Name: Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Apprenez à caractériser les connexions synaptiques entre neurones identifiés morphologiquement par électrophysiologie et analyse structurale dans des tranches aiguës de cerveau.

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Nous tenons à remercier tous les membres du groupe 'Fonction des microcircuits neuronaux' de l’Institut des neurosciences et de la médecine, INM-2, Centre de recherche de Jülich et du groupe 'Fonction des microcircuits corticaux' du Département de psychiatrie, de psychothérapie et de psychosomatique de la faculté de médecine de JARA, de l’Université RWTH d’Aix-la-Chapelle pour leurs discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par le groupe de recherche DFG sur la fonction du cortex en baril (BaCoFun).

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Enregistrements appariés de excitateur synaptiquement couplé et / ou neurones inhibiteurs sont une approche très polyvalent pour l&#39;étude de microcircuits neuronaux. Non seulement cette approche permet d&#39;estimer la connectivité synaptique entre les types de neurones, mais permet également de déterminer les caractéristiques fonctionnelles de la connexion et de la morphologie des neurones pré- et post-synaptiques. En outre, un agoniste et / ou antagoniste peuvent être facilement appliqués à des neurones dans des pr...

Microcircuits neuronaux entre deux neurones synaptiquement couplés sont les blocs de construction de réseaux à grande échelle dans le cerveau et sont les unités fondamentales de synaptique traitement de l&#39;information. Une condition préalable pour la caractérisation de ces microcircuits neuronaux est de connaître la morphologie et les propriétés fonctionnelles des deux partenaires neurones pré- et post-synaptiques, le type de la connexion synaptique (s) et sa structure et son mécanisme fonctionnel. Cependant, dans de nombreuses études de connexions synaptiques au moins l&#39;un des neurones dans un microcircuit ne est pas bien caractérisé. Il en résulte des protocoles de stimulation relativement non spécifiques souvent utilisées dans les études de la connectivité synaptique. Par conséquent, les propriétés structurelles et fonctionnelles du neurone présynaptique sont identifiées soit pas du tout ou seulement dans une mesure relativement faible (par exemple, l&#39;expression des protéines marqueurs, etc.). Enregistrements appariés en combinaison avec coloration intracellulaire de marqueurs sUCH que biocytine, neurobiotin ou colorants fluorescents sont mieux adaptés pour l&#39;étude de petites microcircuits neuronaux. Cette technique permet d&#39;enquêter sur de nombreux paramètres structurels et fonctionnels d&#39;une connexion synaptique identifiée morphologiquement en même temps. Les soi-disant connexions monosynaptiques «unitaire» entre deux neurones ont été étudiés dans les deux régions corticales et sous-corticales du cerveau 1-10 utilisant des préparations de tranche aigus. Initialement, microélectrodes tranchants ont été utilisés dans ces expériences; plus tard, l&#39;enregistrement patch clamp a été utilisée pour obtenir des enregistrements de signaux synaptiques avec un niveau de bruit inférieur et une résolution temporelle améliorée. Un progrès technique important est l&#39;utilisation de contraste d&#39;interférence différentiel à infrarouges (IR-DIC) 14.11 optique, une technique microscopique qui améliore considérablement la visibilité et l&#39;identification des neurones dans la tranche de cerveau de sorte qu&#39;il devient possible to obtenir des enregistrements de connexions synaptiques identifiés visuellement 15-17. En général, les enregistrements appariés sont effectuées dans des préparations de tranche aigus; que très peu de publications sont disponibles enregistrements de rapports de neurones reliés par des synapses in vivo 18-20. L&#39;avantage le plus important d&#39;enregistrements appariés est le fait qu&#39;une caractérisation fonctionnelle peut être combiné avec une analyse morphologique à la fois la lumière et de l&#39;électron niveau microscopique (voir, par exemple., 7,16,21). Après le traitement histochimique, la morphologie dendritique et axonale de la paire de neurones reliés par des synapses est tracée. Par la suite, il est possible de quantifier les caractéristiques morphologiques telles que la longueur, la densité spatiale, l&#39;orientation, patron de ramification, etc. Ces paramètres peuvent alors fournir une base pour une classification objective d&#39;une connexion synaptique spécifique. En outre, contrairement à la plupart des autres techniques utilisées pour l&#39;étude de rappro neuronalestivité, jumelé enregistrements permettent également l&#39;identification des contacts synaptiques pour les connexions synaptiques unitaires. Cela peut être fait directement à l&#39;aide d&#39;une combinaison de microscopie optique et électronique 16,21-27 ou en utilisant l&#39;imagerie calcique 28,29 des épines dendritiques. Toutefois, cette dernière approche ne excitateur mais pas des connexions inhibitrices peuvent être étudiés car elle nécessite l&#39;influx de calcium par les canaux des récepteurs post-synaptiques. En plus d&#39;une analyse détaillée de la transmission synaptique chez un microcircuit couplé enregistrements neuronaux définies permettent également l&#39;étude des règles de plasticité synaptique 30,31 ou - en combinaison avec une application agoniste / antagoniste - la modulation de la transmission synaptique par les neurotransmetteurs tels que l&#39;acétylcholine et de l&#39;adénosine 32 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificateur</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>avec 2 - 3 préamplificateurs</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>avec 2 ports de caméra, un objectif 4X et un objectif à immersion dans l’eau 40X</td></tr><tr><td>Caméra</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>Caméra CCD infrarouge</td></tr><tr><td>Workstation</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>avec une platine x-y motorisée et un axe de mise au point motorisé pour le microscope</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Luigs & Manipulateurs Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z pour 2 - 3 préamplificateurs</td></tr><tr><td>cage de Faraday</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibration</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Système Neurolucida</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>avec les logiciels Neurolucida et Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

Électrophysiologiques et caractérisation morphologique des neurones les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

La combinaison d&#39;enregistrements patch clamp de deux (ou plus) des synapses des neurones couplés (enregistrements appariés) dans aiguës préparations de tranches de cerveau avec remplissage simultané de la biocytine intracellulaire permet une analyse corrélée de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. Avec cette méthode, il est possible d&#39;identifier et de caractériser les neurones pré- et post-synaptiques par leur morphologie et leur profil de réponse électrophysiologique. Enregistrements appariés permettent l&#39;étude des modes de connectivité entre ces neurones ainsi que les propriétés à la fois la transmission synaptique chimique et électrique. Ici, nous donnons une description étape par étape des procédures requises pour obtenir des enregistrements appariés fiables avec une récupération optimale de la morphologie des neurones. Nous allons décrire comment paires de neurones connectés via les synapses chimiques ou de jonctions lacunaires sont identifiés dans les préparations de tranches de cerveau. Nous allons exposer comment les neurones sont reconstruits pour obtenir leur morphologie 3D de la Dendritic et le domaine axonale et comment contacts synaptique sont identifiés et localisés. Nous discuterons également les mises en garde et les limites de la technique d&#39;enregistrement couplé, en particulier ceux associés à troncatures dendritiques et axonales lors de la préparation des tranches de cerveau parce que ces affectent fortement les estimations de connectivité. Toutefois, en raison de la polyvalence de l&#39;approche d&#39;enregistrement jumelé il restera un outil précieux pour caractériser les différents aspects de la transmission synaptique au microcircuits neuronaux identifiés dans le cerveau.

Enregistrements liés sont la méthode de choix pour une caractérisation approfondie des connexions synaptiques uni ou bidirectionnels morphologiquement identifiées ainsi que jonctions lacunaires connexions (électriques) (Figure 1). Un exemple d&#39;un enregistrement couplé à la couche 4 du cortex somato-sensoriel du canon est représentée sur la Figure 1A. Les deux excitateurs unidirectionnel et connexions synaptiques inhibiteurs peuvent être caractérisées (figure 1B, C)....

Les enregistrements patch-clamp et le remplissage simultané de neurones couplés synaptiquement dans des tranches cérébrales aiguës permettent une analyse corrélée de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles. L’objectif de ce protocole est de décrire les étapes techniques essentielles de l’enregistrement électrophysiologique des microcircuits neuronaux et de leur analyse morphologique ultérieure.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer comment les connexions synaptiques entre des neurones morphologiquement identifiés sont caractérisées à la fois fonctionnellement et structurellement. Ceci est réalisé en obtenant des coupes cérébrales aiguës, qui sont optimisées pour l’étude d’une connexion synaptique particulière. Le clampage par patch est ensuite utilisé pour tester les neurones couplés synaptiquement.Pour cela, un neurone post-synaptique prospectif individuel est patché, et une deuxième pipette est ensuite utilisée pour stimuler les neurones environnants afin d’établir l’existence d’une connexion synaptique. Si aucune réponse n’est observée, l’électrode de stimulation est déplacée. Une fois qu’une connexion est trouvée, le neurone présynaptique est réapparié en mode gros.À la suite d’enregistrements électrophysiologiques de ces neurones et de remplissages simultanés de biotine, la tranche est fixée, traitée pour la biotine et des reconstructions 3D assistées par ordinateur des neurones sont effectuées. In fine, notre méthode vise une analyse quantitative structurale et fonctionnelle corrélée des microcircuits neuronaux. Le principal avantage des enregistrements appariés à partir de neurones couplés synaptiquement est que nous pouvons effectuer une analyse structurelle et fonctionnelle corrélée des neurones pré et postsynaptiques dans les microcircuits neuronaux.Plus récemment encore, les techniques introduites telles que la stimulation optique des neurones ne sont pas en mesure d’y parvenir avec autant de détails. Cette méthode permet d’étudier les interactions d’excitation et d’inhibition de types de neurones morphologiquement identifiés et comment l’activité est modulée. Guan démontrera les procédures d’enregistrement des animaux de compagnie.Lui qui est postdoc dans mon laboratoire. Après avoir préparé des tranches de la région cible, laissez-les incuber pendant ce temps, tirez sur les pipettes du patch, qui doivent avoir une tige longue et mince. Après avoir fixé une tranche de cerveau avec une harpe en platine dans une chambre expérimentale, remplissez une pipette d’enregistrement avec une solution interne.Placez la pipette dans le préamplificateur et patchez un neurone post-synaptique putatif en mode cellule entière à l’aide d’une pipette patch de recherche de résistance de huit à 10 méga ohms remplie d’une solution interne dans laquelle les sels de potassium sont remplacés par des sels de sodium. Appliquez une légère aspiration à la pipette de recherche pour patcher un neurone présynaptique potentiel dans une cellule lâche. Configuration ci-jointe.Maintenez le potentiel de membrane sous le joint lâche entre moins 30 et moins 60 millivolts en mode pince de courant. Ensuite, appliquez de grandes impulsions de courant de 0,2 à deux nanoampères pour susciter un potentiel d’action dans la cellule présynaptique potentielle. Observez ce potentiel d’action comme un petit épilet sur la réponse en tension.Réglez la fréquence de stimulation à 0,1 hertz pour éviter l’épuisement de la réponse postsynaptique. Si le neurone postsynaptique ne répond pas à la stimulation du patch de neurones potentiellement présynaptiques testé, un nouveau neurone présynaptique potentiel en mode de sceau lâche. Testez ainsi jusqu’à 30 neurones potentiellement présynaptiques.Continuer à utiliser la même électrode patch de recherche tant qu’un joint avec une résistance supérieure à 30 mégaohms peut être établi. Si la stimulation en mode d’étanchéité lâche entraîne un EPSP ou un IPSP avec une latence inférieure à cinq millisecondes dans le neurone postsynaptique, retirez la pipette de recherche du neurone présynaptique à l’aide d’une électrode d’enregistrement remplie de biotine contenant une solution interne régulière avec une résistance de quatre à huit méga ohms. Patchez le neurone présynaptique et enregistrez en mode de pince de courant de cellule entière.Susciter des potentiels d’action par injection de courant dans les neurones présynaptiques et enregistrer la réponse postsynaptique. Stockez les données sur un ordinateur pour une analyse ultérieure hors ligne. Tout au long de l’enregistrement, la biotine se diffuse dans le neurone pour obtenir une coloration adéquate.Laissez la biotine se diffuser pendant au moins 15 à 30 minutes selon la taille du neurone. Pour les microcircuits neuronaux à haut rapport de connectivité, une électrode de recherche n’est pas utilisée. Commencez plutôt par patcher directement un neurone présynaptique en mode cellule entière.Ensuite, à l’aide d’une électrode patch remplie d’une solution interne régulière, un neurone postsynaptique potentiel également en mode cellule entière, les deux cellules doivent être sous le contrôle de la pince de courant. Induire un potentiel d’action dans la cellule présynaptique et surveiller le neurone postsynaptique potentiel pour un potentiel postsynaptique. Si le neurone ne montre pas de réponse à la stimulation présynaptique, utilisez une nouvelle électrode pour patcher à nouveau un nouveau neurone en mode cellule entière.Lorsqu’une connexion est trouvée, procédez à l’enregistrement comme indiqué précédemment sans changer la pipette patch. Après avoir fixé et monté les coupes comme décrit dans le protocole de texte, examinez les neurones marqués à la biotine au microscope optique. Assurez-vous que les bâtons axonaux et les épines dendritiques sont clairement visibles.À l’aide d’un système commercial de traçage des neurones, tracez manuellement les neurones ou les paires de neurones couplés synaptiquement. Assurez-vous d’inclure même de petites garanties axonales ou dendritiques. Utilisez les traces pour obtenir des reconstructions neuronales 3D, corrigez les reconstructions neuronales pour le rétrécissement dans les trois dimensions spatiales dans la section appropriée du programme de traçage.Les facteurs de correction de retrait pour le support d’enrobage sont d’environ 1,1 pour les directions x et y, et d’environ 2,1 pour la direction Z. Une paire de cellules couplées réciproquement composée d’un stellé épineux et d’un neurone à piquement rapide. Dans la couche corticale, quatre ont été remplis de biotine.Pendant l’enregistrement, les points verts indiquent des contacts synaptiques excitateurs présumés entre le neurone épineux pré-synaptique et l’interneurone inter-synaptique. Les points bleus indiquent des contacts synaptiques inhibiteurs réciproques présumés. Des images de haute puissance des contacts synaptiques sont présentées ici.Les cercles ouverts verts montrent les contacts excitateurs et les cercles ouverts bleus montrent les contacts inhibiteurs. Une reconstruction neurolucide de cette paire de cellules réciproquement connectées est présentée ici. L’axone interneuronal est représenté en bleu et son soma et sa dendrite sont représentés en rouge.L’axone des neurones épineux est représenté en vert et son soma et son dite sont en blanc. L’encart montre les compartiments somato dendritiques des neurones pré et post-synaptiques. Avec les contacts synaptiques présumés, les contours du baril ont été identifiés dans les photomicrographies à fond clair de faible puissance réalisées à partir de la tranche de cerveau aiguë.Une connexion synaptique représentative avec un rapport de connectivité très faible est illustrée ici. Un potentiel d’action présynaptique dans une cellule paramétallique de couche six a évoqué un potentiel postsynaptique excitateur monos synaptique dans un neurone paramétallique étoile de couche quatre. La latence montrée ici de plus de trois millisecondes de cette connexion translaminaire est beaucoup plus longue que la latence d’environ une milliseconde observée dans les connexions intralaminaires locales.Deux potentiels d’action à 10 hertz induits dans la cellule paramétallique de couche six ont déclenché des potentiels post-synaptiques dans le neurone paramétallique étoile de couche quatre montré ici. Notez la facilitation à court terme. Il est important de se rappeler que la condition de slashing doit être optimisée pour une connexion synaptique donnée, et que pendant l’enregistrement, la configuration doit être absolument stable et que la compréhension optimale de l’enregistrement est garantie.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont les mesures électrophysiologiques et les reconstructions morphologiques sont utilisées pour obtenir une image globale des propriétés structurelles et fonctionnelles des microcircuits neuronaux dans le néocortex.

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