Un point de vue technique dans Modern Arbre torique de recherche - Comment surmonter dendroécologique et bois anatomiques défis

L’objectif global de l’expérience suivante est de générer du bois bien reproduit et à haute résolution. Un ensemble de données anatomiques pour étudier les effets du temps et des facteurs environnementaux sur la croissance des arbres et des arbustes. Ceci est réalisé en utilisant un liquide non newtonien pour stabiliser les cellules végétales lors de la section du microtome, ce qui permet une analyse microscopique détaillée des échantillons dans un deuxième temps.

Les micro-sections sont doublement colorées pour faciliter la différenciation des cellules lignifiées et non lignifiées, puis des images numériques sont prises des échantillons. En fin de compte, des analyses cellulaires automatisées de la croissance de la plante et des analyses de séries chronologiques connexes peuvent être effectuées pour permettre l’évaluation des paramètres anatomiques du bois d’intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’envoi de l’échantillon est qu’avec nos techniques, les cellules ne sont pas remplies de sciure de bois, ce qui permet d’obtenir des échantillons de qualité beaucoup plus clairs pour l’analyse d’images.

De plus, l’ajout d’un liquide non Newton dans les cellules pendant la section permet d’éviter la technique fastidieuse d’enrobage de l’échantillon dans de la paraffine. Les nouveaux microtomes que nous verrons dans la vidéo ont été développés dans notre laboratoire, incorporant le centre de Lu Netti des Shang Dubs et de Zurich. Ils se distinguent par une grande stabilité du guidage, ce qui permet de couper des spécimens grands et denses.

Pour l’échantillonnage de tiges d’arbres. Commencez par placer un noyau d’accroissement aiguisé perpendiculairement à l’axe de croissance de la tige de l’arbre. Ensuite, retournez la carotte et utilisez un extracteur pour prélever l’échantillon de carotte résultant de l’arbre.

Étiquetez la carotte avec un identifiant spécifique marqué au crayon doux sur la surface de la carotte et répétez la procédure sur le côté opposé de la tige lorsque tous les échantillons ont été prélevés. Conservez les mandrins étiquetés dans un contenant approprié pour les protéger des dommages pendant le transport. Ensuite, une fois de retour dans le laboratoire, montez les échantillons de carottes dans le sens des fibres, à la verticale sur des poutres de support en bois avec de la colle à bois résistante à l’eau, et laissez-les sécher pour l’échantillonnage des micro-carottes.

Tout d’abord, utilisez un ciseau pour enlever une partie de l’écorce si nécessaire. Placez ensuite un dispositif de poinçonnage spécial perpendiculaire à l’axe de croissance de la tige que vous venez de démontrer, et utilisez un marteau pour pénétrer le xylème de la tige jusqu’à environ deux centimètres de profondeur. Tournez le dispositif de poinçonnage pour casser le micro-noyau résultant à l’intérieur de l’outil.

Retirez ensuite le noyau de la tige et rangez-le dans un micro-tube à centrifuger étiqueté. Pour découper une surface plane sur un échantillon de carotte, commencez par fixer la carotte d’intérêt dans le support de carotte d’un microtome de carotte nouvellement développé pour couper des surfaces planes sur des carottes sur toute leur étendue. Soulevez ensuite le noyau jusqu’à ce qu’il touche légèrement la lame, qui est fixée sur un guidage à roulement à billes sur l’étendue du noyau, et tirez sur la lame pour couper la première partie du haut du noyau.

Ensuite, poussez le couteau derrière le noyau. Soulevez le porte-échantillon d’environ 10 microns et répétez la procédure de coupe jusqu’à environ un tiers de la carotte. Le diamètre est réduit, ce qui permet d’obtenir une surface lisse et continue.

Pour une analyse détaillée de la structure anatomique des échantillons, des micro-coupes doivent être préparées avec un autre type de microtome. Tout d’abord, fixez la carotte d’échantillonnage d’intérêt dans le support du microtome. Positionnez ensuite la lame du microtome guidée par le guidage à roulement à billes et tirez la lame sur le noyau.

Repoussez la lame pour soulever l’échantillon de 20 à 30 microns. Tirez ensuite la lame sur l’échantillon. Encore une fois, répétez ce processus jusqu’à ce qu’une surface continue soit créée sur le dessus de l’échantillon.

Maintenant, à l’aide d’un pinceau, couvrez la surface obtenue avec une solution d’amidon de maïs. Soulevez ensuite l’échantillon de 15 microns et placez la brosse sur la surface de l’échantillon. Tirez lentement les lames vers l’échantillon, en commençant par une fine coupe sous le pinceau et en utilisant le pinceau pour guider la section sur la surface de la lame lorsque toute la section a été coupée.

Utilisez un autre pinceau et de l’eau pour retirer le tissu de la lame et placez-le sur une lame de verre pour permettre de distinguer les structures lignifiées et non lignifiées. Lavez le glycérol avec de l’eau à l’aide d’une pipette. Ensuite, couvrez la partie humide avec quelques gouttes d’un mélange de safran et de bleu astro.

Après cinq minutes, lavez les colorants à l’eau, puis déshydratez immédiatement la section avec des traitements successifs à l’éthanol. Après le traitement à l’éthanol déshydraté, rincez la section à plusieurs reprises à 100 % xol. Dès que le xol reste clair.

Couvrez le mouchoir avec une goutte de baume 100 % Canada et un verre de protection en prenant soin d’éviter les bulles d’air. Placez ensuite la micro-glissière obtenue entre deux bandes de plastique résistant à la chaleur et placez-la sur une plaque métallique. Placez un poids sur le dessus de la glissière pour maintenir la section à plat, puis placez la diapositive dans un four à 60 degrés Celsius.

Après 12 heures, laissez la diapositive refroidir à température ambiante, puis retirez le poids et la bande de plastique. Enfin, nettoyez la lame à l’aide de lames de rasoir pour éliminer tout surplus de baume en suivant les procédures de sectionnement et de coloration présentées avant de pouvoir préparer toutes sortes d’échantillons de différentes tailles et formes, également en utilisant des supports spéciaux pour créer des images numériques des surfaces du noyau pour l’analyse des vaisseaux. Tout d’abord, coupez le plan de surface du noyau avec le microtome du noyau comme nous venons de le démontrer, et utilisez un marqueur de feutre pour teindre la surface résultante en noir.

Dès que le colorant sèche, frottez la surface du noyau avec de la craie blanche, puis enfoncez la craie dans les cellules avec un doigt. Retirez tout excès de craie, puis placez la carotte sur la platine d’un microscope binoculaire équipé d’un appareil photo numérique en commençant par un côté de la carotte. Acquérez maintenant une séquence d’images qui se chevauchent légèrement jusqu’à ce que toute la surface soit capturée.

Ensuite, assemblez les images individuelles pour créer une image complète de la surface centrale afin de créer des images numériques à partir des micro-diapositives. Placez la lame sur la platine du microscope et choisissez le grossissement approprié pour les structures à analyser. Enfin, acquérez des images superposées des sections montées sur les microlames nettoyées, comme cela vient d’être démontré pour l’échantillon de surface de carotte, et assemblez les images pour créer une image complète de la section.

La capacité d’avoir des cellules ouvertes est un premier pas important vers l’adaptation des structures écologiques anatomiques dendrologiques dans une analyse de séries temporelles. Pour une analyse plus détaillée du bois précoce ou des traches tardives dans les conifères, des micro-sections de haute qualité sont nécessaires ici. Les artefacts potentiels tels que les parois cellulaires brisées doivent être évités.

L’application d’un liquide non newtonien à l’échantillon, comme la solution d’amidon de maïs qui vient d’être démontrée, soutient la stabilité de la structure cellulaire. Les micro-sections permettent une détermination plus sûre des rangs annuels. C’est particulièrement vrai pour les conifères qui poussent sur leurs limites naturelles.

Comme on le voit ici, les anneaux extrêmement étroits sont fréquents mais difficiles à détecter macroscopiquement. Dans les cas extrêmes, les anneaux se composent d’une ou deux rangées de cellules, qui peuvent n’être visibles que lors de l’utilisation de micro-sections. Lors de l’analyse d’images à des grossissements élevés, des cellules uniques sont visibles.

Les logiciels d’analyse semi-automatiques permettent de déterminer les modifications de paramètres uniques tels que l’épaisseur de la paroi cellulaire pour tous les anneaux visibles dans l’image, ce qui indique la nécessité d’une analyse de séries chronologiques étendue. La double coloration des micro sections permet de visualiser les différentes étapes de la lignification. Ces informations peuvent ensuite être mises en relation avec les données environnementales de la période de végétation respective afin de déterminer une relation plus détaillée entre la croissance du climat et son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’écologie DRO pour explorer les différents paramètres anatomiques des arbres et des arbustes. L’utilisation de cette méthode réduit considérablement le temps nécessaire à la production de grandes sections de haute qualité. Des précautions telles que travailler sous une hotte et porter des gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des ensembles de données anatomiques bien répliqués et hautement résolus pour soutenir l’analyse des séries chronologiques.