Name: gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez la préparation de gels de polyacrylamide pour étudier l'activité des invadopodes et les forces de traction des cellules cancéreuses. Cette méthode permet d'analyser l'invasion cellulaire selon la rigidité matricielle.

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1. Préparation de verre Lamelles pour AAP <ol><li> Nettoyer les lamelles de 12 mm avec des lingettes charpie faibles. </li><li> Flamme les lamelles de 12 mm et le 14 mm lamelle dans la cupule de chaque verre plat en bas de 35 mm en les faisant passer à travers une flamme du brûleur Bunsen l&#39;aide de pinces. </li><li> Traiter les micropuits avec 200 ul de NaOH 0,1 N pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer et l&#39;air sec les puits pendant 30 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 50 à 100 pl de 3-aminopropyltriméthoxysilane pendant 10 min à température ambiante dans la hotte. Ce produit chimique réagit avec du plastique; par conséquent, utiliser des pipettes en verre et ne remplissez pas complètement les puits pour éviter tout contact avec le plat en plastique. </li><li> Laver les puits avec de l&#39;eau ultra pure pendant environ 10 min jusqu&#39;à ce que le 3-aminopropyltriméthoxysilane devient clair. </li><li> Rincer les puits avec de l&#39;eau ultra pure deux fois en utilisant un flacon souple. </li><li> Laver les puits avec 2 ml d&#39;eau ultra-pure d&#39;unt la température ambiante sur une bascule réglé à une vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 10 min. </li><li> Aspirer et l&#39;air sec les puits pendant 30 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 2 ml de solution de glutaraldéhyde à 0,5% à température ambiante sur un agitateur réglé à une vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 30 min. </li><li> Laver les micropuits avec 2 ml d&#39;eau ultra pure à la température ambiante sur une bascule fixé à vitesse moyenne (~ 1 Hz) pendant 10 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 30 min. </li><li> Micropuits sécher à un angle raide (60 ° ou plus) pendant 30 min. Remarque: Les plats peuvent être stockés pendant deux mois dans un dessiccateur. </li></ol> 2. Préparation des AAP pour invadopodes dosages <ol><li> Pour une solution de l&#39;AAP douce (8% d&#39;acrylamide et 0,05% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 25 ul de 2% BIS, et 574 pi d&#39;eau ultra-pure (tableau 1). </li><li> Pour une solution de l&#39;AAP dur (8% d&#39;acrylamide et 0,35% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 175 &amp; #181; l de 2% BIS, et 409 pi d&#39;eau ultra pure (tableau 1). </li><li> Pour une solution de PAA-rigide (12% d&#39;acrylamide et 0,60% BIS) 1 ml, mélanger 300 pi de 40% d&#39;acrylamide, 300 ul de 2% BIS et 169 pi d&#39;eau ultra pure (tableau 1). </li><li> Dégazer la solution pendant 15 min. Ajouter 200, 215, et 230 ul de 1 mg / ml de fibronectine de plasma humain dans de l&#39;eau ultra-pure aux solutions de PAA tendres, dures et rigides, respectivement. Pour toutes les solutions, ajouter 1 pl de 10 mg / ml d&#39;acide acrylique de N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, 5 ul de 100 mg / ml de persulfate d&#39;ammonium et 2 ul de N, N, N &#39;, N&#39;-tétraméthyléthylènediamine (TEMED ; Tableau 1). Mélanger avec pipetage doux et éviter de créer des bulles dans les solutions. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> AAP (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% (Ul) </td><td> Ultrapure Eau (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Élastique Module (Pa) </td></tr><tr><td> Doux </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Dur </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigide </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Ingrédient volumes et résultant modules élastique pour AAP tendres, dures et rigides utilisés dans les essais de invadopodes. AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = persulfate d&#39;ammonium. <ol start="5"><li> Pipeter 8,48 ul de la solution de PAA sur le centre de chaque micropuits. Remarque: Ce volume donne théoriquement une AAP de 75 um d&#39;épaisseur. </li><li> Abaissez doucement le côté flammé du 12 mm lamelle sur la goutte dans le micropuits l&#39;aide de pinces. </li><li> Laisser la solution de l&#39;AAP sandwich polymériser pendant 15-30 min. Vérifiez la polymérisation en cochant la solution restes. </li><li> Ajouter 2 ml de 1x PBS pour chaque plat et retirez les 12 mm lamelles avec des pincettes. Remarque: 10x PBS est réalisée dans le laboratoire et composée de 0,011 M de KH 2 PO 4, 1,54 M de NaCl, 0,056 M et Na 2 HPO 4. </li><li> Laver les puits avec 2 ml de 1 x PBS à température ambiante pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li></ol> 3. Préparation du PAA pour la force de traction Essais <ol><li> Pour une solution de l&#39;AAP souple (8% d&#39;acrylamide et 0,05% de BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 25 ul de 2% BIS et 566 pi d&#39;eau ultra pure (tableau 2). </li><li> Pour une solution de l&#39;AAP dur (8% d&#39;acrylamide et 0,35% BIS) 1 ml, mélanger 200 pi de 40% d&#39;acrylamide, 175 ul de 2% BIS, et 401 pi d&#39;eau ultra-pure (tableau 2). </li><li> Pour une solution de l&#39;AAP rigide (12% d&#39;acrylamide et 0,60% BIS) 1 ml, mélanger 300 pi de 40% d&#39;acrylamide, 300 pi de 2% BIS, et 161 pi d&#39;eau ultra-pure (tableau 2). </li><li> Dégazer la solution pendant 15 min. Ajouter 200, 215, et 230 ul de 1 mg / ml de fibronectine plasmatique humaine à des solutions de PAA tendres, dures et rigides, respectivement. Soniquer 8 pi de 200 nm microsphères fluorescentes rouges (excitation / émission de 580/605 nm) pendant 30 secondes. Pour chaque solution, ajouter 8 200 pi de microsphères fluorescentes rouges nm,1 ul d&#39;acide acrylique 10 mg / ml de NHS ester, 5 ul de 100 mg / ml de persulfate d&#39;ammonium, et 2 pi de TEMED (tableau 2). Mélanger avec pipetage doux et éviter de créer des bulles dans les solutions. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> AAP (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% BIS (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapure Eau (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td> Micro-sphères (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Élastique Module (Pa) </td></tr><tr><td> Doux </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Dur </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigide </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tableau 2:. Volumes d&#39;ingrédients et résultant modules élastique pour AAP tendres, dures et rigides utilisés dans les tests de force de traction AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = persulfate d&#39;ammonium. <ol start="5"><li> Pipeter 8,48 ul de la solution de PAA sur le centre de chaque micropuits. Remarque: Ce volume donne théoriquement une AAP de 75 um d&#39;épaisseur. </li><li> Abaissez doucement le côté flambé de ee 12 mm lamelle sur la goutte dans le micropuits l&#39;aide de pinces. </li><li> Laisser la solution de l&#39;AAP sandwich polymériser pendant 15-30 min. Vérifiez la polymérisation en cochant solution restes. </li><li> Ajouter 2 ml de 1x PBS pour chaque plat et retirez les 12 mm lamelles avec des pincettes. </li><li> Laver les puits avec 2 ml de 1 x PBS à température ambiante pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li></ol> 4. Préparation de l&#39;ECM pour invadopodes dosages <ol><li> Chauffer la solution de gélatine (1% de gélatine et de 1% de saccharose) à 37 ° C. </li><li> Traiter les PAA avec 150 pi de la solution de gélatine pendant 1 min puis soigneusement aspiration du fond de la cupule lors de la tenue des plats à fond de verre à un angle de 45 °. </li><li> Séchez la mince couche restante de gélatine sur les AAP dans les micropuits à un angle raide (60 ° ou plus) pour optimiser le séchage pendant 60 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 2 ml d&#39;une solution froide de glutaraldéhyde à 0,5% par rapport à iCE pendant 15 min suivie par la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Laver les puits avec 2 ml d&#39;une 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Traiter les micropuits avec 2 ml d&#39;une solution de borohydrure de sodium pendant 1 min. Tapoter doucement plats sur le banc pour éliminer les bulles qui se forment sur la surface de la gélatine. </li><li> Aspirer et laver les puits avec 2 ml d&#39;une 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Diluer une solution de fibronectine plasmatique humaine marqué au FITC à 50 pg / ml avec PBS 1x et une centrifugation à 175 000 xg à 4 ° C pendant 15 min. Soit acheter disponible dans le commerce fibronectine marqué ou étiqueter comme suit: <ol><li> Dissolvez 5 mg de fibronectine dans 10 ml de tampon borate (170 mM métaborate de sodium tétrahydraté et 40 mM de NaCl) et le lieu dans un tube de dialyse. </li><li> Étiquette de la fibronectine en plaçant le tube dans 200 ml de tampon borate contenant 6 mg de FITC dissous à température ambiante sur un agitateur magnétiquefixé au niveau le plus bas pendant 1,5 heure dans l&#39;obscurité. </li><li> Dialyser avec 500 ml d&#39;une 1x PBS sur un agitateur magnétique réglé à la température minimum pendant 3 jours dans une pièce sombre et froide (4 ° C) avec deux volumes change un jour. </li><li> Concentration de fibronectine Calculer marqué au FITC en fonction de la densité optique des fractions aliquotes diluées (1: 200) à 280 nm et 493 nm, telle que [OD 280 - (0,36 x DO 493)] / 1,4 fois le facteur de dilution de 200 fois 2 (qui représente pour la concentration de la fibronectine glycérol dans l&#39;étape suivante) résultant en unités mg / ml. </li><li> Dialyser nuit dans une solution de glycérol de 50% sur un agitateur magnétique réglé à la position la plus basse durant la nuit dans une chambre froide obscurité à 4 ° C.) </li></ol></li><li> Traiter les micropuits avec 150 ul de la solution de fibronectine marqué au FITC à la température ambiante pendant 60 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Aspirer soigneusement la solution de fibronectine marqué FITC du fond de la cupule lors de la tenue des plats à fond de verre auun angle de 45 °, puis de remplir les boîtes à fond de verre avec une solution d&#39;éthanol à 70% à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte sombre de culture cellulaire pour la stérilisation. Remplissez également à fond de verre couvercles des capsules ou essuyer avec des lingettes de peluches bas trempés dans 70% d&#39;éthanol. </li><li> Lavez la vaisselle à fond de verre en les remplissant de 1x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus avec 2 ml de PBS 1x, pour un total de 15 min. </li></ol> 5. Préparation et imagerie de invadopodes dosages <ol><li> Ajouter 25,000 cellules cancéreuses dans 2 ml de milieu de invadopodes (1: 1 de DMEM et de milieu RPMI 1640 avec 5% de sérum faible teneur en protéines, le sérum de veau fœtal à 10%, et 20 ng / ml de fraîchement ajoutée facteur de croissance épidermique) aux plats à fond de verre et incuber une nuit. </li><li> Aspirer et traiter les micropuits avec 2 ml d&#39;une solution de paraformaldehyde à 3,7% à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 20 min pour fixer les cellules. </li><li> Après deux lavages rapides avec 2 ml de PBS 1x, traiter les puits avec 2 ml d&#39;un Triton X-100 solution à 0,1% à la chambre Temperature dans l&#39;obscurité pendant 5 min pour perméabiliser les cellules. </li><li> Après un lavage rapide avec 2 ml de PBS 1x, traiter les micropuits avec 3% d&#39;albumine de sérum bovin solution de blocage à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 60 min pour bloquer les cellules. </li><li> Incuber les puits avec 150 ul d&#39;anticorps de souris anti-cortactine (1: 750) en solution à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 60 min blocage. </li><li> Laver les micropuits avec 2 ml de 1 x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Incuber les puits avec 150 ul d&#39;anticorps de chèvre anti-souris 633 d&#39;anticorps (1: 500) et 546 phalloïdine (1: 750) en solution à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 60 min blocage. </li><li> Laver les micropuits avec 2 ml de 1 x PBS pendant 5 min. Répéter deux fois de plus pour un total de 15 min. </li><li> Ajouter six gouttes de milieu de montage pour remplir chaque puits et couvrir avec 22 x 22 lamelles. </li><li> Cortactine et l&#39;actine image pour identifier invadopodes utilisant excitation et d&#39;émission filtres de 632/647 nm et556/570 nm, respectivement, en utilisant un haut NA, 40X lentille à immersion d&#39;huile sur un large champ microscope inversé. De même, l&#39;image de la fibronectine à identifier la dégradation de l&#39;ECM en utilisant un filtre d&#39;excitation et d&#39;émission de 492/518 nm. </li></ol> 6. Préparation et imagerie de la force de traction Essais <ol><li> Ajouter 15,000 cellules cancéreuses dans 2 ml de milieu de invadopodes de la vaisselle à fond de verre et incuber pendant une nuit. </li><li> Support d&#39;Aspirer dans les boîtes à fond de verre et le remplacer par 2 ml de milieu L-15, avec les mêmes suppléments (5% de sérum faible teneur en protéines, le sérum de veau fœtal à 10% et 20 ng / ml de fraîchement ajoutée facteur de croissance épidermique), pré -warmed à 37 ° C. </li><li> Incuber les boîtes à fond de verre dans une chambre environnementale sur un microscope inversé pré-équilibrée à 37 ° C avec une humidité élevée pendant 1 heure. </li><li> Prendre quatre ensembles d&#39;images en utilisant une haute NA, 40X lentille sur un microscope inversé à grand champ avec une étape automatisée pour marquer les positions cellulaires: <ol><li> cellules image surp des AAP en utilisant le contraste de phase (de l&#39;image &quot;de phase&quot;). </li><li> Image microsphères fluorescentes utilisant excitation et d&#39;émission de 560/645 nm filtres en mettant l&#39;accent légèrement sous les cellules jusqu&#39;à ce que la première couche de microsphères en haut de l&#39;AAP est au point (&quot;souligné&quot; l&#39;image). </li><li> En outre, se concentrer sur le fond de l&#39;AAP (en utilisant les microsphères comme marqueurs) et prendre une image (&quot;bas&quot; image). Remarque: Le but de cette image est pour enregistrer la position z pour obtenir l&#39;épaisseur de l&#39;AAP réelle à chaque position pour le calcul de la force de traction comme décrit dans Les résultats représentatifs. </li><li> Après ces images ont été acquises à plusieurs positions, mélanger doucement dans 220 pi de solution à 10% de Triton-X pour enlever les cellules. microsphères de l&#39;image en haut de la PAA à chaque position comme décrit précédemment (image de &quot;null&quot;). </li></ol></li></ol>

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Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health en vertu Prix Nombre K25CA143412 (Parekh). Nous tenons à souligner que le soutien supplémentaire a été fourni par le Département d&#39;ORL. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Nous présentons une méthode pour fabriquer AAP qui peuvent être utilisés comme base pour invadopodes et de la force de traction des essais de corréler les comportements cellulaires invasives et contractiles. Alors que PAA ont longtemps été utilisés pour examiner les effets de rigidité sur les cellules et calculer les forces de traction 18,24,27, ce protocole est le premier à développer des tests parallèles fondés sur PAA avec les mêmes rigidités de corréler les comportements cellulaires invasives et contracti...

La rigidité de l&#39;ECM associé à une tumeur a été identifiée comme un facteur important dans la conduite de comportement malin en augmentant la contractilité actomyosine 1-3. Bien que cet effet a principalement été mise en évidence avec des cellules de cancer du sein, de la matrice de rigidité se est avérée modifier les propriétés invasives de cellules dérivées d&#39;une variété de cancers 08.04 suggérant que la rigidité de la tumeur peut jouer un rôle dans d&#39;autres types de cancers. Pour pénétrer les tissus réticulés pendant la migration invasive, les cellules cancéreuses utilisent saillies adhésives actine riches appelés invadopodes que localiser protéases pour dégrader focalement l&#39;ECM neuf. Invadopodes sont considérées comme une caractéristique de cellules invasives et ont été impliqués dans l&#39;invasion des cellules tumorales et des métastases 10,11. Des travaux antérieurs ont montré que la matrice de rigidité peut réguler numéros de invadopodes et la dégradation de l&#39;ECM 4,12 associée par l&#39;activité myosine II et protéines mécanosensibles 12. Compte tenu ducorrélation entre la densité de la tumeur et l&#39;agressivité du cancer 13,14, ces résultats suggèrent un mécanisme par lequel les cellules cancéreuses peuvent répondre aux tissus tumoraux rigides à conduire invasion et métastases travers contractilité actomyosin. Il a été démontré in vitro ECM rigidité et de la densité des tissus in vivo pour réglementer le comportement invasif des cellules cancéreuses 1,15-17. Alors que actomyosine contractilité semble être important dans ce processus, les études actuelles conflit quant à savoir si la capacité métastatique est corrélée à une augmentation ou diminution de forces contractiles 6,18-20. En outre, il ne sait pas si ces forces médiation directement l&#39;activité de invadopodes 21. Nous avons récemment découvert que les forces de contraction des cellules cancéreuses étaient dépendants de la rigidité et la matrice étaient prédictifs de dégradation ECM par invadopodes 5. Ces résultats suggèrent que les forces cellulaires peuvent jouer un rôle important dans la progression du cancer par la médiation invadopodes activité en réponse aux propriétés mécaniques du micro-environnement de la tumeur. Afin de corréler propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses 5, nous avons modifié un protocole pour la création de PAA avec différentes rigidités qui a été précédemment utilisés pour enquêter sur les activités de invadopodes rigidité dépendante 4,12,22. Par réticulation chimique de la fibronectine de plasma humain à travers le FQA, ces hydrogels modifiés peuvent être utilisés comme base pour les deux dosages invadopodes et des forces de traction afin de se assurer que les cellules ont subi les mêmes rigidités dans les deux expériences 5. Dans les dosages de invadopodes, la fibronectine fournit un domaine de liaison naturel pour la gélatine pour lier l&#39;ECM superposée à l&#39;AAP pour détecter la dégradation de la matrice. Dans les essais de la force de traction, la fibronectine fournit un ligand pour l&#39;adhésion cellulaire direct à détecter des déplacements de microsphères utilisées dans le calcul des forces de traction cellulaires. Cette méthode aboutit à ce que nous avons appelé doux, dur,AAP et rigides qui sont liés à des plats à fond de verre et ont des modules élastiques, E, de 1023, 7307, et 22 692 Pa 5 qui couvrent la gamme de propriétés mécaniques rapportés pour les tissus normaux et cancéreux 23.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (40 %)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Acide acrylique NHS ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>préparer frais dans une hotte 10 mg/ml dans du DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 phalloïdine</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>peut également utiliser de la rhodamine</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>préparer une solution fraîche à 10 % dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>utiliser 6 gouttes pour remplir les micropuits</td></tr><tr><td>BIS (2 %)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>faire 3 % pour la solution de blocage dans 1x PBS et stocker dans 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Lamelles de recouvrement (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>tubulure de dialyse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>pré-équilibrage dans un tampon de borate pendant 15 à 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>utilisation pour fabriquer un milieu</td></tr><tr><td>d’invasion DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>utilisation pour fabriquer de l’acide acrylique Solution d’ester NHS</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique Vie</td><td> Technologies</td><td>PHG0311</td><td>utiliser pour fabriquer un milieu invadopodia</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>diluer avec de l’eau ultrapure à 70 %</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>utiliser pour fabriquer un milieu invadopodia</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>préparer généralement 10 ml de solution de saccharose à 1 % et de gélatine à 1 % dans du PBS et conserver à 4 &deg ; C (préchauffer le PBS pour dissoudre facilement la gélatine)Plats</td></tr> <tr><td>à fond en verre (lamelles de 35 mm)</td>Les lamelles <td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>sont non enrobées</td></tr><tr><td>de glutaraldéhyde (25 %)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>diluer avec 1x PBS à 0,5 %</td></tr> <tr><td>Anticorps anti-souris Alexa Fluor 633 de chèvre</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine de plasma humain</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>ajouter 5 ml d’eau ultrapure pour obtenir 1 mg/ml ; aliquote en volumes en fonction de l’utilisation pour éviter des cycles de congélation et de décongélation excessifs</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>utiliser pour faire 10x stock PBS</td></tr><tr><td>Souris anti-cortactine 4F11</td><td>anticorps EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>utiliser pour faire 10x stock PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>à utiliser pour fabriquer 10x PBS stock et tampon borate</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>dilué avec de l’eau ultrapure à 0,1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (sérum à faible teneur en protéines)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>utiliser pour fabriquer invadopodia milieu</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>faire généralement 10 % de stock dans 1x PBS, préparer dans une hotte et ajouter quelques ml de NaOH fort pour dissoudre facilement le paraformaldéhyde, puis ramener à pH 7,4 avec un HCl)</td></tr><tr><td>PBS fort (stérile)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>utilisation pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>utilisation pour faire invadopodia milieu</td></tr><tr><td>Borohydrure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>préparer frais dans une hotte 1 mg/ml dans 1x PBS</td></tr><tr><td>Métaborate de sodium tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>utiliser pour faire un tampon de borate</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>généralement faire 10 ml de solution de saccharose à 1 % / 1 % de gélatine dans du PBS et stocker à 4 & deg ; C (préchauffer le PBS pour dissoudre facilement la gélatine)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>faire 10 % de stock dans 1x PBS et utiliser tel quel pour l’élimination des cellules dans le test de force de traction ou diluer avec 1x PBS pour la coloration</td></tr></tbody></table>

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction les essais sur les cellules cancéreuses

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Tissus tumoraux rigides ont été fortement impliqué dans la régulation de la migration cellulaire et l&#39;invasion du cancer. La migration invasive à travers les tissus réticulés est facilitée par des saillies d&#39;actine riches appelés invadopodes qui dégradent protéolytique la matrice extracellulaire (ECM). invadopodes activité a été démontré que la rigidité dépendante de l&#39;ECM et des cellules cancéreuses ce qui suggère que les forces de contraction des signaux de rigidité peuvent réguler ces structures sous-cellulaires à travers actomyosine contractilité. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses peuvent être corrélées in vitro en utilisant des tests de invadopodes et de la force de traction basés sur des gels de polyacrylamide (PaaS) de rigidités différentes. Bien qu&#39;il existe quelques différences entre les deux essais, le protocole présenté ici fournit un procédé pour créer FQA eà peut être utilisé dans les deux essais et sont facilement adaptables aux besoins biologiques et techniques spécifiques de l&#39;utilisateur.

Dans le test de invadopodes, invadopodes sont généralement identifié par colocalisation des marqueurs comme l&#39;actine et cortactine les structures ponctuées dans le corps cellulaire (figure 1). Les deux invadopodes dégrader activement et non dégradantes peut être compté et se différencient par le fait que ces structures sont colocalisés avec des zones dépourvues de noir dans le signal fluorescent fibronectine marqué au FITC (figure 1). Invadopodes sont comptées manuellement, et la dé...

Rigidité mécanique dans le microenvironnement de la tumeur joue un rôle crucial dans la conduite de comportement malin en augmentant l&#39;activité de invadopodes et contractilité actomyosin. En utilisant des gels de polyacrylamide (PaaS), invadopodes et de force de traction tests peuvent être utilisés pour étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses en réponse à la matrice de rigidité.

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

L'objectif général de cette procédure est de créer des gels de polyacrylamide pouvant être utilisés dans des tests d'envahissement, de podia et de forces de traction afin d'étudier les propriétés invasives et contractiles des cellules cancéreuses. Cela est réalisé en activant d'abord les lamelles de 14 millimètres dans les boîtes en verre de type « glass blossom » pour garantir que les gels de polyacrylamide adhèrent au verre. Ensuite, des solutions de polyacrylamide pour les deux types de tests sont préparées afin d'obtenir des gels présentant des rigidités ou des propriétés mécaniques différentes.Ensuite, les tests de podia envahis sont préparés avec une fine couche de matrice extracellulaire marquée aux fluorochromes afin de détecter la dégradation. Enfin, les tests sont ensemencés avec des cellules cancéreuses pour une incubation nocturne, suivie d'une fixation et d'une coloration de l'envahisseur, des plaques de podia et d'une imagerie en temps réel des plaques de force de traction. En définitive, la microscopie à fluorescence est utilisée pour visualiser l'envahisseur, les podia et la dégradation de la matrice extracellulaire.Bien que la microscopie à fluorescence et la micro

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Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques expérimentales utilisées pour fabriquer conforme, la matrice extracellulaire (ECM) substrats recouverts adapté à la culture cellulaire, et qui se prêtent à la microscopie à force de traction et en observant les effets de la rigidité d'ECM sur le comportement cellulaire.

Préparation des matrices plainte pour quantifier la contraction cellulaire

Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cette vidéo décrit le test de microscopie à force de traction. Le test détermine la traction cellulaire des cellules cancéreuses du côlon humain sur la matrice extracellulaire présente sur un hydrogel élastique mou ayant des billes fluorescentes intégrées. Le déplacement résultant des billes fluorescentes est mesuré à l’aide d’un logiciel approprié.

Dosage de la cytométrie de traction : une méthode pour quantifier la force de traction exercée par les cellules cancéreuses sur l’ECM

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Notre laboratoire a développé des hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé, un système d'hydrogel dynamique, afin de mieux comprendre les effets de la modulation de la rigidité des tissus sur la fonction cellulaire. Ici, nous fournissons des schémas, des descriptions et des protocoles pour préparer ces hydrogels.

Préparation de l&#39;ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

Un protocole est décrit pour extraire des cellules humaines primaires de la tumeur du côlon chirurgical et des tissus normaux. Les cellules isolées sont ensuite cultivées sur des substrats élastiques souples (hydrogels de polyacrylamide) fonctionnalisés par une protéine de matrice extracellulaire, et noyées dans des microbilles fluorescentes. La cytométrie de traction est réalisée pour évaluer les stress contractiles cellulaires.

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Ici, une méthode qui permet une préparation rapide, efficace et peu coûteuse de gels de polyacrylamide dans un format de plaque multipuits est décrite. La méthode ne nécessite aucun équipement spécialisé et pourrait être facilement adoptée par n’importe quel laboratoire de recherche. Il serait particulièrement utile dans les recherches axées sur la compréhension des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité.

Multiwell Rigidité Essai pour l&#39;étude des réponses cellulaires Rigidité-dépendantes simple à base de polyacrylamide

La différenciation cellulaire est régulée par une foule de facteurs microenvironnement, y compris les propriétés de la composition de la matrice et de matériaux de substrat. Nous décrivons ici une technique utilisant des puces à ADN de cellules en conjonction avec une force de traction au microscope pour évaluer la différenciation des cellules et les interactions cellule-substrat biomécaniques en fonction du contexte microenvironnement.

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

La migration collective des cellules dans le développement, la cicatrisation des plaies et la métastes du cancer est souvent guidée par les gradients des facteurs de croissance ou des molécules de signalisation. Décrit ici est un système expérimental combinant la microscopie de traction avec un système microfluidique et une démonstration de la façon de quantifier la mécanique de la migration collective sous gradient biochimique.

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Nous décrivons les améliorations apportées à une méthode standard de mesure des forces de traction cellulaire, basée sur l’impression par microcontact avec une seule étape de motif soustractif de réseaux de points de protéines de matrice extracellulaire sur des hydrogels mous. Cette méthode permet une fabrication plus simple et plus cohérente de motifs d’îlots, essentiels pour contrôler la forme des amas de cellules.

Génération de motifs pour la microscopie de traction à micromotifs

Découvrez la préparation de gels de polyacrylamide pour étudier l'activité des invadopodes et les forces de traction des cellules cancéreuses. Cette méthode permet d'analyser l'invasion cellulaire selon la rigidité matricielle.

gels de polyacrylamide pour invadopodes et la force de traction Les essais sur les cellules cancéreuses

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