Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des cellules de levure pour trouver les processus biologiques ciblés par un produit chimique d’intérêt. Pour ce faire, il faut d’abord déterminer le profil dose-réponse d’un produit chimique pour la levure. La deuxième étape consiste à cultiver une collection complète de souches de gènes de levure sur une dose sublétale de produit chimique et sur une plaque de contrôle.

Ensuite, les mutants de levure qui sont hypersensibles au produit chimique sont identifiés. Cette liste est analysée bio-informatiquement pour révéler tous les gènes nécessaires pour tolérer le produit chimique. La dernière étape consiste à effectuer une réplication biologique de l’expérience à faible débit.

Cela valide toutes les interactions chimiques entre les gènes trouvées. En fin de compte, cette méthode de criblage génétique chimique à haut débit est utilisée pour montrer quels produits géniques et quelles voies biologiques sont utilisés pour tolérer le produit chimique d’intérêt. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la croissance compétitive des mutants à code-barres en culture liquide est qu’aucune technique de biologie moléculaire n’est requise.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie chimique, telles que la façon dont une nouvelle petite molécule peut inhiber la croissance des cellules eucaryotes. Pour commencer, préparez une culture de levure pendant la nuit en striant BY 4 7 4 1 cellules sur une plaque A-Y-E-P-D et incubez pendant 48 heures à 30 degrés Celsius ou jusqu’à ce que des colonies visibles se forment. Lorsque les colonies sont prêtes.

Préparez des cultures liquides pendant la nuit en prélevant une seule colonie et en inoculant cinq millilitres de milieu liquide YEPD dans un récipient stérile. Ensuite, incubez pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec une rotation ou une agitation continue. Ensuite, préparez un milieu gélosé solide contenant diverses doses du produit chimique à tester.

Pour ce faire. Tout d’abord, préparez plusieurs solutions mères du produit chimique d’intérêt à 100 fois la concentration finale dans un solvant approprié. Ensuite, pour chaque concentration à tester, aliquote trois millilitres de gélose YEPD fondue dans plusieurs tubes de culture stériles.

Fondez les tubes contenant la gélose dans un bain-marie à 55 degrés Celsius pour éviter la solidification de la gélose. Maintenant, pour chaque concentration de produit chimique à tester à 13, la libération blanche du composé 100 x dans une aliquote de gélose tex fondue, le tube pendant deux à trois secondes pour mélanger puis pipeter un millilitre de chaque tube dans des puits en double dans une plaque de 12 mondes, laisser la plaque prendre toute la nuit à température ambiante. Le lendemain, inoculez 10 millilitres de milieu liquide YEPD avec deux microlitres de levure de levure saturée pendant la nuit.

Ensuite, pipetez 25 microlitres de cette culture sur le produit chimique contenant de la gélose dans les puits de la plaque de 12 baleines et étalez-les uniformément à l’aide de billes de verre stériles ou d’une tige stérile. Laissez la plaque sécher à la flamme, puis incubez la plaque à 30 degrés Celsius pendant 48 heures. Une fois le temps d’incubation écoulé, évaluez le nombre total et la taille des colonies dans les puits.

Identifiez une concentration sublétale de composé qui n’inhibe pas la croissance de plus de 10 à 15 % à utiliser dans l’écran. Maintenir le taux de mutant de délétion à une densité de 384 colonies par plaque en répliquant sur 16 plaques de gélose YEPD, contenant 200 microlitres par millilitre de G quatre 18. À l’aide d’un système robotique de mise en réseau microbienne ou d’outils d’épinglage manuel tous les trois mois.

Conservez les plaques à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Préparez ensuite 250 millilitres de milieu gélosé YEPD avec la même concentration de G, quatre, 18 ou cinq plaques de gélose, et laissez-les refroidir toute la nuit à température ambiante sur une surface plane et uniforme. Retirez les plaques contenant la collection de mutants de délétion de l’entreposage à quatre degrés Celsius et laissez-les revenir à température ambiante.

Utilisez une lingette délicate pour éliminer toute condensation qui s’est formée sur le couvercle de chaque plaque afin d’éviter que des gouttelettes d’eau ne se déposent sur le réseau et que la contamination croisée des mutants du réseau ne se produise. Demandez au robot d’épinglage de réseau microbien de condenser le réseau de mutants de délétion d’une densité de 384 colonies par plaque sur 16 boîtes de Pétri à 1 536 colonies par plaque sur quatre boîtes de Pétri. Après avoir incubé le réseau à 30 degrés Celsius pendant la nuit, examinez le réseau pour assurer un transfert uniforme des colonies à partir des plaques sources.

Il y aura plusieurs positions vides incorporées dans le réseau, qui servent de guide pour que le réseau de mutants de délétion ait été correctement condensé. Il s’agira des plaques sources utilisées pour la réplication sur des supports contenant le composé qui vous intéresse. Une seule plaque source peut être utilisée pour plusieurs épinglages.

De plus, de nombreux robots ont des caractéristiques de décalage qui permettront, ce qui garantira un nombre similaire de levures transférées à chaque fois. Pour mettre en place la réparation de la réplique du réseau de mutants par suppression de plaque, 700 millilitres de véhicule de contrôle uniquement et une gélose expérimentale YEPD contenant le produit chimique d’intérêt. C’est suffisant pour effectuer le dosage en trois exemplaires.

Versez les assiettes à l’aide de l’agar de contrôle et expérimental. Ajouter 50 millilitres dans chaque assiette. Laissez les plaques refroidir à température ambiante pendant la nuit sur une surface plane et uniforme, en utilisant le robot pour reproduire une plaque.

Inoculez le réseau de deux mutants sur trois ensembles de plaques contenant des produits chimiques à la concentration déterminée expérimentalement, ainsi que sur des réinitialisations de plaques contenant le contrôle du véhicule. Incuber les plaques sur la paillasse à température ambiante pour un total de 24 à 48 heures d’image. Les plaques ont une incubation de 24 et 48 heures en retirant le couvercle et en les plaçant face vers le bas sur un scanner à plat.

Capturez des images à une résolution d’au moins 300 DPI. Vous pouvez également utiliser un appareil photo numérique pour capturer des images. Si vous le faites, placez les assiettes face vers le haut sur un fond sombre et retirez les couvercles pour imager.

Ensuite, effectuez la quantification et la comparaison de la taille des colonies de réseaux à l’aide de l’un des nombreux programmes open source, y compris les outils SGA à billes et le broyeur à tamis. À ce stade, plusieurs mutants de délétion de levure seront considérés comme hypersensibles au produit chimique d’intérêt et sortiront les mutants hypersensibles souhaités de la collection de délétion de levure sur YEPD. Ager contenant 200 microgrammes par microlitre de G quatre 18 incuber à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies se forment.

Après avoir vérifié le génotype de la souche par PCR diagnostique et électrophorèse Agel, inoculez cinq millilitres de liquide YPD avec chaque souche et incubez pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec rotation ou agitation. Mesurer la DO 600 de chaque culture et diluer chaque souche à une DO 600 d’une dans de l’eau distillée stérile. Ce sont maintenant les cultures de levure normalisées.

Ensuite, distribuez 100 microlitres de type sauvage normalisé par 4 7 4 1 culture de levure dans le puits A d’une plaque de 96 puits distribuez 100 microlitres de jusqu’à sept souches supplémentaires dans les puits, B un à H un. Ensuite, distribuez 90 microlitres d’eau stérile dans les puits, de A deux à H deux à six à H six. Enfin, préparez une série de une à 10 dilutions de sculptures G normalisées.

Commencez par pipeter en série 10 microlitres de la première à la deuxième colonne à l’aide d’une pipette multicanaux et continuez sur la plaque à 96 puits jusqu’à ce que six dilutions soient effectuées. Ensuite, utilisez la pipette multicanaux pour atteindre deux à cinq microlitres de cultures de levure diluées dans une grille sur des YEP D, des milieux solides contenant des produits chimiques et un contrôle de véhicule. Incuber les plaques à la température appropriée pendant 24 à 48 heures après l’incubation.

Inspectez les plaques et comparez la sensibilité de certains mutants aux produits chimiques par rapport aux plaques d’image de contrôle BY 47 41 à 24 et 48 heures. Comme précédemment, les images suivantes montrent les résultats de la procédure de détermination de la concentration sous-inhibitrice du produit chimique. La première image montre la croissance d’une culture saturée de BY 4 7 4 1 diluée de un à 5 000 et plaquée sur des concentrations croissantes de cinq fluorouraciles.

La concentration de 10 micromolaires est choisie comme dose inhibitrice sous-in. Cette image montre la courbe de croissance de cellules BY 4 7 41 dans des milieux liquides contenant cinq fluro uracile. Environ quatre fois 10 à quatre cellules ont été déposées en trois exemplaires et des concentrations croissantes de cinq densités fluoro-uraciles et optiques ont été mesurées toutes les 10 minutes pendant 22 heures.

Encore une fois, on peut voir que la dose de 10 micromolaires est la dose inhibitrice de la sous-ine. Les images suivantes montrent les résultats d’une génétique chimique verte de cinq fluoro-uraciles. Ici, un réseau de mutants de délétion de S sachar visier répliqué sur une gélose YPD contenant 10 micromolaires cinq uraciles fluorés à droite et un contrôle DMSO à gauche est montré.

Ce graphique montre les résultats de la génétique chimique verte, la croissance relative des mutants sur 10 micromolaires. Cinq uraciles fluorés par rapport au contrôle DMSO sont ordonnés par une position de rayon ici. La croissance relative des mutants sur 10 micromolaires, cinq flores uraciles par rapport au contrôle DMSO est ordonnée par rapport à la taille de la colonie.

Un seuil de rapport inférieur à 0,8 est indiqué sur les deux graphiques. Cette image finale montre les résultats de trois tests de validation. Des dilutions en série de plusieurs souches mutantes isolées ont été cultivées sur le contrôle DMSO à gauche, 10 micromolaires, cinq fluoro UIL au centre et 0,015 % de méthylméthane sulfonate à droite.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de s’assurer que vous travaillez avec une copie fiable de la matrice de mutants de délétion et de valider les résultats à l’aide d’une méthodologie indépendante telle que des tests de repérage de levure ou une dissection de tétrade de levure. Cette technique offre aux scientifiques dans le domaine de la recherche sur les petites molécules un moyen efficace d’explorer le mode d’action d’un composé à l’aide d’approches systémiques chez la levure bourgeonnante.