Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

L’objectif général de l’expérience suivante est de démontrer comment les connexions synaptiques entre des neurones morphologiquement identifiés sont caractérisées à la fois fonctionnellement et structurellement. Ceci est réalisé en obtenant des coupes cérébrales aiguës, qui sont optimisées pour l’étude d’une connexion synaptique particulière. Le clampage par patch est ensuite utilisé pour tester les neurones couplés synaptiquement.

Pour cela, un neurone post-synaptique prospectif individuel est patché, et une deuxième pipette est ensuite utilisée pour stimuler les neurones environnants afin d’établir l’existence d’une connexion synaptique. Si aucune réponse n’est observée, l’électrode de stimulation est déplacée. Une fois qu’une connexion est trouvée, le neurone présynaptique est réapparié en mode gros.

À la suite d’enregistrements électrophysiologiques de ces neurones et de remplissages simultanés de biotine, la tranche est fixée, traitée pour la biotine et des reconstructions 3D assistées par ordinateur des neurones sont effectuées. In fine, notre méthode vise une analyse quantitative structurale et fonctionnelle corrélée des microcircuits neuronaux. Le principal avantage des enregistrements appariés à partir de neurones couplés synaptiquement est que nous pouvons effectuer une analyse structurelle et fonctionnelle corrélée des neurones pré et postsynaptiques dans les microcircuits neuronaux.

Plus récemment encore, les techniques introduites telles que la stimulation optique des neurones ne sont pas en mesure d’y parvenir avec autant de détails. Cette méthode permet d’étudier les interactions d’excitation et d’inhibition de types de neurones morphologiquement identifiés et comment l’activité est modulée. Guan démontrera les procédures d’enregistrement des animaux de compagnie.

Lui qui est postdoc dans mon laboratoire. Après avoir préparé des tranches de la région cible, laissez-les incuber pendant ce temps, tirez sur les pipettes du patch, qui doivent avoir une tige longue et mince. Après avoir fixé une tranche de cerveau avec une harpe en platine dans une chambre expérimentale, remplissez une pipette d’enregistrement avec une solution interne.

Placez la pipette dans le préamplificateur et patchez un neurone post-synaptique putatif en mode cellule entière à l’aide d’une pipette patch de recherche de résistance de huit à 10 méga ohms remplie d’une solution interne dans laquelle les sels de potassium sont remplacés par des sels de sodium. Appliquez une légère aspiration à la pipette de recherche pour patcher un neurone présynaptique potentiel dans une cellule lâche. Configuration ci-jointe.

Maintenez le potentiel de membrane sous le joint lâche entre moins 30 et moins 60 millivolts en mode pince de courant. Ensuite, appliquez de grandes impulsions de courant de 0,2 à deux nanoampères pour susciter un potentiel d’action dans la cellule présynaptique potentielle. Observez ce potentiel d’action comme un petit épilet sur la réponse en tension.

Réglez la fréquence de stimulation à 0,1 hertz pour éviter l’épuisement de la réponse postsynaptique. Si le neurone postsynaptique ne répond pas à la stimulation du patch de neurones potentiellement présynaptiques testé, un nouveau neurone présynaptique potentiel en mode de sceau lâche. Testez ainsi jusqu’à 30 neurones potentiellement présynaptiques.

Continuer à utiliser la même électrode patch de recherche tant qu’un joint avec une résistance supérieure à 30 mégaohms peut être établi. Si la stimulation en mode d’étanchéité lâche entraîne un EPSP ou un IPSP avec une latence inférieure à cinq millisecondes dans le neurone postsynaptique, retirez la pipette de recherche du neurone présynaptique à l’aide d’une électrode d’enregistrement remplie de biotine contenant une solution interne régulière avec une résistance de quatre à huit méga ohms. Patchez le neurone présynaptique et enregistrez en mode de pince de courant de cellule entière.

Susciter des potentiels d’action par injection de courant dans les neurones présynaptiques et enregistrer la réponse postsynaptique. Stockez les données sur un ordinateur pour une analyse ultérieure hors ligne. Tout au long de l’enregistrement, la biotine se diffuse dans le neurone pour obtenir une coloration adéquate.

Laissez la biotine se diffuser pendant au moins 15 à 30 minutes selon la taille du neurone. Pour les microcircuits neuronaux à haut rapport de connectivité, une électrode de recherche n’est pas utilisée. Commencez plutôt par patcher directement un neurone présynaptique en mode cellule entière.

Ensuite, à l’aide d’une électrode patch remplie d’une solution interne régulière, un neurone postsynaptique potentiel également en mode cellule entière, les deux cellules doivent être sous le contrôle de la pince de courant. Induire un potentiel d’action dans la cellule présynaptique et surveiller le neurone postsynaptique potentiel pour un potentiel postsynaptique. Si le neurone ne montre pas de réponse à la stimulation présynaptique, utilisez une nouvelle électrode pour patcher à nouveau un nouveau neurone en mode cellule entière.

Lorsqu’une connexion est trouvée, procédez à l’enregistrement comme indiqué précédemment sans changer la pipette patch. Après avoir fixé et monté les coupes comme décrit dans le protocole de texte, examinez les neurones marqués à la biotine au microscope optique. Assurez-vous que les bâtons axonaux et les épines dendritiques sont clairement visibles.

À l’aide d’un système commercial de traçage des neurones, tracez manuellement les neurones ou les paires de neurones couplés synaptiquement. Assurez-vous d’inclure même de petites garanties axonales ou dendritiques. Utilisez les traces pour obtenir des reconstructions neuronales 3D, corrigez les reconstructions neuronales pour le rétrécissement dans les trois dimensions spatiales dans la section appropriée du programme de traçage.

Les facteurs de correction de retrait pour le support d’enrobage sont d’environ 1,1 pour les directions x et y, et d’environ 2,1 pour la direction Z. Une paire de cellules couplées réciproquement composée d’un stellé épineux et d’un neurone à piquement rapide. Dans la couche corticale, quatre ont été remplis de biotine.

Pendant l’enregistrement, les points verts indiquent des contacts synaptiques excitateurs présumés entre le neurone épineux pré-synaptique et l’interneurone inter-synaptique. Les points bleus indiquent des contacts synaptiques inhibiteurs réciproques présumés. Des images de haute puissance des contacts synaptiques sont présentées ici.

Les cercles ouverts verts montrent les contacts excitateurs et les cercles ouverts bleus montrent les contacts inhibiteurs. Une reconstruction neurolucide de cette paire de cellules réciproquement connectées est présentée ici. L’axone interneuronal est représenté en bleu et son soma et sa dendrite sont représentés en rouge.

L’axone des neurones épineux est représenté en vert et son soma et son dite sont en blanc. L’encart montre les compartiments somato dendritiques des neurones pré et post-synaptiques. Avec les contacts synaptiques présumés, les contours du baril ont été identifiés dans les photomicrographies à fond clair de faible puissance réalisées à partir de la tranche de cerveau aiguë.

Une connexion synaptique représentative avec un rapport de connectivité très faible est illustrée ici. Un potentiel d’action présynaptique dans une cellule paramétallique de couche six a évoqué un potentiel postsynaptique excitateur monos synaptique dans un neurone paramétallique étoile de couche quatre. La latence montrée ici de plus de trois millisecondes de cette connexion translaminaire est beaucoup plus longue que la latence d’environ une milliseconde observée dans les connexions intralaminaires locales.

Deux potentiels d’action à 10 hertz induits dans la cellule paramétallique de couche six ont déclenché des potentiels post-synaptiques dans le neurone paramétallique étoile de couche quatre montré ici. Notez la facilitation à court terme. Il est important de se rappeler que la condition de slashing doit être optimisée pour une connexion synaptique donnée, et que pendant l’enregistrement, la configuration doit être absolument stable et que la compréhension optimale de l’enregistrement est garantie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont les mesures électrophysiologiques et les reconstructions morphologiques sont utilisées pour obtenir une image globale des propriétés structurelles et fonctionnelles des microcircuits neuronaux dans le néocortex.