Name: Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et limmunosuppression des préparations de produits combustibles tabac (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez des méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles du tabac en utilisant des PBMCs humains et la cytométrie en flux. Ces techniques permettent d'analyser la sécrétion de cytokines et l'activité cytolytique des cellules immunitaires.

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Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d&#39;un accord de collaboration de recherche avec l&#39;École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.

NOTE: le consentement éclairé de faire cette étude a été obtenue à une unité clinique locale de recherche sous approbation de l&#39;IRB, par les bonnes pratiques cliniques. Traitement du sang, l&#39;isolement des PBMC et d&#39;autres expériences de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions stériles, l&#39;utilisation de consommables et réactifs microbiologiquement stérile. 1. Préparation WS-CM <ol><li> Générer WS-CM comme décrit précédemment 12. <ol><li> Préparer WS-CM en passant la fumée de quatre 3R4F cigarettes de référence grâce à Roswell Park Institute Memorial (RPMI) 1640 milieu sans rouge de phénol, avec un schéma de fumer suivante: 35-60-2, volume de bouffée en ml, intervalle entre chaque bouffée en sec, et la durée feuilletée en sec, respectivement. Chaque préparation génère un échantillon de 20 ml. </li></ol></li><li> tube (s) de l&#39;étiquette avec la date, l&#39;heure d&#39;achèvement, et le nom et le numéro de cigarette. Conserver les 500 ul aliquotes à -80 ° C immédiatement après le tabagisme est terminée. </li><li> Analyser aliquotes de WS congelés-CM Pour déterminer les niveaux de nicotine, les nitrosamines spécifiques du tabac, et les hydrocarbures aromatiques polycycliques comme décrit précédemment 12. </li></ol> 2. Isolement de PBMC <ol><li> Prélever le sang frais provenant de donneurs sains (qui sont des non-consommateurs de produits du tabac) Isoler PBMC de sang frais comme décrit ci-dessous sous une approbation distincte du Wake Forest Baptist Health CISR 15. <ol><li> Avant l&#39;arrivée de la poche de sang, une bouteille de 500 ml, des ciseaux, un tampon d&#39;isolement et tamponnée au phosphate salin de Dulbecco (DPBS) (RT) prêt à un niveau de biosécurité 2 (BSL-2) culture de cellules capot. tampon d&#39;isolement doit être protégé de la lumière. </li><li> Tenir le sac de sang à l&#39;envers et couper le tube juste au-dessous où il a été serré laissant au moins 3 cm de tube. </li><li> Retirez le bouchon de la bouteille de 500 ml et de maintenir le tube dessus de l&#39;ouverture de la bouteille. Ramassez le sac de sang et l&#39;inverser pour permettre au sang de circuler librement dans le sac dans til bouteille jusqu&#39;à ce que le sac est vide. Laisser le sang de circuler sur le mur intérieur de la bouteille vers le bas par rapport à éviter la formation de bulles. </li><li> Verser le tampon d&#39;isolement dans la bouteille à un rapport de 1: 5 de tampon d&#39;isolement de sang. Boucher le flacon et inverser doucement, fin-over-end, 10 fois. Laisser le flacon dans la hotte de culture de cellules à incuber avec des lumières, pour une heure à température ambiante. </li><li> Une couche de lumière, couleur paille va construire au-dessus du sang. Enlever cette couche à l&#39;aide d&#39;un 25 ml pipette sérologique dans 50 ml tubes coniques. Le montant perçu peut varier de 50 à 300 ml, en fonction du sujet qui a fait don de sang. </li><li> Centrifuger les tubes à 200 xg pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant translucide, laissant le sang-pastille de couleur sombre. Le culot sera en vrac, mais visqueux. </li><li> Pipette 3 ml de tampon d&#39;isolement dans 15 ml tubes coniques. </li><li> Pour remettre en suspension le culot, ajouter 20 ml de DPBS pour tous les 50 ml de liquide de couleur paille recueillies dans sTep 2.1.5. Vortex pour bien mélanger, et de consolider le liquide remis en suspension à partir de tubes multiples. Ce liquide contient en suspension des cellules sanguines. </li><li> Avec une pipette de transfert, le transfert de 5 ml de globules en suspension sur 3 ml de tampon d&#39;isolement dans l&#39;étape 2.1.8. Incliner le tube conique de 15 ml contenant la suspension de cellules doucement et lentement pour créer deux couches séparées. Centrifuger les tubes à 400 xg pendant 40 min à température ambiante avec une accélération minimale et sans frein. </li><li> Utilisez une pipette de transfert pour enlever la couche résultant trouble du milieu (buffy coat) contenant PBMC dans un tube conique de 50 ml. Éviter de tirer d&#39;autres couches claires en dessous. Transfert pas plus de 25 ml dans chaque 50 ml tube conique. </li><li> Ajouter 25 ml de tampon froide (ou plus pour remplir la totalité du volume restant de la 50 ml tube conique) pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot avec 10 ml de tampon en cours d&#39;exécution. Celui-ci contient des PBMC. Compter les cellules et utiliser immédiatement ou placer sur la glace pour la congélation. </li></ol></li></ol> 3. congélation et la décongélation de la CMSP <ol><li> Centrifugeuse les PBMC qui ont été recueillies à l&#39;étape 2.1.13 pendant 10 min à 400 x g. </li><li> Remplir le récipient de congélation avec de l&#39;alcool isopropylique selon les instructions du fabricant. ATTENTION: L&#39;alcool isopropylique est inflammable et très toxique. </li><li> Remettre en suspension le culot avec du milieu RPMI 1640 (4 ° C) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS) et 10% de sulfoxyde de diméthyle (DMSO). Ce est un milieu RPMI 1640 de congélation. Reprendre le culot avec une quantité de milieu de congélation qui se traduira par une suspension ayant environ 5 x 10 7 cellules / ml. Le nombre de cellules disponibles pour la congélation peut varier. </li><li> Distribuer des aliquotes de 1 ml de suspension de cellules dans des cryotubes de 2 ml et placer les cryotubes dans le récipient de congélation. Placer le récipient de congélation avec cryotubes dans un congélateur à -80 ° C pour stocker O / N puis retirez les cryotubes et transfert à stocker dans unCongélateur cryogénique entre -150 ° C à -190 ° C. </li><li> Retirer le cryotube de stockage cryogénique et décongeler rapidement sous agitation douce dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Transférer immédiatement les PBMC décongelées dans le cryotube dans un tube conique de 15 ml avec 10 ml du milieu RPMI 1640 complet (4 ° C) contenant 10% de FBS, 1% de Pen / Strep et 1% de L-glutamine. Le contenu du cryotube décongelés doivent être transférés dès que possible pour obtenir la viabilité cellulaire maximale 15. </li><li> Centrifuger les PBMC à 400 xg pendant 10 min. </li><li> Reprendre le culot avec 5 ml du milieu RPMI 1640 complet et compter les cellules. </li><li> Mesurer la viabilité des cellules par des méthodes établies, telles que la méthode d&#39;exclusion au bleu trypan. Généralement, la viabilité des cellules avec cette méthode est d&#39;environ 90 - 95%. Les PBMC sont maintenant prêts à utiliser dans des expériences. </li></ol> Mort cellulaire 4. Détermination NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette study. Les dilutions peuvent être modifiés en conséquence. <ol><li> Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits, comme indiqué ci-dessous. </li><li> Diluer WS-CM aux concentrations suivantes: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, et 5 pg / ml d&#39;unités d&#39;équi-nicotine (sur la base de la teneur en nicotine dans WS-CM) 12. </li><li> Diluer nicotine dans du milieu RPMI aux concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l&#39;environnement. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits. </li><li> Aux fins de cette étude, préparer deux jeux de plaques comme ci-dessus. Couvrir les plaques et incuber une plaque pendant 24 heures et une plaque pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Ajuster les points de temps que nécessaire. </li&gt; <li> Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 g pendant 3 min, l&#39;aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 95 ul de tampon suivie par 5 ul de 7-aminoactinomycine D (7AAD) à chaque puits pour un volume total de 100 ul / puits en cours d&#39;exécution. Incuber la plaque à l&#39;obscurité à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon pour courir tubes de munitions. Transférer tout le volume de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d&#39;acquérir les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules 7AAD positif en utilisant la cytométrie de flux logiciel d&#39;analyse. </li></ol> 5. CE 50 Détermination <ol><li> Les valeurs de CE 50 de WS-CM et la nicotine sont déterminées par 7AAD-coloration positive des PBMC. </li><li> La valeur EC 50 est définie comme la concntration à laquelle 50% des cellules ne était plus viable dans un dosage de 24 heures, et les valeurs sont exprimées en pg d&#39;équi-nicotine unités / ml. </li><li> Pour les fins de cette étude, les valeurs CE 50 ont été jugées 1,56 pg / ml et 1 650 pg / ml pour WS-CM et la nicotine, respectivement. </li></ol> 6. cytokines sécrétées NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence. <ol><li> Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d&#39;unités d&#39;équi-nicotine. </li><li> Diluer nicotine pour les concentrations suivantes: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, et 3000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l&#39;environnement. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à chaque puits à une concentration de 1 x 10 6 cellules / puits.Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules par centrifugation à la température ambiante à 300 x g pendant 3 min, aspiration du surnageant, le vortex inférieure de la plaque à plaque recouverte et finalement les cellules en suspension avec 200 ul de la glace froide courante tampon et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 200 ul de 10 ug / ml de LPS milieu à chaque puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 4 h, 24 h, 48 h, 72 h ou à 37 ° C et 5% de CO 2. Régler des temps d&#39;incubation nécessaire. </li><li> Centrifuger la plaque à 300 g pendant 3 min. </li><li> Prenez 175 pi de surnageant de chaque puits et de stocker dans un congélateur à -80 ° C pour effectuer les tests dans les étapes 7 et 8. </li></ol> 7. cytométrie Bead Assay tableau &lt;ol&gt; <li> Décongeler les surnageants cellulaires préparés à partir de l&#39;étape 6.10 et l&#39;utilisation dans le dosage de l&#39;ABC. Effectuez le test réseau de billes cytométrique (ABC) selon les instructions du fabricant. </li></ol> 8. ELISA IL-8 <ol><li> Décongeler les surnageants de cellules de l&#39;étape 6.10 et l&#39;utilisation dans l&#39;IL-8 ELISA. Effectuer le test ELISA selon les instructions du fabricant. </li></ol> 9. intracellulaire coloration et cytométrie de flux NOTE: Les dilutions énumérées ici sont pour le but de cette étude. Les dilutions peuvent être ajustés en conséquence. <ol><li> Diluer WS-CM dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits à la concentration de 0,3, 1,56, 3 et 5 ug / ml d&#39;unités d&#39;équi-nicotine. </li><li> De la même plaque, diluer la nicotine aux concentrations suivantes: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, et 4000 pg / ml. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et Hazar environnementdous. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules PBMC en suspension dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1 × 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules plus WS-CM ou de la nicotine sera 200 pl / puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules à la température ambiante par centrifugation à 300 x g pendant 3 min, l&#39;aspiration du surnageant, vortexer le fond de la plaque à plaque recouverte et finalement remise en suspension les cellules avec 200 ul de tampon de migration du froid de la glace, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter 200 pi de milieu RPMI complet à la plaque, et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Préparer les concentrations de travail de 2 ul / ml GolgiPlug et 10 ug / ml de LPS en utilisant un milieu RPMI complet et ajouter 200 ul dans chaque puits. </li><li> Incuber la plaque pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> A la fin de l&#39;étape 9.8, laver les cellules avec un tampon en cours d&#39;exécution (4 ° C) et tournant à 300g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de Cytofix à chaque puits et incuber pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois comme décrit dans l&#39;étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) à 300 g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 45 ul de 1 x Cytoperm à chaque puits suivi par 5 ul de chacun de l&#39;un des anticorps suivants dans chaque puits: TNF-α-Alexa Fluor 488, l&#39;IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incuber à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Laver les cellules deux fois comme décrit à l&#39;étape 9.9 avec 1x Permwash (4 ° C) et une fois avec du tampon (4 ° C) fonctionnant à 300 x g pendant 3 min à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 200 pi de paraformaldehyde à 2% (4 ° C). Transférer les cellules dans 12 × 75 mm tubes, et analyser les échantillons sur cytomètre de flux. ATTENTION: Paraformaldéhyde est corrosive, très toxique et dangereux pour la santé. </li></ol> 10. K562 Assay Tuer REMARQUE: les cellules K562 doivent être cultivéesen culture à 37 ° C et 5% de CO 2 avec un milieu RPMI complet jusqu&#39;à ce qu&#39;elles atteignent 80% de confluence avant l&#39;essai. <ol><li> Préparer une solution 5 mM carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) du stock en ajoutant 18 pi de DMSO dans le flacon. </li><li> Diluer WS-CM nicotine ou dans une plaque à 96 puits en utilisant un milieu RPMI complet à un volume total de 100 ul / puits pour atteindre les unités d&#39;équi-nicotine ou les concentrations souhaitées de nicotine pour chaque puits. ATTENTION: La nicotine est extrêmement toxique et dangereux pour l&#39;environnement. </li><li> Ajouter 100 ul de PBMC dans un milieu RPMI complet à une concentration de 1,5 x 10 6 cellules / puits. Le volume total des cellules avec ou WS-CM nicotine sera de 200 pl / puits. </li><li> Couvrir la plaque et incuber pendant 3 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules K562 en ajoutant 10 ml de DPBS et centrifuger à 400 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de DPBS et compter les cellules K562. </li><li> Préparer CFSE working solution en ajoutant 1 pl de CFSE solution stock à 1 ml DPBS. </li><li> Ajouter 1 ml de la solution de travail CFSE à 1 ml de la suspension de cellules K562 contenant 1 à 2 x 10 7 cellules. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante. </li><li> Immédiatement ajouter 200 pi de FBS. Vortexer et incuber pendant exactement 2 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu RPMI complet et centrifuger le tube à 400 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant RPMI et de briser le culot et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu RPMI complet et compter les cellules K562 CFSE-étiquetés. </li><li> Laver les PBMC par centrifugation de la plaque à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant par décantation le liquide. Replacer le couvercle et Vortex bas de la plaque. Ajouter 200 ul de milieu RPMI complet et répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Ajouter des cellules K562 marquées au CFSE dans un rapport de 1:15 (100,000 K562s: 1,5 x 10 6 CMSP) à chaque puits d&#39;échantillon de la plaque et en outre i PBMCncubate pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver le mélange de cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min à température ambiante. Aspirer le surnageant en éliminant le liquide. Placer le couvercle et vortexer le bas de la plaque. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon de migration et répéter l&#39;étape de lavage décrit dans l&#39;étape 10,14 une fois de plus. </li><li> Ajouter 95 ul de tampon de migration suivi par 5 ul de 7AAD à chaque puits pour un volume total de 100 pl / puits. Incuber la plaque à l&#39;obscurité à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon en cours d&#39;exécution à chaque puits et transférer la totalité du volume de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à tubes de munitions et d&#39;acquérir les échantillons sur cytomètre de flux. </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules positives et 7AAD CFSE-positifs en utilisant la cytométrie de flux logiciel d&#39;analyse. </li></ol>

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<li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells%3A+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li>
<li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Nous et d&#39;autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l&#39;expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l&#39;ouvrage précédent nécessitent des périodes d&#39;incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la recherche fondamenta...

Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l&#39;inflammation et l&#39;immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d&#39;infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont reconnus comme des outils importants pour guider la réglementation émergent de différents produits du tabac 10,11. Par exemple, nous avons démontré que les préparatifs combustibles de produits du tabac (PPT) comme milieu complet de fumée conditionné (WS-CM) et la matière particulaire totale (TPM) sont beaucoup plus cytotoxique et dommageable pourADN que PPT non combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l&#39;ouvrage publié, il a été récemment rapporté que PPT combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l&#39;ouvrage publié, nous avons récemment signalé que PPT combustibles causés immunosuppression marquée. Ceci a été démontré par la suppression de Toll Like Receptor (TLR) -ligands, stimulé la sécrétion de cytokines, et la cellule ciblée (K562) tuer par les PBMC dans un modèle ex vivo 14. Étant donné l&#39;importance de l&#39;inflammation dans les processus de la maladie induite fumée cigarettes, poursuite de l&#39;optimisation des conditions d&#39;essai pour évaluer les effets immunomodulateurs de la fumée de cigarette est présenté dans ce rapport. Les essais ex vivo typiquement mesurés et intracellulaire des cytokines ainsi que la fonction cytolytique de cellules NK et T cytotoxiques dans la cellule K562 tuant des dosages 14 sécrétées. Les dosages impliqués pré-incubation avec WS-CM et la nicotine et la stimulation ultérieure de PBMCs avec agonistes de TLR pendant une période de 3 jours; les lectures finales sont effectuées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et / ou la cytométrie de flux. Nous avons utilisé le lipopolysaccharide bactérien (LPS), qui se lie à des récepteurs TLR-4 stimule les PBMC et conduisant à la production de cytokines intracellulaires et la sécrétion de cytokines. En plus de l&#39;optimisation des différentes étapes essai pour l&#39;évaluation des effets immunomodulateurs de PPT, nous avons également présents procédés pour isoler les PBMC, des dosages de mort cellulaire et de l&#39;IL-8 quantification. Ces méthodes peuvent être appliquées pour aborder d&#39;autres questions de recherche et affinés pour évaluer les produits du tabac dans le contexte réglementaire. Tableau 1. Publié rapports de in vitro et ex vivo méthodes utilisées pour étudier les effets physiopathologiques Varilux de préparations de produits du tabac CS, le milieu de la fumée de cigarette. SCC, la fumée de cigarette condensat; CST, cigarette extrait de fumée; ELISA, enzyme dosage immunoenzymatique; GADPH, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; qPCR, réaction quantitative en chaîne par polymérase; RT en temps réel réaction en chaîne par polymérase quantitative; TS, la fumée de tabac. <table><tbody><tr><td> Auteur (Année de l&#39;étude) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell et al. (2008) </td></tr><tr><td> Les cellules utilisées </td><td> Cellules bronchiques humaines de l&#39;endothélium (BEAS-2B), les neutrophiles humains </td><td> Cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) </td><td> Les cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines (HASMC) </td><td> Cellules U937 prémonocytique humaines, des monocytes humains </td><td> Alvéolaires de type II cellules épithéliales (ATII) </td><td> Monocytaire humainelignée cellulaire (THP-1), les macrophages pulmonaires humaines </td></tr><tr><td> TPP utilisé </td><td> CST </td><td> SCC </td><td> CST </td><td> TS </td><td> CST </td><td> CS </td></tr><tr><td> Méthode utilisée </td><td> ELISA, qPCR, la migration, l&#39;électromobilité changement </td><td> Immuno-chimie, électrophorèse, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, PCR quantitative, l&#39;électrophorèse </td><td> Gel-décalage de mobilité </td><td> La microscopie optique, la microscopie électronique, l&#39;électrophorèse, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit E-TOXATE (Sigma), plaque de p65 dosage (TransAM), électrophorèse, diverses trousses d&#39;immunoessais </td></tr><tr><td> Mesure </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migration </td><td> histones acétyltransférases, les histones désacétylases, NF-kB, IL-8, pI-kB α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, l&#39;éotaxine </td><td> Heat Shock / protéines de stress (HSP / Hsp70), HF facteur de transcription NF-kB,TNF-α </td><td> Protéine tensioactif (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, le TNF-α, IL-1β, l&#39;IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, α-MIP1, GRO-α, MAPK / JNK / phosphorylation de ERK, cJun: liaison à l&#39;ADN, le glutathion, p65: liaison à l&#39;ADN </td></tr><tr><td> Résultat final </td><td> CST régule à la baisse la production de cytokines par la suppression de l&#39;AP-1 activation. </td><td> H 2 O 2 et SCC améliorer acétylation des histones, diminuer l&#39;activité histone déacétylase, différentielle régulent la libération de cytokines pro-inflammatoires. </td><td> La fumée de cigarette peut causer la libération d&#39;IL-8 de HASMC, renforcée par le TNF-α, 20% moins CST IL-8 libération, inhibition de l&#39;éotaxine et RANTES par la fumée de cigarette. </td><td> TS HF activés facteur de transcription qui a été associée à la surexpression de la Hsp70 et l&#39;inhibition de l&#39;activité NFkB et de TNF-α libération de liaison. </td><td> Réduction ATII niveaux de chimiokines dérivées de cellules compromis alveolar réparation, contribuant à la cigarette induit fumée lésions alvéolaires et l&#39;emphysème. </td><td> Données fournissent explication mécaniste pour les infections respiratoires pourquoi les fumeurs ont augmenté. Suppression de la réponse innée se accompagne d&#39;une augmentation de l&#39;IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 tubes de 75 mm</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>tubes coniques de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>Microtubes de 2 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F cigarettes de référence</td><td>Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>flacon</td> <td>de 500 mlCorning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat à 96 puits</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à fond rond à 96 puits</td><td>BD Falcon 353077</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte de culture cellulaire</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sondes moléculaires Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en grappe</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Nocif en cas d’ingestion, cancérigène</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>Inflammable</td></tr><tr><td>DMSO (diméthylsulfoxyde)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Le logiciel analyse les données CBA</td></tr><tr><td>Unité de filtrage</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 couleurs, à Ex 405 et Em 785.</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 couleurs à Ex 495 et Em 785.</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse par cytométrie en flux</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur de congélation</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Contient du DMSO, irritant</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Cancérogène, irritant, corrosif</td></tr><tr><td>H2SO<>4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> <td>de cytokines inflammatoires humainesBD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma ; V-500 Anticorps</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>Sensibilisant cutané</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R and D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’isolement</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Liquide inflammable, irritant</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&alpha ; PE Anticorps</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Toxicité aiguë, orale</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Toxicité aiguë, danger pour l’environnement</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>" M"</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Inflammable, irritation cutanée</td></tr><tr><td>Pen/streptocoque</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de</td><td>fonctionnement MACS Tampon de fonctionnement, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha ; Alexa Fluor 488 Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l&#39;immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Parmi les autres modifications physiopathologiques, l&#39;exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l&#39;incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d&#39;évaluer les effets probables à long terme de l&#39;exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l&#39;IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d&#39;autres produits d&#39;intérêt.

Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (quatre échantillons de donneurs). T-test de Student entre les échantillons de contrôle traités et non traités a été réalisée en utilisant le logiciel Excel ainsi que des comparaisons t-test pour tous les traitements avec leurs contrôles correspondants. La signification statistique est indiquée par: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Pour mesurer l&#39;effet de l&#39;exposition à WS-CM et la...

À l’aide d’essais ex vivo optimisés sur cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC), nous avons montré qu’une préparation de produit du tabac combustible supprime de manière marquée les cytokines sécrétées par voie intracellulaire médiées par les récepteurs et la capacité cytolytique des PBMC effecteurs. Ces tests rapides peuvent être utiles pour évaluer les produits et comprendre les effets potentiels à long terme de l’exposition au tabac.

Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l&#39;immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer les effets de la préparation de produits du tabac sur la sécrétion de cytokines et la destruction des cellules cibles par les PBMC. Ceci est réalisé en traitant d'abord des PBMC cultivés avec un milieu conditionné par la fumée totale, un milieu de culture ou de la nicotine, puis en effectuant une coloration intracellulaire des PBMC traitées afin de déterminer leur production de cytokines. Alternativement, des cellules K562 marquées au CFSE sont mises en co-culture avec des cellules effectrices PBMC traitées au milieu conditionné par la fumée totale, et la viabilité des cellules K562 est évaluée par coloration au 7-AAD.En fin de compte, les effets des préparations de produits du tabac combustibles sur les BMC-P provenant de l'un ou l'autre test sont mesurés par cytométrie en flux. Les principaux avantages de nos techniques par rapport aux méthodes existantes, telles que le test de libération de chrome ou le test ALI, sont qu'elles sont hautement performantes, non radioactives, et permettent de mesurer la fonctionnalité cellulaire. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les effets biologiques des préparations de produits du tabac.Il peut également être appliqué à l'évaluation d'autres composés qui influencent les fonctions médiées par les récepteurs de type Toll et les fonctions STIC des cellules effectrices des PBMC. Avant de commencer la procédure de marquage, diluez la condition de fumée entière, le milieu et la nicotine aux concentrations indiquées dans le milieu complet RPMI jusqu'à un volume total de 100 microlitres par puits dans une plaque de 96 puits.Ensuite, ajouter 100 microlitres de P BMCs, suspendus dans un milieu complet à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par puits, pour un volume total de 200 microlitres par puits. Puis, couvrir la plaque et l'incuber à 37 °C et 5 % CO₂. Après trois heures, laver les cellules et aspirer le surnageant.Ensuite, recouvrez &agrave; nouveau la plaque et faites-la vortexer pour dissocier les culots. Lavez les cellules deux fois suppl&eacute;mentaires, une fois dans du tampon de rin&ccedil;age glac&eacute;, puis une fois dans du milieu complet apr&egrave;s le deuxi&egrave;me lavage. Incubez-les avec 200 microlitres par puits de milieu complet suppl&eacute;ment&eacute; de Golgi plug et de LPS pendant six heures &agrave; 37 degr&eacute;s Celsius et 5 % CO2.Ensuite, lavez les cellules avec du tampon de lavage glacé en circulation et traitez-les avec 100 microlitres de cyto fix par puits à quatre degrés Celsius après 20 minutes, puis lavez les cellules trois fois avec du perm wash glacé. Ajoutez ensuite 45 microlitres de cyto perm dans chaque puits, suivis de cinq microlitres de chacun des anticorps listés. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules trois fois et fixez-les dans 200 microlitres de paraformaldéhyde à 2 %, glacé.Ensuite, transférez les cellules dans des tubes de 12 par 75 millimètres et analysez les échantillons sur un cytomètre en flux. Après avoir préparé une plaque de PBMC traités avec un produit du tabac comme vient de l'être démontré, lavez une culture de cellules K 5 62, récoltées à une confluence de 80 % dans 10 millilitres de DPBS. Resuspendez le culot dans cinq millilitres de DPBS et comptez les cellules.Ensuite, ajouter un millilitre de solution travail de CFSE fraîchement préparée à un à deux fois 10 à la puissance sept cellules K 5 62 dans un millilitre de milieu complet et disperser la coloration cellulaire par vortex. Incuber les cellules à température ambiante ; après exactement deux minutes, ajouter 200 microlitres de SFB et faire un nouveau vortex, puis poursuivre l'incubation pendant deux minutes supplémentaires. Après la seconde incubation, laver les cellules dans 10 millilitres de milieu complet, puis resuspendre le culot dans 10 millilitres supplémentaires de milieu complet et dénombrer les cellules.Centrifugez maintenant les pBMC traitées avec du tabac et décantez le surnageant. Remettez ensuite le couvercle, resuspendez les cellules par vortexage et lavez-les avec 200 microlitres de milieu complet par puits. Pour initier le test de lyse, ajoutez les cellules K562 marquées au CFSE aux PBMC selon un rapport de un à quinze, puis incubez la co-culture à 37 degrés Celsius et 5 % CO2.Après cinq heures, centrifuger les cellules et éliminer le surnageant. Suspendre les culots par vortexage, puis laver les cellules avec 200 microlitres de tampon de migration par puits, puis ajouter 95 microlitres de tampon de migration, suivis de cinq microlitres de sept A a d, pour un volume total de 100 microlitres par puits. Incuber finalement les cellules à l’abri de la lumière, à température ambiante, pendant 15 minutes.Ensuite, ajouter 100 microlitres de tampon de migration dans chaque puits et transférer le volume total vers les tubes fax correspondants appropriés afin de déterminer le pourcentage de cellules positives pour sept a a D et CFSE. Par analyse en cytométrie en flux, une augmentation dépendante de la dose de la mort cellulaire est observée avec le milieu conditionné par la fumée totale après 24 heures, environ 80 % des cellules étant mortes à quatre microgrammes par millilitre d'unités d'équivalent de nicotine. Toutefois, le traitement des p BMCs pendant seulement trois heures ne provoque aucune toxicité significative, même à cinq microgrammes par millilitre d'unités d'équivalent de nicotine de milieu conditionné par la fumée totale après 24 heures.Un degré comparable de mort cellulaire n'est pas observé avant le traitement avec 3000 microgrammes par millilitre de nicotine après trois heures ; le traitement à la nicotine ne provoque aucune mort cellulaire mesurable avant la concentration de 2000 microgrammes par millilitre dans les conditions de milieu avec fumée totale, milieu et nicotine. Par la suite, la stimulation du récepteur TLR4 par le LPS entraîne une diminution dépendante de la dose des cytokines sécrétées. Bien que le degré de suppression varie selon les cytokines individuelles. En outre, lorsque les cellules sont traitées simultanément avec le LPS et le bloc de Golgi pendant seulement six heures, une diminution du nombre de cellules positives pour les cytokines intracellulaires est observée après exposition au milieu en condition de fumée totale, même à des concentrations équivalentes plus faibles en unités de nicotine par rapport à l'exposition à la nicotine.En effet, les résultats de ce test de cytotoxicité montrent que l'exposition à un milieu conditionné par la fumée entière à une concentration de 1,56 microgramme par millilitre réduit significativement la capacité de destruction de la population de PBMC effecteurs par rapport au témoin et aux concentrations plus faibles. En revanche, le traitement à la nicotine, quelle que soit la concentration (élevée ou faible), n'interfère pas avec la capacité de destruction de la population de PBMC effecteurs. Il est important d'être précis lors du marquage au CFSE, ainsi que pour les dilutions des anticorps, la durée d'étiquetage et les températures d'incubation.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser les techniques de marquage par anticorps en cytométrie en flux pour déterminer les effets de préparations de produits du tabac ou d'autres traitements sur les cellules mononucléées du sang périphérique.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide comme un modèle de l'épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour l'isolement, la culture et d'exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante, afin d'étudier les réponses moléculaires à cette toxine de l'environnement.

L&#39;isolement de la souris les cellules épithéliales respiratoires et l&#39;exposition à la fumée de cigarette expérimentale chez Air interface liquide

Cette vidéo démontre l’effet des préparations de produits du tabac, les TPP, sur la production de cytokines à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’aide de la cytométrie en flux. Le traitement des cellules avec le TPP régule à la baisse la production de cytokines pro-inflammatoires, qui est estimée après stimulation par lipopolysaccharides, suivie d’une immunocoloration et d’une analyse par cytométrie en flux.

Analyse de l’effet des préparations de produits du tabac sur la production de cytokines par coloration intracellulaire et cytométrie en flux

Dans cette vidéo, nous étudions l’effet d’un milieu entier conditionné par la fumée, une préparation de produit du tabac combustible, sur la destruction des cellules K562 par les cellules mononucléées du sang périphérique effecteur.

Destruction des cellules K562 par les cellules mononucléées du sang périphérique exposées à des préparations de produits du tabac

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Un test pour mesurer la cytotoxicité induite chimiquement dans des tranches de poumon humain coupées avec précision

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Évaluation de l&#39;impact de l&#39;exposition répétée de organotypiques 3D bronchiques et nasales Tissue Culture modèles Whole fumée de cigarette

L’objectif de l’étude était d’évaluer l’impact biologique de 15 constituants de la fumée de cigarette en utilisant une combinaison d’un analyseur de cellules en temps réel basé sur l’impédance et d’une plateforme basée sur le criblage à haut contenu (HCS) pour l’évaluation toxicologique in vitro. Cette étude fournit des informations sur les doses efficaces, la toxicité et les modes d’action des composés testés.

Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC)

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Comparer les effets de la vapeur de cigarette électronique et de la fumée de cigarette dans un roman<em&gt; In vivo</em&gt; Système d&#39;exposition

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Compte tenu du principe des 3 r, modèles respiratoires comme des alternatives aux études sur les animaux évoluent. Surtout pour l’évaluation des risques des substances respiratoires, il y a un manque d’essais appropriés. Nous décrivons ici l’utilisation de tranches de poumon humain de coupe de précision pour l’évaluation des substances véhiculées.

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Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

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