Name: Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Apprenez à caractériser les connexions synaptiques entre neurones identifiés morphologiquement par électrophysiologie et analyse structurale dans des tranches aiguës de cerveau.

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Nous tenons à remercier tous les membres du groupe 'Fonction des microcircuits neuronaux' de l’Institut des neurosciences et de la médecine, INM-2, Centre de recherche de Jülich et du groupe 'Fonction des microcircuits corticaux' du Département de psychiatrie, de psychothérapie et de psychosomatique de la faculté de médecine de JARA, de l’Université RWTH d’Aix-la-Chapelle pour leurs discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par le groupe de recherche DFG sur la fonction du cortex en baril (BaCoFun).

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Enregistrements appariés de excitateur synaptiquement couplé et / ou neurones inhibiteurs sont une approche très polyvalent pour l&#39;étude de microcircuits neuronaux. Non seulement cette approche permet d&#39;estimer la connectivité synaptique entre les types de neurones, mais permet également de déterminer les caractéristiques fonctionnelles de la connexion et de la morphologie des neurones pré- et post-synaptiques. En outre, un agoniste et / ou antagoniste peuvent être facilement appliqués à des neurones dans des pr...

Microcircuits neuronaux entre deux neurones synaptiquement couplés sont les blocs de construction de réseaux à grande échelle dans le cerveau et sont les unités fondamentales de synaptique traitement de l&#39;information. Une condition préalable pour la caractérisation de ces microcircuits neuronaux est de connaître la morphologie et les propriétés fonctionnelles des deux partenaires neurones pré- et post-synaptiques, le type de la connexion synaptique (s) et sa structure et son mécanisme fonctionnel. Cependant, dans de nombreuses études de connexions synaptiques au moins l&#39;un des neurones dans un microcircuit ne est pas bien caractérisé. Il en résulte des protocoles de stimulation relativement non spécifiques souvent utilisées dans les études de la connectivité synaptique. Par conséquent, les propriétés structurelles et fonctionnelles du neurone présynaptique sont identifiées soit pas du tout ou seulement dans une mesure relativement faible (par exemple, l&#39;expression des protéines marqueurs, etc.). Enregistrements appariés en combinaison avec coloration intracellulaire de marqueurs sUCH que biocytine, neurobiotin ou colorants fluorescents sont mieux adaptés pour l&#39;étude de petites microcircuits neuronaux. Cette technique permet d&#39;enquêter sur de nombreux paramètres structurels et fonctionnels d&#39;une connexion synaptique identifiée morphologiquement en même temps. Les soi-disant connexions monosynaptiques «unitaire» entre deux neurones ont été étudiés dans les deux régions corticales et sous-corticales du cerveau 1-10 utilisant des préparations de tranche aigus. Initialement, microélectrodes tranchants ont été utilisés dans ces expériences; plus tard, l&#39;enregistrement patch clamp a été utilisée pour obtenir des enregistrements de signaux synaptiques avec un niveau de bruit inférieur et une résolution temporelle améliorée. Un progrès technique important est l&#39;utilisation de contraste d&#39;interférence différentiel à infrarouges (IR-DIC) 14.11 optique, une technique microscopique qui améliore considérablement la visibilité et l&#39;identification des neurones dans la tranche de cerveau de sorte qu&#39;il devient possible to obtenir des enregistrements de connexions synaptiques identifiés visuellement 15-17. En général, les enregistrements appariés sont effectuées dans des préparations de tranche aigus; que très peu de publications sont disponibles enregistrements de rapports de neurones reliés par des synapses in vivo 18-20. L&#39;avantage le plus important d&#39;enregistrements appariés est le fait qu&#39;une caractérisation fonctionnelle peut être combiné avec une analyse morphologique à la fois la lumière et de l&#39;électron niveau microscopique (voir, par exemple., 7,16,21). Après le traitement histochimique, la morphologie dendritique et axonale de la paire de neurones reliés par des synapses est tracée. Par la suite, il est possible de quantifier les caractéristiques morphologiques telles que la longueur, la densité spatiale, l&#39;orientation, patron de ramification, etc. Ces paramètres peuvent alors fournir une base pour une classification objective d&#39;une connexion synaptique spécifique. En outre, contrairement à la plupart des autres techniques utilisées pour l&#39;étude de rappro neuronalestivité, jumelé enregistrements permettent également l&#39;identification des contacts synaptiques pour les connexions synaptiques unitaires. Cela peut être fait directement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de microscopie optique et électronique 16,21-27 ou en utilisant l&#39;imagerie calcique 28,29 des épines dendritiques. Toutefois, cette dernière approche ne excitateur mais pas des connexions inhibitrices peuvent être étudiés car elle nécessite l&#39;influx de calcium par les canaux des récepteurs post-synaptiques. En plus d&#39;une analyse détaillée de la transmission synaptique chez un microcircuit couplé enregistrements neuronaux définies permettent également l&#39;étude des règles de plasticité synaptique 30,31 ou - en combinaison avec une application agoniste / antagoniste - la modulation de la transmission synaptique par les neurotransmetteurs tels que l&#39;acétylcholine et de l&#39;adénosine 32 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificateur</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>avec 2 - 3 préamplificateurs</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>avec 2 ports de caméra, un objectif 4X et un objectif à immersion dans l’eau 40X</td></tr><tr><td>Caméra</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>Caméra CCD infrarouge</td></tr><tr><td>Workstation</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>avec une platine x-y motorisée et un axe de mise au point motorisé pour le microscope</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Luigs & Manipulateurs Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z pour 2 - 3 préamplificateurs</td></tr><tr><td>cage de Faraday</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibration</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Système Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>avec les logiciels Neurolucida et Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

Électrophysiologiques et caractérisation morphologique des neurones les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

La combinaison d&#39;enregistrements patch clamp de deux (ou plus) des synapses des neurones couplés (enregistrements appariés) dans aiguës préparations de tranches de cerveau avec remplissage simultané de la biocytine intracellulaire permet une analyse corrélée de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Avec cette méthode, il est possible d&#39;identifier et de caractériser les neurones pré- et post-synaptiques par leur morphologie et leur profil de réponse électrophysiologique. Enregistrements appariés permettent l&#39;étude des modes de connectivité entre ces neurones ainsi que les propriétés à la fois la transmission synaptique chimique et électrique. Ici, nous donnons une description étape par étape des procédures requises pour obtenir des enregistrements appariés fiables avec une récupération optimale de la morphologie des neurones. Nous allons décrire comment paires de neurones connectés via les synapses chimiques ou de jonctions lacunaires sont identifiés dans les préparations de tranches de cerveau. Nous allons exposer comment les neurones sont reconstruits pour obtenir leur morphologie 3D de la Dendritic et le domaine axonale et comment contacts synaptique sont identifiés et localisés. Nous discuterons également les mises en garde et les limites de la technique d&#39;enregistrement couplé, en particulier ceux associés à troncatures dendritiques et axonales lors de la préparation des tranches de cerveau parce que ces affectent fortement les estimations de connectivité. Toutefois, en raison de la polyvalence de l&#39;approche d&#39;enregistrement jumelé il restera un outil précieux pour caractériser les différents aspects de la transmission synaptique au microcircuits neuronaux identifiés dans le cerveau.

Enregistrements liés sont la méthode de choix pour une caractérisation approfondie des connexions synaptiques uni ou bidirectionnels morphologiquement identifiées ainsi que jonctions lacunaires connexions (électriques) (Figure 1). Un exemple d&#39;un enregistrement couplé à la couche 4 du cortex somato-sensoriel du canon est représentée sur la Figure 1A. Les deux excitateurs unidirectionnel et connexions synaptiques inhibiteurs peuvent être caractérisées (figure 1B, C)....

Les enregistrements patch-clamp et le remplissage simultané de neurones couplés synaptiquement dans des tranches cérébrales aiguës permettent une analyse corrélée de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles. L’objectif de ce protocole est de décrire les étapes techniques essentielles de l’enregistrement électrophysiologique des microcircuits neuronaux et de leur analyse morphologique ultérieure.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer comment les connexions synaptiques entre des neurones morphologiquement identifiés sont caractérisées à la fois fonctionnellement et structurellement. Ceci est réalisé en obtenant des coupes cérébrales aiguës, qui sont optimisées pour l’étude d’une connexion synaptique particulière. Le clampage par patch est ensuite utilisé pour tester les neurones couplés synaptiquement.Pour cela, un neurone post-synaptique prospectif individuel est patché, et une deuxième pipette est ensuite utilisée pour stimuler les neurones environnants afin d’établir l’existence d’une connexion synaptique. Si aucune réponse n’est observée, l’électrode de stimulation est déplacée. Une fois qu’une connexion est trouvée, le neurone présynaptique est réapparié en mode gros.À la suite d’enregistrements électrophysiologiques de ces neurones et de remplissages simultanés de biotine, la tranche est fixée, traitée pour la biotine et des reconstructions 3D assistées par ordinateur des neurones sont effectuées. In fine, notre méthode vise une analyse quantitative structurale et fonctionnelle corrélée des microcircuits neuronaux. Le principal avantage des enreg

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Enquêtes sur les altérations de la fonction hippocampique Circuit suite de traumatisme craniocérébral léger

La préparation de coupes de cerveau de courte durée isolé hippocampes, ainsi que les enregistrements électrophysiologiques simultanées d'astrocytes et les neurones...

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Cette vidéo montre la procédure de cartographie des connexions synaptiques en sécurisant une tranche de cerveau, en positionnant des pipettes pour obtenir des configurations de cellules entières et en stimulant les neurones présynaptiques pour enregistrer les réponses postsynaptiques, élucidant ainsi la connectivité neuronale.

Enregistrement par patch clamp apparié des connexions neuronales dans des coupes cérébrales aiguës

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

Les protocoles en boucle fermée sont de plus en plus répandus dans l’électrophysiologie moderne. Nous présentons une manière simple, polyvalente et peu coûteuse d’effectuer des protocoles électrophysiologiques complexes dans les neurones pyramidaux corticaux in vitro, à l’aide d’un ordinateur de bureau et d’une carte d’acquisition numérique.

Électrophysiologie en temps réel: en utilisant des protocoles en boucle fermée à la sonde neuronaux Dynamics et au-delà

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Préparation de tranches de cerveau aiguë en utilisant un optimisé N-méthyl-D-glucamine méthode de recouvrement protecteur

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Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

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Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l&#39;étude des neurones dans les tranches de cerveau

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Apprenez à caractériser les connexions synaptiques entre neurones identifiés morphologiquement par électrophysiologie et analyse structurale dans des tranches aiguës de cerveau.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements (Vidéo) | JoVE Journal

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

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