quantité de matériau de départ nécessaire est réduite 8-12. Avec LCM, une meilleure résolution anatomique est réalisé pour un échantillon, et à la compréhension des mesures en aval de ces échantillons est grandement améliorée. Une mise en garde avec LCM est qu&#39;elle fournit un échantillon concentré de cellules d&#39;intérêt, mais pas nécessairement une population pure de cellules. Les limites de la précision signifie qu&#39;il y aura une certaine contamination du tissu adjacent. Cependant, cette technique ne se concentre les cellules d&#39;intérêtpour minimiser les effets associés à des cellules et des tissus environnants et de maximiser les effets expérimentaux sur les cellules d&#39;intérêt. Direct par rapport indirect immunohistochimie Depuis LCM est actuellement utilisée principalement pour la séparation et la mesure de l&#39;ARN, l&#39;ARN intact maintien est un critère très important. Le maintien de l&#39;intégrité de l&#39;ARN est la raison principale derrière l&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie indirecte pour guider la dissection des tissus qui élimine la nécessité de colorer directement le tissu qui peut dégrader l&#39;ARN (figure 10). Lorsque la question expérimental, cependant, nécessite l&#39;isolement d&#39;une population spécifique de cellules, telles que les neurones dopaminergiques, immunohistochimie fluorescente directe ne est nécessaire. L&#39;utilisation d&#39;un protocole rapide d&#39;étiquetage immunohistochimie peut minimiser la dégradation de l&#39;ARN au cours de la procédure. Les temps d&#39;incubation courts sont dues à l&#39;utilisation de concentrations élevées d&#39;anticorps anti primaire et secondaireorganismes, les concentrations qui sont autour de 10 à 20 fois supérieures à ce qui est nécessaire pour l&#39;immunohistochimie classique avec une incubation de 2 h. Si toutefois, des temps d&#39;incubation plus longues sont nécessaires, Brown et Smith utilisés tampons élevées de sel pour inhiber la dégradation de l&#39;ARN et obtenir une bonne ARN de qualité avec des temps d&#39;incubation longs (jusqu&#39;à 20 h) 13. Cette approche peut également être utilisé se il ya beaucoup de temps nécessaire entre l&#39;étiquetage du tissu et de l&#39;accès à un système de LCM. Choix de diapositives - membrane PEN, Silane-prep et lames de verre non couchés L&#39;utilisation de lames de verre non couchés pour LCM ont été signalés 14. Dans notre laboratoire, lames de Silane-prep se sont révélés être un choix optimal, que ce revêtement se fixe suffisamment le tissu pour le coulisseau pour l&#39;immunohistochimie sans perte de tissu mais permet encore pour la fixation du tissu à des capuchons LCM et le retrait de la lame . Lames de verre non couchés onta montré une certaine perte de tissu avec la procédure d&#39;immunohistochimie. Si immunohistochimie indirecte est utilisée, cependant, la rétention de tissu devient moins un problème. Avec déshydratation appropriée, les cellules de capture ou de tissu hors de diapositives Silane-Prep n&#39;a pas été un problème. Chacune des différentes approches de neurones isolement ou régions du cerveau décrites dans ce document présente des avantages et des inconvénients. Pour l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels, l&#39;utilisation de lames de Silane-prep présente l&#39;avantage d&#39;une meilleure optique et est moins coûteux que les lames de la membrane PEN. L&#39;inconvénient est que les cellules parfois capture peut être difficile se il ya déshydratation insuffisante (voir ci-dessous) et de certains tissus peut être laissé sur la diapositive. L&#39;avantage des diapositives membranes PEN est que l&#39;utilisation de la combinaison du laser UV et IR laser assure que les neurones dopaminergiques sont recueillies. Le défaut de recueillir des cellules de la membrane coulisse un PEN presque ne se produit jamais, car elle est moins dépendante de la déshydratation que les lames de verre. Une<html> avantage supplémentaire est que le laser UV peut être utilisée pour rapprocher plus étroitement la forme des neurones d&#39;intérêt, par rapport à un cercle de capture hors de neurones des lames de verre avec le laser IR. Pour l&#39;isolement des régions de tissu, les diapositives de la membrane PEN sont de loin supérieures et justifient le coût supplémentaire. Cette approche aboutit à l&#39;élimination complète de tous les tissus découper sur la membrane, est beaucoup plus rapide que la capture d&#39;une grande zone de tissu en utilisant le laser IR seul et coupes de tissus plus épais peuvent être recueillis. En utilisant seulement le laser IR nécessite que la membrane de bouchon de LCM soit complètement fondu au-dessus de la zone de tissu ensemble. En outre, la collecte incomplet du tissu est typique et nécessite généralement plusieurs tentatives. Bien que cela prend plus que le tissu isolant de la lame de la membrane PEN, si le tissu disponible est déjà sur une lame de verre ou d&#39;un laser UV ne est pas disponible, ce est une option viable, car la plupart des tissus peuvent être collectées (Figure 8J). &quot;&gt; Les étapes critiques ove_content Les incubations d&#39;éthanol 100% sont une des étapes les plus importantes. Afin de recueillir les cellules à partir de diapositives Silane-Prep déshydratation complète du tissu est requis. Par conséquent, toute l&#39;eau ne est pas retiré, qui est associé principalement avec l&#39;incubation de l&#39;éthanol à 100%, aura un impact sur la capacité de prélever des cellules à partir des diapositives. Afin de répondre à cette question, changer fréquemment les solutions d&#39;éthanol 100%, car l&#39;absorption de l&#39;eau de l&#39;air ou le transfert de lavage étapes précédentes peuvent affecter la déshydratation. En outre, les tamis moléculaires sont utilisés pour absorber toute contamination de l&#39;eau. Le système de LCM devrait idéalement être situé dans une petite chambre avec un déshumidificateur pour maintenir des conditions de faible humidité. Sections de bonnes cryostat sont essentielles pour LCM bon. Les articles doivent être à plat avec des plis dans le tissu minimisé. Plis dans le tissu va augmenter la distance entre le capuchon de LCM et l&#39;empêcher d&#39;entrer en contact til tissulaire. Il devient alors difficile à fondre suffisamment le capuchon à membrane sur le tissu. Pour les lames de verre, généralement l&#39;épaisseur de coupe doit être compris entre 6 et 12 um. Sections plus épaisses peuvent être capturés avec les diapositives de la membrane PEN. LCM offre une capacité technique de faire dissections très précises de tissus et de cellules à partir des lames de microscope. Ceci augmente considérablement la résolution d&#39;une analyse complémentaire par rapport à la dissection brut des morceaux de tissu. Bien que, LCM peut prendre du temps et de main-d&#39;œuvre, il ne nécessite pas une formation approfondie ou d&#39;expertise et, lorsqu&#39;il est couplé avec d&#39;autres technologies à haut débit, peut grandement améliorer la compréhension d&#39;un processus biologique lorsque les cellules discrètes ou régions anatomiques sont utilisés.

<html> Tous les tissus se compose d&#39;une population de cellules hétérozygotes. Ceci est particulièrement pertinent pour les tissus du cerveau, constitué de différents neurones morphologiquement et / ou neurochimique distincts entourés de divers types de cellules gliales (oligodendrocytes, la microglie et les astrocytes). En outre, des régions distinctes dans le cerveau, comme les zones du cortex ou du tronc cérébral noyaux, ont des fonctions spécifiques. Par conséquent, la capacité d&#39;isoler des populations spécifiques de cellules ou de très petites zones anatomiquement distincts, lorsqu&#39;il est combiné avec des techniques d&#39;analyse (par exemple, Q-PCR, microarrays, ARN-séquençage, et protéomique), peuvent sensiblement améliorer la compréhension des différents processus biologiques. LCM est une technologie qui offre la possibilité d&#39;isoler des zones anatomiques très discrets ou de cellules spécifiques d&#39;un tissu sur une lame de microscope en fournissant une source beaucoup plus homogène pour une analyse ultérieure de diverses molécules, telles que l&#39;ARN, micro-ARN, l&#39;ADN et les protéines. t &quot;&gt; Depuis LCM a été introduit, plusieurs approches différentes ont été utilisées pour les cellules d&#39;un tissu microdissect 3.1. Les premières approches compris la fixation directe d&#39;un tissu sur une lame en utilisant un (IR) et un laser infrarouge et un film thermoplastique non Procédé de contact à l&#39;aide d&#39;un rayonnement ultraviolet (UV) de coupe laser pour détacher une cellule ou un tissu et collecte dans un tube. Par la suite, LCM a été utilisé avec succès sur une grande variété de tissus et de types de cellules et représenté pour être compatible avec l&#39;isolement de diverses molécules pour l&#39;analyse en aval y compris l&#39;ARN, les microARN, l&#39;ADN et les protéines, y compris l&#39;activité enzymatique 1,4-7. Voici LCM est démontrée en utilisant l&#39;un système de LCM qui utilise une découpe laser UV et un laser capture d&#39;IR pour couper autour des cellules ou des tissus et en l&#39;attachant à un LCM capuchon, respectivement. Ce système de LCM utilise à la fois la capture laser IR à l&#39;état fondu un film plastique sur un plafond au-dessus de la cellule ou du tissu d&#39;intérêt qui se fixe aux cellules de la feuille de matière plastique et le supprime de til tissu à l&#39;enlèvement du capuchon (figure 1). En outre, en combinaison avec le laser IR, un laser UV est disponible pour découpe des tissus ou cellules d&#39;intérêt à partir de tissus montées sur des lames avec une membrane puis isolé par fixation du tissu à la capsule de LCM utilisant le laser IR (figure 2). Un bref aperçu de ces techniques se trouve dans les figures 1 et 2. Plusieurs variantes de cette technique sont décrits afin d&#39;isoler des cellules spécifiques en utilisant l&#39;immunohistochimie fluorescente directe et une technique d&#39;immunohistochimie indirecte guidée qui est utilisé pour l&#39;isolement d&#39;une région de tissu sur la base de l&#39;expression d&#39;une protéine spécifique. Plus précisément, l&#39;isolement des neurones dopaminergiques de la substance noire et l&#39;isolement de l&#39;aire tegmentale ventrale et l&#39;isolement subséquent de l&#39;ARN à partir de frais, congelé les tissus du cerveau sont représentés. Comme l&#39;ARN est la plus labile des molécules mesurées (par rapport à l&#39;ADN ou protéine), de steps pour aider à préserver l&#39;intégrité de l&#39;ARN sont inclus et les données indiquées sur la quantité et la qualité de l&#39;ARN obtenu.

<table><tbody><tr><td>Veritas Laser Capture Microdissection System</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td> Le <td>modèle le plus récent est maintenant vendu</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>CapSure HS LCM Caps</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>LCM0213</td><td></td></tr><tr><td>PEN Lames de membrane</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>s4651</td><td></td></tr><tr><td>Silane prep-slides</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>95 % Ethanol-RNase Free</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>100 % Ethanol-RNase Free</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Free Triton</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tamis moléculaire</td><td>EDM Millipore, Billerica, MA</td><td>MX1583D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tyrosine hydroxyase</td><td>EDM Millipore, Billerica, MA</td><td>Ab152</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Stratagene MX 3005P</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>401513</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 3300 fluorospectromètre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;espace ventrale tegmentale entière

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

microdissection par capture laser (LCM) est utilisé pour isoler une population concentrée de cellules individuelles ou des régions anatomiques précis de tissu à partir de coupes de tissus sur une lame de microscope. Lorsqu&#39;il est combiné avec l&#39;immunohistochimie, LCM peut être utilisé pour isoler des cellules individuelles types basés sur un marqueur de protéine spécifique. Ici, la technique de LCM est décrit pour la collecte d&#39;une population spécifique de neurones dopaminergiques directement marquées avec de la tyrosine hydroxylase immunohistochimie et pour l&#39;isolement du neurone dopaminergique contenant région de l&#39;aire tegmentale ventrale utilisant indirect tyrosine hydroxylase immunohistochimie sur une section adjacente à celles utilisées pour LCM. Une infrarouge (IR) de capture laser est utilisé pour disséquer les deux neurones individuels ainsi que l&#39;aire tegmentale ventrale de fermeture des lames de verre et sur un capuchon de LCM pour analyse. La déshydratation complète du tissu avec 100% d&#39;éthanol et le xylene est critique. La combinaison de la capture laser à infrarouge et l&#39;ultraviolet (UV) Cutting laser est utilisé pour isoler les neurones dopaminergiques individuels ou l&#39;aire tegmentale ventrale lors de l&#39;utilisation de la membrane diapositives PEN. Coulisse de PEN membrane présente des avantages significatifs par rapport à une lame de verre comme il offre une meilleure consistance dans la capture et la collecte des cellules, est plus rapide collecter de grands morceaux de tissu, est moins dépendant des résultats de la déshydratation et l&#39;élimination complète du tissu à partir de la diapositive. Bien que l&#39;élimination de grandes zones de tissu à partir d&#39;une lame de verre est possible, il est considérablement plus longue et laisse souvent peu de tissu résiduel derrière. Les données présentées ici démontrent que l&#39;ARN de la quantité et qualité suffisante peut être obtenue en utilisant ces procédures pour des mesures quantitatives de PCR. Bien que l&#39;ARN et l&#39;ADN sont les molécules les plus isolées de tissus et cellules recueillies avec LCM, l&#39;isolement et la mesure des microARN, les protéines et les changements épigénétiques de l&#39;ADN peuvent également bénéficier de la résolution anatomique et cellulaire améliorée obtenue en utilisant LCM.

La micrographie sur les figures 6 et 7 montrent des capacités pour l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels. La résolution anatomique actuel est d&#39;environ 5 à 10 um comme la plus petite taille de la tache qui peut être produit régulièrement sur le LCM bouchons pour isoler une cellule. La seule limitation pour l&#39;isolement de types cellulaires spécifiques est la possibilité de visualiser les cellules. Bien que LCM est capable d&#39;isoler les neurones dopaminergiques individuels, la contamination des parties de cellules non marquées adjacentes se produit le plus probable. Par conséquent, l&#39;échantillon final est un concentré collecte des neurones dopaminergiques, et non pas une population pure de neurones dopaminergiques. Cette technologie est aussi capable d&#39;isoler de petites zones de tissu tels que des noyaux ou des régions discrètes dans le cerveau, comme indiqué à l&#39;isolement de l&#39;aire tegmentale ventrale. Publications antérieures ont démontré cette utilisation dans les tissus du cerveau ainsi que pour isoler le tissu pathologique du tissu normal 5,11. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Parce que l&#39;utilisation la plus courante de cellules et de tissus isolés en utilisant LCM est l&#39;analyse de l&#39;ARN, les procédures présentées ont été optimisés pour préserver l&#39;intégrité de l&#39;ARN. Afin de déterminer la qualité de l&#39;ARN qui est resté suivant LCM, l&#39;ARN a été isolé en utilisant des colonnes à base de silice de rotation, à partir de tissu sur les diapositives suivantes LCM, soit après la tyrosine rapide procédure d&#39;immunohistochimie fluorescente hydroxylase ou fixation dans l&#39;acétone. la qualité de l&#39;ARN a été mesurée et comparée à des valeurs de l&#39;ARN à partir d&#39;ARN disponible dans le commerce du cerveau entier (figure 9). la qualité de l&#39;ARN a été réduit dans les échantillons d&#39;ARN provenant de tissus utilisés pour LCM avec intégrité plus faible après l&#39;immunohistochimie (RIN pas disponible), suivie par de l&#39;acétone fixation (RIN 2,6) par rapport à l&#39;ARN de cerveau entier (RIN 8,2) comme on peut le voir par une réduction relative de hauteur du pic de l&#39;ARNr S28 par rapport au pic S18. Cependant, l&#39;ARN a maintenu les bandes 18S et 28S et l&#39;expression du gène peut être mesurée en utilisant Q-PCR. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Pour mesurer la quantité d&#39;ARN obtenu à partir de neurones acquises via LCM, les neurones dopaminergiques (50, 100 et 200 neurones dopaminergiques) ont été isolés à partir de l&#39;aire tegmentale ventrale de lames de Silane-Prep. L&#39;ARN a été isolé en utilisant des colonnes à base de silice de spin et la quantité d&#39;ARN a été mesurée. Sur la base de la courbe d&#39;étalonnage généré, un total de 17,3, 24,8 et 50,9 pg pg / pl a été isolé à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques, respectivement (figure 10A). Pour mesurer la quantité d&#39;ARN par Q-PCR, une gamme de concentrations d&#39;ARN de cerveau et de l&#39;ARN entier à partir des neurones dopaminergiques a été transcrit de manière inverse et le gène de la β-actine a été mesurée en utilisant Q-PCR comme décrit précédemment 5. Sur la base de ces mesures, une concentration de 3,55, 6,82 et 20,58 pg / pl a été calculée à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques, respectivement (figure 10B). Pour montrer comment l&#39;isolement des neurones dopaminergiques compare à l&#39;isolement de l&#39;ensemble du vaire tegmentale entral avec LCM, des gènes spécifiques des neurones dopaminergiques (Nurr1, la tyrosine hydroxylase, et transporteur de la dopamine) ont été mesurés par Q-PCR dans ces deux types d&#39;échantillons différents et on les compare à l&#39;expression de la β-actine (figure 11). Etant donné que des valeurs inférieures t C sont générés avec une concentration plus élevée du gène d&#39;intérêt, une diminution de l&#39;Ac t indique une expression accrue des gènes de neurones dopamine par rapport au β-actine. Ceci démontre comment l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels concentre l&#39;expression de gènes spécifiques des neurones dopaminergiques. Dans les échantillons d&#39;aire tegmentale ventrale, des gènes spécifiques dopamine de neurones sont dilués comme d&#39;autres cellules (neurones non dopaminergiques et les cellules gliales) seront également collectées qui expriment β-actine, mais ne expriment pas les gènes de neurones dopaminergiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig1highres.jpg" /> <strong&gt; Figure 1. capture laser à l&#39;aide du laser infrarouge (IR) de capture. Le petit bouchon en plastique LCM a une membrane sur le fond qui est placé sur le dessus du tissu monté sur une lame de verre (étape 1). Lorsque le tissu ou la cellule d&#39;intérêt est identifié, un laser IR de capture est déclenché par l&#39;intermédiaire du bouchon de LCM pour faire fondre une petite fossette dans la membrane sur le tissu / cellule sous-jacente (étape 2). Lorsque le capuchon est enlevé de LCM, le tissu est retiré de la lame de microscope et reste attachée à la capsule de LCM. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig2highres.jpg" /> Figure 2. capture laser en utilisant l&#39;infrarouge (IR) laser de capture et l&#39;ultraviolet (UV) laser de découpage. Pour obtenir de plus grandes zones de tissu ou faciliter la récupération des cellules en utilisant le laser UV, le tissu est monté sur un coulisseau avec une membrane relié à la coulisse le long de l&#39;angle extérieur (PEN coulisse de la membrane). Le bouchon de LCM est placé sur til tissu et le laser IR de capture est utilisé pour faire fondre la membrane de couvercle et fixer le tissu sur le capuchon d&#39;LCM (étape 1 et 2). Le laser de coupe UV est ensuite utilisé pour couper à travers la membrane de la lame et le tissu (étape 3 et 4) de sorte que lorsque le capuchon est retiré du tissu est prélevé à partir de la diapositive et reste sur le capuchon de LCM (étape 5). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig3highres.jpg" /> Figure 3. La Microdissection laser Système Road Map. Ce système de microdissection par capture laser a l&#39;espace pour trois lames à la fois. Lorsque les diapositives sont chargées dans le microscope, faible grossissement Carte routière images pour chaque diapositive sont générés. Sélection d&#39;une zone de l&#39;image de feuille de route se déplace la fenêtre d&#39;image en direct à cette région. Pour des fins de démonstration, du mésencéphale de la souris a été sectionnée en 10 um section sur trois diapositives. La première diapositive a été étiqueté pour la tyrosine hydroxylase immunoreactivité en utilisant de la diaminobenzidine comme chromogène un (A). Les sections ont été installés sur des diapositives Silane-Prep (B) ou des diapositives de la membrane PEN (C). Ces deux diapositives ont été marqués en utilisant la tyrosine hydroxylase immunohistochimie fluorescente rapide. Flèches dans (C) indiquent l&#39;attachement de la membrane PEN à la lame de verre. Aucun tissu extérieur de cette frontière peut être recueilli avec LCM. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig4highres.jpg" /> Figure 4. En utilisant le laser de capture IR. Le laser de capture d&#39;IR est utilisé pour faire fondre le bouchon de membrane de LCM pour fixer le tissu sur le capuchon d&#39;LCM et le retirer du reste du tissu. Le laser de capture IR doit être à une force suffisante pour faire fondre le bouchon de membrane suffisamment LCM pour contacter la lame de verre et le tissu sous-jacent. L&#39;image ci-dessus montre lorsque le laser était insuffisante pour faire fondre la membraneau coulisseau (deux taches de gauche). Lorsque la membrane fondue touche la lame de verre, un contour noir épais peut être observée (spot à droite). L&#39;intensité du laser peut être ajustée en changeant la puissance (de 3 à 100 mW), Impulsion (us 100-1,000,000) et # Résultats du laser. En outre, répété tir du laser infrarouge au même endroit peut aussi fondre davantage la membrane. Le but du laser IR doit être ajustée chaque fois que le capuchon est déplacé LCM ou lorsque l&#39;objectif est changé. Barre d&#39;échelle = 100 um. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig5highres.jpg" /> Figure 5. Utilisation de la découpe au laser UV. Le laser UV de coupe est utilisé pour couper à travers la membrane et le tissu PEN. Avant d&#39;utiliser l&#39;intensité minimale nécessaire pour couper à travers la membrane et le tissu doit être de déterminer depuis le laser UV peut endommager les tissus. Ci-dessus, les trois points (flèches) de différentes intensités laser UV sont présentés avec le<html> taille suffisante pour 10 sections um, le milieu de terrain pour les sections plus épaisses et au bon endroit démontrant une intensité laser UV qui est trop élevé place gauche. Barre d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig6highres.jpg" /> Les neurones dopaminergiques Figure 6. L&#39;isolement direct de la tyrosine hydroxylase neurones immunoréactifs à l&#39;aide du laser IR. Sont indiqués après un marquage fluorescent rapide pour la tyrosine hydroxylase (A). Lorsque le laser infrarouge est tiré fusion de la membrane de bouchon de LCM sur ces neurones (D), l&#39;enlèvement du capuchon capte ces cellules hors de la glissière (B, E). Ces neurones peuvent alors être visualisés comme attaché au capuchon de LCM (C, F). Barre d&#39;échelle = 250 um.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig7highres.jpg" /> Figure 7. L&#39;isolement direct de la tyrosine hydroxylase neurones immunoréactifs à partir de lames de la membrane PEN utilisant les lasers IR et UV. Tyrosine hydroxylase neurones marqués sont présentés ci-dessus (A). Ces neurones peuvent être fixés au plafond de LCM en utilisant le laser IR et découpées dans la coulisse de PEN membrane en utilisant le laser UV (B). Barre d&#39;échelle = 250 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig8highres.jpg" /> Figure 8. indirect<html> isolement de l&#39;aire tegmentale ventrale en utilisant la tyrosine hydroxylase immunoréactivité. L&#39;emplacement des neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale a été visualisée dans une section en utilisant des techniques immunohistochimiques standard (A et E). Cette section intitulée immunohistochimie a été utilisée comme un modèle pour localiser l&#39;aire tegmentale ventrale dans les sections adjacentes non colorées (B et F). En utilisant le laser UV, l&#39;aire tegmentale ventrale a été attaché au capuchon de LCM avec le laser IR et coupé de la lame avec le laser UV (C et D) et est représentée fixée à un plafond HS LCM (D). La région tegmentale ventrale isolé à partir de diapositives Silane-prep en utilisant seulement le laser infrarouge est également montré attaché à un plafond Macro (FK). A noter que plus d&#39;une tentative a été nécessaire pour recueillir la majeure partie du tissu à partir de cette région (Comparer G et J). Barre d&#39;échelle = 500 um.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig9highres.jpg" /> Figure qualité 9. ARN. Électrophérogrammes représentatifs et les images de gel associés disponibles dans le commerce ARN totaux du cerveau (A) et l&#39;ARN isolé à partir de sections après fixation à l&#39;acétone et LCM (B) ou fluorescent immunohistochimie rapide de la tyrosine hydroxylase et LCM (C). Bien que la qualité de l&#39;ARN a été réduite dans les sections traitées pour l&#39;immunohistochimie, par rapport à l&#39;ARN de cerveau entier, les électrophérogrammes montrent l&#39;ARN intact essentiellement basée sur la présence des pics ARNr S18 et S28. Concentration d&#39;ARN du cerveau entier était 6,487 pg / ul avec un RIN de 8,2. Acétone concentration d&#39;ARN de tissu fixé était 5,036 pg / ul avec un RIN de 2,6. ARN obtenu après immunohistochimie h<html> insérer une concentration de 4,474 pg / pl et RIN était pas disponible. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/52336/52336fig10highres.jpg" /> Figure 10. quantité d&#39;ARN. Pour déterminer la quantité d&#39;ARN dans les neurones obtenus avec LCM, une courbe standard de la concentration d&#39;ARN a été produit en utilisant un fluorospectromètre et Q-PCR. Pour les mesures de fluorospectromètre (A), la grande graphique montre la gamme supérieure des montants d&#39;ARN et le petit graphique montre la sensibilité de ce dosage jusqu&#39;à 10 pg / pl. Les concentrations d&#39;ARN obtenus à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques a été de 17,3, 24,8 et 50,9 pg / pl, respectivement. Utilisation de Q-PCR pour mesurer des quantités d&#39;ARN (B), les concentrations d&#39;ARN obtenus à partir de 50, 100 et 200 neurones dopaminergiques a été de 3,55, 6,82 et 20,58 pg / pl, respectivement. es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg &quot;/&gt; Figure 11. Concentration de gènes spécifiques de la dopamine des neurones à l&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels. La différence de C t (Ac t) entre les gènes de la dopamine des neurones spécifiques (Nurr1, la tyrosine hydroxylase, et transporteur de la dopamine) et de β-actine dans des échantillons de neurones dopaminergiques dans l&#39;aire tegmentale ventrale isolé avec LCM par rapport à l&#39;expression dans les dissections de toute la région tegmentale ventrale sont indiqués. Comme T valeurs inférieures C sont générés avec une concentration plus élevée du gène d&#39;intérêt, une diminution de l&#39;Ac t indique une expression accrue de gènes de la dopamine des neurones par rapport à β-actine en tant que d&#39;autres cellules (neurones non dopaminergiques et les cellules gliales) volonté recueillir dans les échantillons d&#39;aire tegmentale ventrale qui expriment l&#39;actine-β mais ne expriment pas les gènes de neurones dopaminergiques.

L&#39;isolement des neurones dopaminergiques individuels ou l&#39;aire tegmentale ventrale par immunohistochimie directe ou indirecte est démontrée en utilisant microdissection laser. Les paramètres pour l&#39;isolement d&#39;un tissu à partir d&#39;une lame de verre en utilisant un laser infrarouge et de diapositives membrane en utilisant la combinaison d&#39;un laser infrarouge et ultraviolet sont discutés.

Microdissection laser - une démonstration de l&#39;isolement de la dopamine neurones individuels et de l&#39;Espace ventrale tegmentale entière

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des neurones dopaminergiques à partir de sections tissulaires sur des lames. Cela est réalisé en découpant d'abord du tissu de mésencéphale ventral congelé sur des lames spéciales ou sur des lames à membrane équipées d'un stylo. Ensuite, les neurones dopaminergiques sont marqués par une immunohistochimie fluorescente rapide.Ensuite, le tissu est déshydraté et chargé dans le microscope de capture laser. Puis, les neurones dopaminergiques marqués sont fixés sur le capuchon LCM à l’aide du laser infrarouge et l’ARN ou la molécule d’intérêt est isolée. Les résultats montrent que l’on peut obtenir de l’ARN en quantité et qualité suffisantes pour des mesures de PCR quantitative à l’aide de la microdissection par capture laser.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la dissection macroscopique ou les biopsies microchirurgicales, est que des populations cellulaires individuelles ou des régions cérébrales très précises peuvent être isolées. Pour préparer les lames destinées à l'isolement de l'ARN, plongez des lames de type seline prep ou des lames en verre à membrane de polyéthylène méthyler ou de styrolène dans une solution de décontamination, puis rincez-les trois fois avec de l'eau exempte d'ARN. Déshydratez les lames à l'aide d'une série progressive d'éthanol exempt d'ARN, puis séchez-les sous vide pendant 30 minutes. À l'aide d'un cryostat, découpez des sections tissulaires de 10 micromètres d'épaisseur et montez-les sur des lames préparées exemptes d'ARN. Conservez les échantillons congelés durant la coupe pour préserver la qualité de l'ARN.Ensuite, réaliser une immunohistochimie. Utiliser un stylo hydrophobe pour délimiter le tissu et le laisser sécher, puis fixer dans une solution d'acétone-méthanol à égal volume. Fixer le tissu à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir retiré le tissu du congélateur, recouvrir les sections de 100 à 200 microlitres d'anticorps anti-tyrosine hydroxylase dans du NPBS contenant 1 % de Triton pendant 10 minutes.Ensuite, utiliser du PBS avec 1 % de Triton pour rincer les lames avant de recouvrir les sections de 100 à 200 microlitres d'anticorps de chèvre anti-lapin IgG marqué avec Alexa Fluor 488, incuber pendant cinq minutes, puis rincer les lames deux fois avec du PBS. Ensuite, déshydrater les échantillons dans une série croissante d'éthanol sans RNase pendant 30 secondes chacun, comme démontré précédemment dans cette vidéo. Incuber dans le xylène pendant une minute, puis effectuer un second lavage de cinq minutes.Retirer les lames immédiatement avant utilisation pour la microdissection laser et les laisser sécher à l’air. Après avoir chargé les capsules de microdissection laser et les lames, et configuré le système de microdissection laser conformément au protocole écrit, régler et orienter le laser infrarouge de capture en fonction de l’intensité. Placer la capsule dans une zone de la lame éloignée du tissu, à l’aide de la barre d’outils du laser de capture.Sélectionnez activer, puis réglez l'impulsion de puissance et le nombre d'impacts du laser. Déclenchez le laser infrarouge lorsque le capuchon se trouve au-dessus d'une partie de la lame ne contenant pas de tissu, et vérifiez si le laser fait fondre suffisamment la membrane du capuchon LCM. Après avoir ajusté l'intensité du laser infrarouge, cliquez avec le bouton droit et sélectionnez « capture laser is here » pour viser le laser afin d'effectuer la microdissection par capture laser sur des neurones dopaminergiques individuels à partir de lames préparées.Commencez par vous déplacer vers la région d'intérêt afin de capturer les cellules individuelles à partir du côté d'une préparation en gradient. Dans la barre d'outils de microdissection, sélectionnez l'onglet LCM, puis l'icône de point unique. Ensuite, dans la barre d'outils du microscope, utilisez l'onglet obturateur pour basculer entre la fluorescence et le champ clair, les onglets des filtres fluorescents pour choisir les filtres appropriés, et les onglets des objectifs pour modifier le grossissement.Une fois que les cellules d'intérêt sont visibles dans la fenêtre vidéo en direct, ajustez la taille du spot utilisé pour marquer les cellules d'intérêt afin qu'elle corresponde approximativement à la taille des cellules. Marquez les cellules d'intérêt en sélectionnant l'icône de point unique, puis en cliquant sur les cellules. Une fois que les cellules sont marquées sur la barre d'outils de microdissection, sélectionnez l'onglet « aller couper et capturer » et le laser infrarouge s'activera automatiquement sur toutes les cellules marquées sélectionnées.Déplacez le capuchon loin de la section et vers une région ouverte de la lame pour vérifier si les cellules sont capturées sur le capuchon LCM. Une fois le prélèvement du tissu terminé, déplacez le capuchon en cliquant avec le bouton droit sur celui-ci, puis sélectionnez « déplacer vers » et ensuite « décharger », comme indiqué dans le protocole écrit. Utilisez la lame traitée pour immunohistochimie comme guide afin de sélectionner la région d’intérêt dans le tissu sur la membrane du stylo. Dans la barre d’outils de microdissection, sélectionnez l’onglet « couper et capturer », puis l’onglet « ligne de coupe » et, en utilisant la lame marquée par immunohistochimie comme référence, délimitez la région d’intérêt sous l’objectif 10 x.Testez, allumez et dirigez les lasers IR et UV comme démontré précédemment. Dans cette vidéo, dans la barre d'outils de microdissection, sélectionnez l'onglet « aller capturer et couper ». Ensuite, déplacez le capuchon LCM hors du tissu pour déterminer si le tissu est retiré de la section et s'attache au capuchon.Lorsque vous avez terminé la collecte des tissus et que vous devez retirer le capuchon, cliquez avec le bouton droit sur le capuchon, sélectionnez « déplacer vers », puis déchargez les micrographies. Ces figures démontrent que la microdissection par capture laser (LCM) est capable d'isoler des neurones dopaminergiques individuels immunoréactifs à la tyrosine hydroxylase à l’aide du laser infrarouge (IR) ou des lasers IR et ultraviolet (UV), car l’utilisation la plus courante des cellules isolées à partir de tissus par LCM est l’analyse de l’ARN. Les protocoles présentés ont été optimisés afin de préserver l’intégrité de l’ARN, comme en témoigne la réduction relative de la hauteur du pic de l’ARNr 28 S par rapport au pic 18 S. La qualité de l’ARN était réduite dans les échantillons de LCM présentant une intégrité moindre après immunohistochimie, suivie d’une fixation à l’acétone, comparée à l’ARN extrait du cerveau entier. Afin de mesurer la quantité d’ARN obtenue à partir de neurones dopaminergiques acquis via la L-C-M-R-N-A, isolés à partir de la région ventrale du tissu après préparation au sérum physiologique, des lames ont été analysées selon la courbe standard générée : un total de 17,3, 24,8 et 50,9 picogrammes par microlitre ont été isolés respectivement à partir de 5, 100 et 200 neurones dopaminergiques.E en utilisant la PCR quantitative pour mesurer la qualité de l'ARN, une gamme de concentrations d'ARN de cerveau entier et d'ARN provenant des neurones dopaminergiques a été transcritue en ADN complémentaire, et le gène de l'actine bêta a été mesuré à partir de ces échantillons. Des concentrations de 3,55, 0,82 et 20,58 picogrammes par microlitre ont été calculées respectivement à partir de 5, 100 et 200 neurones dopaminergiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser le microscope de capture laser pour isoler des neurones dopaminergiques individuels ou pour isoler des régions spécifiques de neurones dopaminergiques.

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