Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer les effets de la préparation de produits du tabac sur la sécrétion de cytokines et la destruction des cellules cibles par les BMC P. Ceci est accompli en traitant d’abord les BMC P cultivés avec de la fumée entière, du milieu ou de la nicotine, puis une coloration intracellulaire des BMC p traités est effectuée pour déterminer leur production de cytokines. Alternativement, les cellules K 5 62 marquées CFSE sont co-cultivées avec des cellules effectrices PBMC entières conditionnées à la fumée et traitées en milieu et la viabilité des cellules K 5 62 est qualifiée par sept colorations A a d.

En fin de compte, les effets des préparations de produits du tabac combustibles sur les BMC P de l’un ou l’autre test sont mesurés par cytométrie en flux. Les principaux avantages de nos techniques ou des méthodes existantes, telles que le dosage de libération de chrome ou l’ALI spot, sont que nos méthodes sont à haut débit, non radioactives et que nous pouvons mesurer la fonctionnalité des cellules. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des effets biologiques des préparations de produits du tabac.

Il peut également être appliqué à l’évaluation d’autres composés qui ont un impact sur les fonctions médiées par le récepteur tolike et les fonctions STIC des cellules effectrices PBMC avant de commencer la procédure de coloration. Diluer la fumée entière, le milieu et la nicotine aux concentrations indiquées. Dans le RPMI, il suffit d’un volume total de 100 microlitres par puits dans une plaque de 96 puits.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de BMC P, en suspension dans un milieu complet à une concentration de un fois 10 dans les six cellules par puits pour un volume total de 200 microlitres par puits. Ensuite, couvrez l’assiette et incubez-la à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Après trois heures, lavez les cellules et aspirez le surnageant.

Puis couvrez à nouveau la plaque et tourbillonnez-la pour dissocier les granulés. Lavez les cellules deux fois de plus, une fois dans un tampon de coulée glacé et une fois dans un milieu complet après le deuxième lavage. Traitez-les avec 200 microlitres par puits de milieu complet complété par un bouchon Golgi et un LPS pendant six heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Ensuite, lavez les cellules avec un tampon de coulée glacial et traitez-les avec 100 microlitres de cyto fix par puits à quatre degrés Celsius après 20 minutes, lavez les cellules trois fois avec un lavage permanent glacé. Ajoutez ensuite 45 microlitres de cyto perm dans chaque puits, suivis de cinq microlitres de chacun des anticorps répertoriés. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules trois fois et fixez-les dans 200 microlitres de glace froide, 2 % de para formaldéhyde.

Transférez ensuite les cellules dans des tubes de 12 x 75 millimètres et analysez les échantillons sur un cytomètre en flux. Après avoir préparé une plaque de produit du tabac traité pbmc comme nous venons de le démontrer, laver une culture de cellules K 5 62, récoltée à une fluidité de 80 % dans 10 millilitres de DPBS. Resus. Mettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de DPBS et comptez les cellules.

Ajoutez ensuite un millilitre de solution de travail CFSE fraîchement préparée à une à deux fois 10 à la septième K 5 62 cellules dans un millilitre de milieu complet et dispersez la coloration cellulaire par vortex. Incuber les cellules à température ambiante après exactement deux minutes, ajoutez 200 microlitres de FBS et vortex à nouveau les cellules, en les incubant pendant deux minutes supplémentaires. Après la deuxième incubation, lavez les cellules dans 10 millilitres de milieu complet, puis remettez la pastille en suspension dans 10 autres millilitres de milieu complet et comptez les cellules.

Maintenant, centrifugez le tabac traité p BMCs et décantez le surnageant. Replacez ensuite le couvercle, remettez les cellules en suspension par vortex et lavez-les dans 200 microlitres de milieu complet par puits. Pour amorcer l’essai de destruction, ajoutez les cellules K 5 62 marquées CFSE au pbmc dans un rapport de un à 15 et incubez la co-culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Après cinq heures, faites tourner les cellules et jetez le surnageant. Suspendez les pastilles par vortexing puis lavez les cellules avec 200 microlitres de tampon de coulée par puits, puis ajoutez 95 microlitres de tampon de coulée, suivis de cinq microlitres de sept A a d pour un volume total de 100 microlitres par puits. Enfin, incubez les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon de fonctionnement dans chaque puits et transférez tout le volume dans les tubes de fax correspondants appropriés pour déterminer le pourcentage de sept cellules positives a, a, D et CFSE. Par analyse cytométrique en flux, une augmentation dose-dépendante de la mort cellulaire est observée avec un milieu entier conditionné à la fumée à 24 heures avec près de 80 % des cellules mortes à quatre microgrammes par millilitre d’unités de nicotine equin. Cependant, le traitement des BMC p pendant seulement trois heures n’entraîne pas de toxicité significative, même à cinq microgrammes par millilitre d’unités de nicotine equin de milieu entier conditionné à la fumée à 24 heures.

Un degré comparable de mort cellulaire n’est pas noté avant le traitement avec 3000 microgrammes par millilitre de nicotine après trois heures, le traitement à la nicotine ne provoque pas de mort cellulaire mesurable avant le traitement à une concentration de 2000 microgrammes par millilitre avec une fumée entière, un milieu et de la nicotine, suivi d’une stimulation du récepteur TLR quatre par le LPS entraîne une diminution dose-dépendante des cytokines sécrétées. Bien que le degré de suppression varie selon les cytokines individuelles. De plus, lorsque les cellules sont traitées avec du LPS et un golgi plug pendant seulement six heures, une diminution du nombre de cellules cytokines intracellulaires positives est observée après l’exposition à l’ensemble du milieu de fumée, même aux concentrations unitaires de nicotine equin inférieures à celles de l’exposition à la nicotine.

En effet, les résultats de ce test de destruction montrent que l’exposition à 1,56 microgramme par millilitre de milieu de fumée entière réduit considérablement la capacité de destruction de la population de PBMC effecteurs par rapport au témoin et aux concentrations de dose plus faibles. Alors que le traitement à la nicotine à des concentrations élevées ou faibles n’interfère pas avec la capacité de destruction de la population PBMC effectrice lors de la tentative de ces procédures. Il est important d’être précis avec le marquage CFSE, ainsi qu’avec les dilutions d’anticorps, le temps de marquage et les températures d’incubation.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les techniques de marquage des anticorps en cytométrie en flux pour déterminer les effets des préparations de produits du tabac ou d’autres traitements sur les cellules mononucléées du sang périphérique.