Microdissection laser - une démonstration de l'isolement de la dopamine neurones individuels et de l'Espace ventrale tegmentale entière

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les neurones dopaminergiques à partir de coupes de tissus sur des lames. Ceci est accompli en sectionnant d’abord le tissu ventral congelé du mésencéphale sur des lames stylisées ou des lames de membrane de stylo. Ensuite, les neurones dopaminergiques sont marqués par une immunohistochimie à fluorescence rapide.

Ensuite, le tissu est déshydraté et chargé dans le microscope de capture laser. Ensuite, les neurones dopaminergiques marqués sont fixés à la coiffe LCM à l’aide du laser infrarouge et l’ARN ou la molécule d’intérêt est isolé. Les résultats démontrent qu’il est possible d’obtenir un ARN d’une quantité et d’une qualité suffisantes pour les mesures quantitatives par PCR à l’aide de la microscopie à capture laser.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la dissection macroscopique ou les micro-poinçons, est que les populations cellulaires individuelles peuvent être isolées ou des régions cérébrales très discrètes. Pour se préparer à l’isolement de l’ARN, il faut seline préparer les lames ou le méthylate de polyéthylène ou les lames de verre à membrane de stylo dans une solution de décontamination et utiliser de l’eau libre d’ARN pour les laver trois fois à l’aide d’une série graduée d’ARN sans éthanol, déshydrater les lames et les sécher sous vide pendant 30 minutes avec un cryostat, couper des coupes de tissus de 10 microns d’épaisseur et les monter sur des ARN préparés. Les lames gratuites maintiennent les échantillons congelés pendant la section pour préserver la qualité de l’ARN.

Ensuite, il faut effectuer l’immunohistochimie. Utilisez un stylo hydrophobe pour délimiter les tissus et laissez-les sécher dans une solution individuelle d’acétone et de méthanol. Fixez le mouchoir à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes Après avoir sorti le mouchoir du congélateur, couvrez les sections avec 100 à 200 microlitres d’anticorps anti-tyrosine hydroxylase NPBS et 1 % de tritton pendant 10 minutes.

Utilisez ensuite du PBS avec 1 % de tritton pour rincer les lames avant de recouvrir les sections avec 100 à 200 microlitres d’IgG anti lapin de chèvre, étiqueté avec Alexa Fluor 4 88 incubez pendant cinq minutes, puis utilisez du PBS pour rincer les lames deux fois. Ensuite, déshydratez la série intégrée d’échantillons d’ARN sans éthanol pendant 30 secondes chacun, comme démontré plus tôt dans cette vidéo. Incuber dans du xylène pendant une minute et une seconde, laver pendant cinq minutes.

Retirez les lames immédiatement avant de les utiliser pour LCM et laissez-les sécher à l’air. Après avoir chargé les capuchons LCM et les diapositives et configuré le système LCM selon le protocole texte, ajustez et orientez la capture laser IR pour l’intensité. Placez le capuchon dans une zone de la lame à l’écart du tissu sur la barre d’outils du laser de capture.

Sélectionnez Activer, ajustez l’impulsion de puissance et le nombre de coups du laser. Tirez le laser IR lorsque le capuchon est sur une partie de la lame sans tissu, et vérifiez si le laser fait suffisamment fondre la membrane du capuchon LCM. Après avoir ajusté l’intensité du laser IR, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez le laser de capture pour viser le laser afin d’effectuer un LCM sur des neurones dopaminergiques individuels à partir de lames de préparation de cline.

Commencez par vous déplacer vers la région d’intérêt pour capturer les cellules afin de capturer des cellules individuelles du côté de la préparation de la ligne. Dans la barre d’outils de microdissection, sélectionnez l’onglet LCM, puis l’icône du point unique. Ensuite, dans la barre d’outils du microscope, utilisez l’onglet de l’obturateur pour basculer entre la fluorescence et le fond clair avec les onglets des filtres fluorescents pour choisir les filtres appropriés et utilisez les onglets des objectifs pour modifier le grossissement.

Une fois que les cellules d’intérêt sont visibles dans la fenêtre vidéo en direct, ajustez la taille du spot utilisé pour marquer les cellules d’intérêt à la taille approximative des cellules. Marquez les cellules qui vous intéressent en sélectionnant l’icône du point unique, puis en cliquant sur les cellules. Une fois les cellules marquées sur la barre d’outils de microdissection, sélectionnez l’onglet Go Cut and Capture et le laser IR se déclenchera automatiquement sur toutes les cellules marquées sélectionnées.

Éloignez le capuchon de la section et placez-le sur une région ouverte de la lame pour vérifier si les cellules sont capturées sur le capuchon LCM. Une fois le prélèvement de tissu terminé, déplacez le capuchon en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le capuchon et en sélectionnant déplacer vers, puis décharger comme indiqué dans le protocole de texte, utilisez la lame traitée pour l’immunohistochimie comme guide pour sélectionner la région d’intérêt du tissu sur la membrane du stylo. Dans la barre d’outils de microdissection, sélectionnez l’onglet Couper et capturer, puis sélectionnez l’onglet Ligne de coupe et, à l’aide de la lame étiquetée en immunohistochimie comme guide, tracez le contour de la région d’intérêt sous l’objectif 10 x.

Testez, tirez et dirigez les lasers IR et UV comme démontré précédemment. Dans cette vidéo, dans la barre d’outils de la microdissection, sélectionnez l’onglet Aller capturer et couper. Retirez ensuite le capuchon LCM du tissu pour déterminer si le tissu est retiré de la section et fixez-le au capuchon.

Lorsque vous avez terminé de collecter du tissu pour retirer le capuchon, faites un clic droit sur le capuchon et sélectionnez déplacer pour ensuite décharger les micrographies dans ces figures démontrent que le LCM est capable d’isoler les neurones dopaminergiques immunoréactifs de la tyrosine hydroxylase individuels à l’aide du laser IR ou des lasers IR et UV, car l’utilisation la plus courante des cellules dans les tissus isolés à l’aide du LCM est l’analyse de l’ARN. Les procédures présentées ont été optimisées pour préserver l’intégrité de l’ARN, comme en témoigne une réduction relative de la hauteur du pic S de l’ARNR 28 par rapport au pic 18 S, la qualité de l’ARN a été réduite dans les échantillons de LCM avec une intégrité inférieure après immunohistochimie, suivie d’une fixation à l’acétone par rapport à l’ARN cérébral entier. Pour mesurer la quantité d’ARN obtenue à partir de neurones acquis via L-C-M-R-N-A à partir de neurones dopaminergiques de la région sarcelle ventrale à partir de la préparation saline, des lames ont été isolées sur la base de la courbe standard générée un total de 17,3, 24,8 et 50,9 picogrammes par microlitre ont été isolés à partir de 5, 100 et 200 neurones dopaminergiques respectivement.

E en utilisant la QPCR pour mesurer la qualité de l’ARN, une gamme de concentrations d’ARN et d’ARN du cerveau entier provenant des neurones dopaminergiques a été transcrite inversée et le gène de l’actine bêta a été mesuré à partir de ces mesures. Des concentrations de trois virgule 55, 6 0,82 et 20 virgule 58 picogrammes par microlitre ont été calculées à partir de 5, 100 et 200 neurones dopaminergiques respectivement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le microscope de capture laser pour isoler des neurones dopaminergiques individuels ou pour isoler des régions de neurones dopaminergiques.